CN110564835A - 南蛇藤提取物含药血清对hbv和mif作用的研究方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法。该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程。本发明明确南蛇藤素对人类乙型肝炎的药用价值，为突破乙型肝炎奠定基础。明确给药后人BMSCs中HBsAg、HBeAg、HBcAg、MIF的量的变化趋势、HBVcccDNA的表达水平及MIF基因表达情况，为下一步探究南蛇藤素的作用机制提供数据支持。

Description

南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法
技术领域
本发明涉及一种南蛇藤提取物的研究方法，具体为南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法。
背景技术
乙型肝炎病毒，简称HBV,感染人体后导致乙型病毒性肝炎（hepatitis B），是我国传染病死亡的重要原因之一，常伴有肝硬化、肝癌等并发症，病死率高。研究认为，乙型病毒性肝炎与机体免疫应答异常、细胞因子网络活化密切相关。现阶段治疗多以药物抑制HBV的复制和数量的治疗方法为主。
巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种重要的前炎症因子，主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其粘附、吞噬作用，还能促进多种炎症细胞因子的生成。MIF 的广泛参与炎症反应和肿瘤生成等，研究表明MIF在乙型肝炎发病机制中起重要作用。
南蛇藤素有抗发炎作用，早在清代吴其濬撰写的《植物名实图考》中，就有过“行血气。治无名肿毒”的记载。现研究表明，南蛇藤素在原代肝细胞水平能够抑制HBV-DNA 的复制，还可以有效地抑制HBsAg 的表达。
本实验通过南蛇藤提取物作用于感染了HBV 的人BMSCs，通过观察加入南蛇藤素前后MIF 表达能力的差异，探究南蛇藤素对乙肝治疗的作用。通过该实验，理论上能够进一步提高对南蛇藤素治疗价值的认识水平，为乙肝的相关影响因素提供新的实验依据，临床上能为乙肝的诊治提供新的治疗思路从而更好的辅助乙肝的治疗。
乙型肝炎病毒，缩写为HBV，是双链DNA 病毒1，属Orthohepadnavirus2，为Hepadnaviridae 病毒家族的成员。感染人体后导致乙型病毒性肝炎（hepatitis B），简称乙肝，是由乙型肝炎病毒感染后，引起的肝脏急性或慢性发炎之疾病。乙肝病毒传染途经为接触到受感染的体液，特别由血液感染占最大宗4。据估计，全球每三人当中，就会有一个人曾经被乙型肝炎病毒感染，而其中约有2.4亿至3.5亿人会转变成慢性肝炎。乙型肝炎与肺结核、血吸虫病和艾滋病并列为中国四大传染病。
南蛇藤素：南蛇藤素(celastrol) 为一种醌甲基化三萜化合物(quinonemethidetriterpene)7，其醌甲基化的结构可与半胱胺酸残基(residues) 的硫基反应，形成共价蛋白键结物，又称为雷公藤三萜醇或雷公藤红素，也是雷公藤根部的药理活性成份之一。南蛇藤素具有抗发炎、抗癌、缓解自体免疫疾病(如：类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮)、及调节蛋白质平衡(proteostasis) 疾病的作用9。现研究表明，南蛇藤素在原代肝细胞水平能
够抑制HBV-DNA 的复制，还可以有效地抑制HBsAg 的表达。
国内外研究现状，目前国内外对于HBV 的研究愈发深入，特别是对母婴传播的疫苗预防，已经成为每个国家计划免疫的基础与重点。但对于已发病患者，由于现阶段仍没有一种药物直接针对HBV 的cccDNA，易导致乙肝复发。目前仍无法有效治愈乙型肝炎。世卫组织建议使用替诺福韦或恩替卡韦进行口服治疗，是目前抑制乙型肝炎病毒的最有效药物。巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor MIF），也被称为糖基化抑制因子（GIF）。是在人中由MIF 基因编码的蛋白质10.11。MIF 是先天免疫的重要调
节因子。细菌抗原刺激白细胞将MIF 释放到血液中12。MIF 结合于CD74上的免疫细胞触发急性免疫反应。因此，MIF 被分类为炎性细胞因子13。此外，糖皮质激素还刺激白细胞释放MIF，因此MIF 部分抵消糖皮质激素对免疫系统的抑制作用。Richard Bucala 与Jürgen Bernhagen 在其著作MIF Family Cytokines in Innate Immunity andHomeostasis 中阐述，“在慢性乙型肝炎中，MIF 血清水平升高15。基因流行病学研究显示，MIF-173G/C 多态性与中国1161例慢性乙肝患病风险的增加有关。” KiminoriKimura 在Clin Vaccine Immunol 指出，抗小鼠MIF 抗体注入乙型肝炎病毒转基因小鼠后，减少了肝损伤和及浸润到肝脏的炎症细胞17。同时，研究发现，MIF 的高水平表达可能与乙型肝炎的慢性化以及肝功能衰竭的发生有关18。综上表明，MIF 水平的降低，可以在一定程度上反映乙型肝炎得到缓解甚至抑制。但迄今为止，国内外研究文献中均指出，MIF表达与乙肝的相互关系尚不够清晰，仍需要大量的研究样本以确保统计学意义。因此，本实验中采用检测MIF 中表达mRNA 来进一步验证其在乙肝表达水平的意义。近年来的研究发现南蛇藤素具有抗癌、抗炎、抑制脉管生成等作用，并在乙肝治疗中表现出极大潜力。
具有抗癌活性，并降低活体外膀胱肿瘤的生长19。2012年，Rajendran 等人首次推论南蛇藤素能藉由抑制活体内外HCC 之STAT3的讯息传递而达到抗细胞增殖并诱导凋亡的作用。
抗发炎作用， Cascão 等人利用THP-1巨噬细胞样细胞株筛选了2320种抑制IL-1β与TNF 分泌的化合物，而南蛇藤素即为其中之一。Cascão 等人由上述结果得到推论：南蛇藤素具有明显抗发炎与抗增殖活性，并有潜力发展成为治疗与免疫有关发炎疾病(例如类风湿性关节炎RA) 的抗发炎药物21。
对血管新生及脉管形成的抑制作用，体外实验结果显示南蛇藤素能减少BM-EPCs中VEGF 的分泌，抑制VEGF 诱发的细胞存活力、细胞与细胞聚集黏附、细胞与细胞外基质黏附以及BM-EPCs 的迁徙反应与血管脉管的形成22。
K.Noel Masihi 博士在其著作Immunotherapy of Infections 中介绍了其对HBV的影响，指出了用南蛇藤素衍生物中提取的多糖（PUP）针对HBV 的治疗的可能性。但其仅通过说明试验者状况及显示阴性比例来阐述治疗效果，未能深入至作用机制。2014年，WeiWei 等人在Oncotarget 指出，新的celastrol 衍生物抑制肝细胞癌患者来源的异种移植物的生长23，提示了南蛇藤素在肝细胞作用的新方向。近年来提出的一种以宿主细胞蛋白为靶位的新的抗病毒策略：通过改变参与病毒生活史的相关宿主细胞蛋白，达到抑制病毒复制、减少病毒耐药的目的24。细胞内蛋白质的选择性降解主要由泛素蛋白酶体途径调控25，最新研究发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米在HBV 转基因小鼠体内和原代肝细胞水平均具有抗HBV 效果26.27，为进一步探索蛋白酶体抑制剂对HBV 是否具有普遍抑制作用，国内研究人员采用HBV 转基因小鼠原代肝细胞作为细胞模型，指出了南蛇藤素对HBV 转基因小鼠原代肝细胞的抑制作用，为HBV 的治疗提供了新的思路方法；结果显示南蛇藤素对原代肝细胞中HBsAg 和HBV-DNA 有显著抑制作用(P<0.05)；随着南蛇藤素浓度的增加，对HBsAg和HBV—DNA 的抑制作用增强。结论：南蛇藤素在原代肝细
胞水平不仅能够抑制HBV-DNA 的复制，而且可以有效的抑制HBsAg 的表达。
在构建乙肝病毒体外感染的过程中，早期的研究常常选用HepG2细胞系来进行感染培养，HepG2细胞系具有可连续传代、易获得等优势，但因蛋白酶体抑制剂具有抑制肿瘤细胞生长，有促进肿瘤细胞凋亡的作用28，且HepG2细胞系具有恶性细胞的特点，不能完全反应正常细胞的特点和功能、转染的HBV 复制过程不同于正常的自然感染，因此选HepG2细胞系作为实验研究的细胞模型有一定局限性。之后的研究中将细胞模型替换为人或小鼠的原代肝细胞，具有完全模拟肝组织的优点，但其来源及其有限，培养困难，体外不能传代扩增，短暂的培养期就会丧失细胞形态、功能和对病毒的敏感性，并且细胞来源存在着伦理学争议，因此不予考虑。近年来，通过人骨髓间充质干细胞（BMSCs）29诱导生成肝细胞模拟体外模型的技术逐渐兴起30，人BMSCs 体外可无限增殖，细胞行为学稳定，在多次重复感染过后仍可保持易感性，能够稳定的表达HBV 多种抗原，支持HBV 的天然复制表达过程，通过cccDNA 产生子代病毒31.32，且取材容易，不受伦理学限制33。综上所述，关于南蛇藤素对于HBV 的作用假设已初现端倪，但南蛇藤素对于人感染的HBV 细胞的影响还未有研究定论，作用机制中的信号通路等还未明确，值得我们研究
探索。因此，我们做出以下假设：南蛇藤提取物对感染人BMSCs 的HBV 具有抑制作用，并通过观察MIF 的表达水平降低进行对照验证。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种。
技术方案：南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法，其特征在于，该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程；
所述的南蛇藤提取物含药血清的制备过程包括以下步骤：
步骤一，将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干15kg，用浓度95%乙醇150L提取3小时，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏900g加水分散后，石油醚萃取3 次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，水洗涤3 次，减压浓缩，真空冻干，得南蛇藤茎乙酸乙酯提取物250g，贮存于4℃。每1g 提取物相当于60g 生药，使用前以含0.5%羧甲基纤维素钠的蒸馏水助悬，
步骤二，取新西兰白兔16 只，随机分成药物组及溶媒对照组，灌药前禁食4h，自由饮水；药物组给予南蛇藤提取物20mg/kg·d每天分2次给药，共4天，第4天1次给药，2小时后无菌条件下心室采血， 3000/L 离心10分钟，共3 次，56℃,30 min 灭活，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，1.5 mL EP 管分装，于-20℃保存备用；
所述的人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化的过程按顺序包括：
人BMSCs 的分离、培养过程，人BMSCs 的换液过程，人BMSCs 的传代过程，人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，
所述人BMSCs 的分离、培养过程包括以下步骤：
步骤一，于髂后上嵴抽取红骨髓2mL，加入100μ/mL 肝素0.5 mL 抗凝，无菌操作台内以2-3 mL PBS 缓冲液稀释，
步骤二，将稀释液按1：1 比例缓慢移入装有人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque 的离心管中，
使其分层明显，2000rpm，离心20min。
步骤三，收集位于界面层呈云雾状的有核细胞层，PBS 洗涤，1800rpm，离心15min。
步骤四，弃上清，PBS 重复洗涤两次。
步骤五，弃上清，用完全培养液悬浮，以1×105/cm3 的密度接种于培养瓶，置于37℃，
50mL/L CO2 及饱和湿度条件下培养，标记为原代，即P0，
步骤六，视细胞生长情况48 小时首次更换培养基。
所述人BMSCs 的换液过程包括以下步骤：
步骤一，培养人BMSCs 采用含10% V/V胎牛血清的LG-DMEM 完全培养基，根据细胞生长状态，每3-4 天左右更换一次培养基，
步骤二，换液时，先用巴斯德吸管柔和吹细胞面，把衰老的细胞吹下来，弃用旧培养基，加入3-5mL 新的培养基，置于37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，
所述人BMSCs 的传代过程，包括以下步骤：
步骤一，显微镜下观察人BMSCs 生长状态，当细胞长到80%-90%融合时，需要进行消化、传代，
步骤二，轻晃培养瓶，弃去旧的细胞培养基，用5mL PBS 洗涤细胞两次，以去除血清残留，
步骤三，每瓶加入1 mL 0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA 消化液，在37℃消化不超过分钟，在纤维镜下控制消化时间，细胞突起收缩变形即可终止，
步骤四，弃上清，加入3mL 完全培养基或胎牛血清终止胰蛋白酶作用，
步骤五，弃上清，用PBS 清洗细胞2 遍，加入新的完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞脱落形成单细胞悬液，
步骤六，根据细胞数量的多少按1:3 或更高比例接种于新的培养瓶，接种密度为1.0-2.0×103/cm3,置37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，
所述人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs,进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单
细胞悬液，细胞计数板计数。
步骤二，将人BMSCs 以1×104/cm2 的密度接种于24 孔培养板中，使各孔中准确接种相同数量的细胞，
步骤三，从接种后第2 天起每日的相同时点，分别计数3 个孔中的细胞总数，连续计数到第8 天，
步骤四，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，
步骤五， Patterson 公式计算细胞在对数生长期倍增时间，即Td =Tlg2/lg(Nt/No)，Td：倍增时间，小时；T:细胞由No 增至Nt 时所用的时间，小时；N:细胞数，
所述流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs 进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，不少于106，
步骤二， PBS 洗涤，800rpm，离心6min，2 次，
步骤三，弃上清，轻敲离心管使细胞适当分散，缓慢滴加1mL -20℃预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时，
步骤四， 800rpm，离心6min，去除乙醇固定液，PBS 洗2 次，
步骤五，用0.5 mL 重悬细胞并转至Tube 中轻轻吹打，防止细胞破碎，
步骤六，加RNase-A 约3μL 至终浓度约为50μg/ mL,37℃水浴消化30min，
步骤七，加PI 约400μL 至终浓度约为65μg/ mL，37℃避光染色30min，
步骤八，用300 目，孔径40-50 微米，尼龙网过滤，上机检测。
所述流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs，胰蛋白酶溶液消化，PBS 重悬成单细胞悬液，计数，根据需要用台盼蓝进行细胞活性检测，
步骤二， 1000rpm,离心10min。用适量的PBS 缓冲液重悬细胞为1×106 个/mL，
步骤三，移入流式管，加入不同一抗，轻轻混匀。不同抗体均设对应的IgG 同型对照，
步骤四，避光室温孵育30 分钟，
步骤五，加入缓冲液重复洗涤2 次，重悬细胞后上流式仪检测，
步骤六，根据同型对照的突光强度设定阴性细胞群阈值，观察每一种单抗的阳性细胞表达率及荧光强度；
所述乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程按顺序包括：感染血清的准备过程， HBV 病毒感染人BMSCs的过程， HBV 感染后的人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 细胞周期的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程， HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程，地高辛，即digoxigenin，DIG，标记全长DNA探针过程，DNA 印记，即Southern blotting，检测感染HBV 后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA过程，电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程，间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程，特异性抗体阻断实验的过程，
所述感染血清的准备过程包括以下步骤：
取同时满足下列三项指标的患者乙肝患者血清,采集后超净工作台内0.22 微米滤器过滤除菌，分装，-80℃储存备用；
条件一， HBsAg(+),Anti-HBsAg(-),HBeAg(+),Anti-HBeAg(-),HBcAg-Ab-IgG(+)
条件二， HBV DNA:5.4×108copies/mL
条件三，患者之前未接受抗病毒治疗，HCV(-),HIV(-)
所述HBV 病毒感染人BMSCs的过程包括以下步骤：
步骤一，处于对数生长期的第5 代人BMSCs，在超净工作台里吸净完全培养基，更换无血清无抗生素的LG-DMEM 培养基，37℃，50mL/CO2 条件下培养24 小时，
步骤二，取出细胞，吸净LG-DMEM 培养基，更换含10% (V/V)的感染血清的双无，即无FCS、无抗生素，培养基在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时，
步骤三，吸净含有病毒血清的培养基，为免除感染血清对实验结果的干扰，PBS 冲洗细胞6 次，收集最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，
步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃、50mL/CO2 的培养箱中继续培养。此时开始计算为0 天，
所述HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程包括以下步骤
步骤一，从感染后第1 天起，每天用胰蛋白酶溶液消化、收集人BMSCs，PBS 洗涤细胞5次，弃上清，细胞沉淀用100μL PBS 重悬，
步骤二，用微量样品基因组DNA 提取试剂盒，即TIANamp Micro DNA Kit，提取感染后各天的人BMSCs 的细胞基因组DNA,所有样品使用前平衡至15℃-25℃的室温下，提取过程按试剂盒说明书进行，
所述 HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程包括以下步骤：
HBV 感染人BMSCs 后，视细胞生长情况给予换液或传代处理，每天收集人BMSCs培养上清液，1000rpm，离心10min，去除沉淀，将上清分装到灭菌管EP 管中，标记后-20℃保存备用，样本注意避免反复冻融，不超过3 次，
所述HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程包括以下步骤：
培养上清液-20℃取出后融化，按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明进行。
所述 HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程包括以下步骤：
荧光定量PCR检测感染后人BMSCs 细胞内合成与分泌至培养上清中的HBV DNA 的含量，具体可按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明书及Light Cycler II 型核酸扩增荧光检测仪操作流程进行检测，
所述地高辛（digoxigenin，DIG）标记全长DNA探针过程包括以下步骤：
制作全长的HBV DNA 探针，标记按照标记检测试剂盒说明进行，
所述DNA印记，即Southern blotting，检测感染HBV后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA的过程包括以下步骤：
收集HBV 感染后的第2、4、6、8 天的人BMSCs 基因组DNA 并纯化cccDNA，Southernblotting 检测HBV 感染后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA，
所述电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程包括以下步骤：
检测前-20℃取出待测样品于室温下融化，按Roche 公司的HBsAg、HBeAg 定量检测试剂盒说明书及Elecsys2016 全自动电化学发光免疫分析仪的操作流程进行检测，
所述间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程包括以下步骤：
从感染后第1 天起，每天收集细胞的同时留一孔细胞，用间接免疫荧法检测人BMSCs是否表达HBcAg，
所述特异性抗体阻断实验过程包括以下步骤：
步骤一，将含10%的感染血清的双无培养基加入不同稀释度的抗HBsAg 的特异性抗体，37℃作用2h，
步骤二，接种人BMSCs，同期设细胞抗原对照组，即含10%的感染血清的双无培养基接种人BMSCs，在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时。
步骤三，PBS 洗涤6 次，最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，
步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃，50mL/CO2 的培养箱中继续培养，
步骤五， 72h 后收集人的BMSCs 培养上清，用电化学发光法检测HBsAg，检测方法同前面，
步骤六，计算阻断率。阻断率=(（细胞抗原对照组-细胞抗原实验组）/细胞抗原对照组)×100%；
所述南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程包括以下步骤：
步骤一，设立低、中、高含药血清组，含药血清在培养体系中的体积比分别为10% ，20%和30%，同时设阴性对照组以及5-Fu 阳性对照组，终浓度为10 mg/L ，
步骤二，取24 孔培养板，将对数生长期上述感染了HBV 的人BMSCs 细胞密度调整至1×104 个/孔，按需加入各组药物，每组设立6 个复孔，同时设置调零孔；
所述结果检测的过程按顺序包括：
检测感染HBV 后的人BMSCs 合成HBV cccDNA 的水平过程，检测感染HBV 后的人BMSCs培养上清中HBsAg、HBeAg 和HBcAg 的变化过程，检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程，检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，
所述检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程包括以下步骤，步骤一，氯仿－异丙醇法抽提总mRNA，用752紫外光栅分光光度计测定样本的总RNA
纯度及浓度后样本保存于-80℃冰箱备用。按照逆转录试剂盒说明书操作步骤，合成第1链
cDNA后冻存于-20℃中备用。
步骤二，使用SYBR Green I 荧光染料法在384 孔ABI Prism 7900 序列检测系统，即Applied Biosystems，CA，上荧光实时定量PCR 扩增，分析MIF 基因表达。为控制不同样本间的基因表达差异，用管家基因3－磷酸甘油醛脱氢酶，即glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH，作为内对照基因，来标化目的基因的表达，以GAPDH 作为内对照基因，计算MIF 基因mRNA 相对定量即2－△△CT，每个样本的MIF 基因和内对照GAPDH 基因均重复3 次。荧光实时定量PCR 扩增体系共10μL：SYBR Green IPCR Mastermix5 μL，上、下游Primer 计0.8μL，RNase-free H2O 3.2μL，
cDNA 模板1μL。荧光实时定量PCR用2步法，扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃ 1min、72℃1 min、40 个循环。采用比较循环数，即cycle threshold，CT，的方法相对定量，荧光定量PCR 的结果以CT 值显示，CT 值为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。△CT 值＝单样本平均目标基因CT 值-单样本平均GAPDH 基因CT 值，以2－△△CT 代表目的基因的表达水平，每个样本的△△CT＝每个样本的平均△CT -对照组的平均△CT，来计算表达差异的倍数。每次实验重复3 次，
所述检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，包括以下步骤：
冰上提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白质含量；用5X蛋白，将总蛋白配置成含1XLB的蛋白上样液，在100℃的block 中煮沸5 min，室温下冷却后冻存于-80℃备用。配置12％的SDS-PAGE 凝胶，用湿转法将蛋白电转到PVDF
膜上；5％脱脂奶粉常温封闭1h；加入MIF、GAPDH 一抗，即1∶2000，1：5000，
在4℃冰箱中孵育过夜，TBST 漂洗10 min×3 次，加入二抗，即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 小时，TBST 漂洗10 min×3 次，混均ECL 显影液后在Fujilas3000显影仪中将免疫复合物显影，用计算机图像分析系统软件IMAGE J 分析测定MIF 及内参照GAPDH，比较MIF的积分光密度比值；
所述的统计学分析过程包括以下步骤：
应用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。数据用（x ± s）表示，采用独立样本 t 检验比较不同处理组与对照组间的差异；采用one-way ANOVA 方差分析方法，以不同处理方式做为组间因素，比较不同处理对 MIF 表达趋势的影响，检验水准ɑ＝0.05，双侧检验。
本发明，与现有技术相比具有以下优点：
本研究方法通过南蛇藤素提取物作用于感染了 HBV 的人 BMSCs，通过观察加入南蛇藤素前后 MIF 表达能力的差异，探究南蛇藤素对乙肝治疗的作用具有一定的可行性。技术可行：本实验所用到的如流式细胞术检测、FG-PCR、DIG 标记探针、DNA印记、间接免疫荧光法、SPSS 17.0 软件进行统计分析等技术都是较为成熟且可靠的现代研究方法。此外人BMSCs 分离纯化易于进行，所需试剂原料均常见且易于购买，有关南蛇藤素对于人肝细胞的作用影响在国内外研究中有一些初步研究，但仍不明确，本次实验创新地将之前科研人员对南蛇藤素对小鼠等其他对象的研究进行系统性的归纳总结，根据其作用大胆假设南蛇藤素对人肝细胞的作用影响。人 BMSCs 支持 HBV 天然的复制表达过程，对 HBV 自然感染敏感。.本次实验采用人 BMSCs 作为细胞模型也克服了原代肝细胞体外不易培养、不能传代的缺点。
HBV 感染人 BMSCs 体系的建立以及对 MIF 表达水平的研究，为 HBV 致病机制的初步探索以及 HBV 慢性感染的预防、诊断、治疗等奠定了基础。明确南蛇藤素对人类乙型肝炎的药用价值，为突破乙型肝炎奠定基础。明确给药后人 BMSCs 中 HBsAg、HBeAg、HBcAg、MIF 的量的变化趋势、HBVcccDNA 的表达水平及 MIF 基因表达情况，为下一步探究南蛇藤素的作用机制提供数据支持。
附图说明
图1是本发明提取南蛇藤含药血清的过程图；
图2是本发明南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法过程图。
具体实施方式
该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程；
所述的南蛇藤提取物含药血清的制备过程包括以下步骤：
步骤一，将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干15kg，用浓度95%乙醇150L提取3小时，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏900g加水分散后，石油醚萃取3 次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，水洗涤3 次，减压浓缩，真空冻干，得南蛇藤茎乙酸乙酯提取物250g，贮存于4℃。每1g 提取物相当于60g 生药，使用前以含0.5%羧甲基纤维素钠的蒸馏水助悬，
步骤二，取新西兰白兔16 只，随机分成药物组及溶媒对照组，灌药前禁食4h，自由饮水；药物组给予南蛇藤提取物20mg/kg·d每天分2次给药，共4天，第4天1次给药，2小时后无菌条件下心室采血， 3000/L 离心10分钟，共3 次，56℃,30 min 灭活，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，1.5 mL EP 管分装，于-20℃保存备用；
所述的人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化的过程按顺序包括：
人BMSCs 的分离、培养过程，人BMSCs 的换液过程，人BMSCs 的传代过程，人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，
所述人BMSCs 的分离、培养过程包括以下步骤：
步骤一，于髂后上嵴抽取红骨髓2mL，加入100μ/mL 肝素0.5 mL 抗凝，无菌操作台内以2-3 mL PBS 缓冲液稀释，
步骤二，将稀释液按1：1 比例缓慢移入装有人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque 的离心管中，
使其分层明显，2000rpm，离心20min。
步骤三，收集位于界面层呈云雾状的有核细胞层，PBS 洗涤，1800rpm，离心15min。
步骤四，弃上清，PBS 重复洗涤两次。
步骤五，弃上清，用完全培养液悬浮，以1×105/cm3 的密度接种于培养瓶，置于37℃，
50mL/L CO2 及饱和湿度条件下培养，标记为原代，即P0，
步骤六，视细胞生长情况48 小时首次更换培养基。
所述人BMSCs 的换液过程包括以下步骤：
步骤一，培养人BMSCs 采用含10% V/V胎牛血清的LG-DMEM 完全培养基，根据细胞生长状态，每3-4 天左右更换一次培养基，
步骤二，换液时，先用巴斯德吸管柔和吹细胞面，把衰老的细胞吹下来，弃用旧培养基，加入3-5mL 新的培养基，置于37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，
所述人BMSCs 的传代过程，包括以下步骤：
步骤一，显微镜下观察人BMSCs 生长状态，当细胞长到80%-90%融合时，需要进行消化、传代，
步骤二，轻晃培养瓶，弃去旧的细胞培养基，用5mL PBS 洗涤细胞两次，以去除血清残留，
步骤三，每瓶加入1 mL 0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA 消化液，在37℃消化不超过分钟，在纤维镜下控制消化时间，细胞突起收缩变形即可终止，
步骤四，弃上清，加入3mL 完全培养基或胎牛血清终止胰蛋白酶作用，
步骤五，弃上清，用PBS 清洗细胞2 遍，加入新的完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞脱落形成单细胞悬液，
步骤六，根据细胞数量的多少按1:3 或更高比例接种于新的培养瓶，接种密度为1.0-2.0×103/cm3,置37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，
所述人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs,进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单
细胞悬液，细胞计数板计数。
步骤二，将人BMSCs 以1×104/cm2 的密度接种于24 孔培养板中，使各孔中准确接种相同数量的细胞，
步骤三，从接种后第2 天起每日的相同时点，分别计数3 个孔中的细胞总数，连续计数到第8 天，
步骤四，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，
步骤五， Patterson 公式计算细胞在对数生长期倍增时间，即Td =Tlg2/lg(Nt/No)，Td：倍增时间，小时；T:细胞由No 增至Nt 时所用的时间，小时；N:细胞数，
所述流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs 进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，不少于106，
步骤二， PBS 洗涤，800rpm，离心6min，2 次，
步骤三，弃上清，轻敲离心管使细胞适当分散，缓慢滴加1mL -20℃预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时，
步骤四， 800rpm，离心6min，去除乙醇固定液，PBS 洗2 次，
步骤五，用0.5 mL 重悬细胞并转至Tube 中轻轻吹打，防止细胞破碎，
步骤六，加RNase-A 约3μL 至终浓度约为50μg/ mL,37℃水浴消化30min，
步骤七，加PI 约400μL 至终浓度约为65μg/ mL，37℃避光染色30min，
步骤八，用300 目，孔径40-50 微米，尼龙网过滤，上机检测。
所述流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs，胰蛋白酶溶液消化，PBS 重悬成单细胞悬液，计数，根据需要用台盼蓝进行细胞活性检测，
步骤二， 1000rpm,离心10min。用适量的PBS 缓冲液重悬细胞为1×106 个/mL，
步骤三，移入流式管，加入不同一抗，轻轻混匀。不同抗体均设对应的IgG 同型对照，
步骤四，避光室温孵育30 分钟，
步骤五，加入缓冲液重复洗涤2 次，重悬细胞后上流式仪检测，
步骤六，根据同型对照的突光强度设定阴性细胞群阈值，观察每一种单抗的阳性细胞表达率及荧光强度；
所述乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程按顺序包括：感染血清的准备过程， HBV 病毒感染人BMSCs的过程， HBV 感染后的人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 细胞周期的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程， HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程，地高辛，即digoxigenin，DIG，标记全长DNA探针过程，DNA 印记，即Southern blotting，检测感染HBV 后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA过程，电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程，间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程，特异性抗体阻断实验的过程，
所述感染血清的准备过程包括以下步骤：
取同时满足下列三项指标的患者乙肝患者血清,采集后超净工作台内0.22 微米滤器过滤除菌，分装，-80℃储存备用；
条件一， HBsAg(+),Anti-HBsAg(-),HBeAg(+),Anti-HBeAg(-),HBcAg-Ab-IgG(+)
条件二， HBV DNA:5.4×108copies/mL
条件三，患者之前未接受抗病毒治疗，HCV(-),HIV(-)
所述HBV 病毒感染人BMSCs的过程包括以下步骤：
步骤一，处于对数生长期的第5 代人BMSCs，在超净工作台里吸净完全培养基，更换无血清无抗生素的LG-DMEM 培养基，37℃，50mL/CO2 条件下培养24 小时，
步骤二，取出细胞，吸净LG-DMEM 培养基，更换含10% (V/V)的感染血清的双无，即无FCS、无抗生素，培养基在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时，
步骤三，吸净含有病毒血清的培养基，为免除感染血清对实验结果的干扰，PBS 冲洗细胞6 次，收集最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，
步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃、50mL/CO2 的培养箱中继续培养。此时开始计算为0 天，
所述HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程包括以下步骤
步骤一，从感染后第1 天起，每天用胰蛋白酶溶液消化、收集人BMSCs，PBS 洗涤细胞5次，弃上清，细胞沉淀用100μL PBS 重悬，
步骤二，用微量样品基因组DNA 提取试剂盒，即TIANamp Micro DNA Kit，提取感染后各天的人BMSCs 的细胞基因组DNA,所有样品使用前平衡至15℃-25℃的室温下，提取过程按试剂盒说明书进行，
所述 HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程包括以下步骤：
HBV 感染人BMSCs 后，视细胞生长情况给予换液或传代处理，每天收集人BMSCs培养上清液，1000rpm，离心10min，去除沉淀，将上清分装到灭菌管EP 管中，标记后-20℃保存备用，样本注意避免反复冻融，不超过3 次，
所述HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程包括以下步骤：
培养上清液-20℃取出后融化，按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明进行。
所述 HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程包括以下步骤：
荧光定量PCR检测感染后人BMSCs 细胞内合成与分泌至培养上清中的HBV DNA 的含量，具体可按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明书及Light Cycler II 型核酸扩增荧光检测仪操作流程进行检测，
所述地高辛（digoxigenin，DIG）标记全长DNA探针过程包括以下步骤：
制作全长的HBV DNA 探针，标记按照标记检测试剂盒说明进行，
所述DNA印记，即Southern blotting，检测感染HBV后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA的过程包括以下步骤：
收集HBV 感染后的第2、4、6、8 天的人BMSCs 基因组DNA 并纯化cccDNA，Southernblotting 检测HBV 感染后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA，
所述电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程包括以下步骤：
检测前-20℃取出待测样品于室温下融化，按Roche 公司的HBsAg、HBeAg 定量检测试剂盒说明书及Elecsys2016 全自动电化学发光免疫分析仪的操作流程进行检测，
所述间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程包括以下步骤：
从感染后第1 天起，每天收集细胞的同时留一孔细胞，用间接免疫荧法检测人BMSCs是否表达HBcAg，
所述特异性抗体阻断实验过程包括以下步骤：
步骤一，将含10%的感染血清的双无培养基加入不同稀释度的抗HBsAg 的特异性抗体，37℃作用2h，
步骤二，接种人BMSCs，同期设细胞抗原对照组，即含10%的感染血清的双无培养基接种人BMSCs，在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时。
步骤三，PBS 洗涤6 次，最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，
步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃，50mL/CO2 的培养箱中继续培养，
步骤五， 72h 后收集人的BMSCs 培养上清，用电化学发光法检测HBsAg，检测方法同前面，
步骤六，计算阻断率。阻断率=(（细胞抗原对照组-细胞抗原实验组）/细胞抗原对照组)×100%；
所述南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程包括以下步骤：
步骤一，设立低、中、高含药血清组，含药血清在培养体系中的体积比分别为10% ，20%和30%，同时设阴性对照组以及5-Fu 阳性对照组，终浓度为10 mg/L ，
步骤二，取24 孔培养板，将对数生长期上述感染了HBV 的人BMSCs 细胞密度调整至1×104 个/孔，按需加入各组药物，每组设立6 个复孔，同时设置调零孔；
所述结果检测的过程按顺序包括：
检测感染HBV 后的人BMSCs 合成HBV cccDNA 的水平过程，检测感染HBV 后的人BMSCs培养上清中HBsAg、HBeAg 和HBcAg 的变化过程，检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程，检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，
所述检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程包括以下步骤，步骤一，氯仿－异丙醇法抽提总mRNA，用752紫外光栅分光光度计测定样本的总RNA
纯度及浓度后样本保存于-80℃冰箱备用。按照逆转录试剂盒说明书操作步骤，合成第1链
cDNA后冻存于-20℃中备用。
步骤二，使用SYBR Green I 荧光染料法在384 孔ABI Prism 7900 序列检测系统，即Applied Biosystems，CA，上荧光实时定量PCR 扩增，分析MIF 基因表达。为控制不同样本间的基因表达差异，用管家基因3－磷酸甘油醛脱氢酶，即glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH，作为内对照基因，来标化目的基因的表达，以GAPDH 作为内对照基因，计算MIF 基因mRNA 相对定量即2－△△CT，每个样本的MIF 基因和内对照GAPDH 基因均重复3 次。荧光实时定量PCR 扩增体系共10μL：SYBR Green IPCR Mastermix5 μL，上、下游Primer 计0.8μL，RNase-free H2O 3.2μL，
cDNA 模板1μL。荧光实时定量PCR用2步法，扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃ 1min、72℃1 min、40 个循环。采用比较循环数，即cycle threshold，CT，的方法相对定量，荧光定量PCR 的结果以CT 值显示，CT 值为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。△CT 值＝单样本平均目标基因CT 值-单样本平均GAPDH 基因CT 值，以2－△△CT 代表目的基因的表达水平，每个样本的△△CT＝每个样本的平均△CT -对照组的平均△CT，来计算表达差异的倍数。每次实验重复3 次，
所述检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，包括以下步骤：
冰上提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白质含量；用5X蛋白，将总蛋白配置成含1XLB的蛋白上样液，在100℃的block 中煮沸5 min，室温下冷却后冻存于-80℃备用。配置12％的SDS-PAGE 凝胶，用湿转法将蛋白电转到PVDF
膜上；5％脱脂奶粉常温封闭1h；加入MIF、GAPDH 一抗，即1∶2000，1：5000，
在4℃冰箱中孵育过夜，TBST 漂洗10 min×3 次，加入二抗，即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 小时，TBST 漂洗10 min×3 次，混均ECL 显影液后在Fujilas3000显影仪中将免疫复合物显影，用计算机图像分析系统软件IMAGE J 分析测定MIF 及内参照GAPDH，比较MIF的积分光密度比值；
所述的统计学分析过程包括以下步骤：
应用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。数据用（x ± s）表示，采用独立样本 t 检验比较不同处理组与对照组间的差异；采用 one-way ANOVA 方差分析方法，以不同处理方式做为组间因素，比较不同处理对 MIF 表达趋势的影响，检验水准ɑ＝0.05，双侧检验。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (1)

1. 南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法，其特征在于，该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程；
所述的南蛇藤提取物含药血清的制备过程包括以下步骤：
步骤一，将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干15kg，用浓度95%乙醇150L提取3小时，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏900g加水分散后，石油醚萃取3 次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，水洗涤3 次，减压浓缩，真空冻干，得南蛇藤茎乙酸乙酯提取物250g，贮存于4℃ ，每1g 提取物相当于60g 生药，使用前以含0.5%羧甲基纤维素钠的蒸馏水助悬，
步骤二，取新西兰白兔16 只，随机分成药物组及溶媒对照组，灌药前禁食4h，自由饮水；药物组给予南蛇藤提取物20mg/kg·d每天分2次给药，共4天，第4天1次给药，2小时后无菌条件下心室采血， 3000/L 离心10分钟，共3 次，56℃,30 min 灭活，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，1.5 mL EP 管分装，于-20℃保存备用；
所述的人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化的过程按顺序包括：
人BMSCs 的分离、培养过程，人BMSCs 的换液过程，人BMSCs 的传代过程，人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，
所述人BMSCs 的分离、培养过程包括以下步骤：
步骤一，于髂后上嵴抽取红骨髓2mL，加入100μ/mL 肝素0.5 mL 抗凝，无菌操作台内以2-3 mL PBS 缓冲液稀释，
步骤二， 将稀释液按1：1 比例缓慢移入装有人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque 的离心管中，使其分层明显，2000rpm，离心20min，
步骤三，收集位于界面层呈云雾状的有核细胞层，PBS 洗涤，1800rpm，离心15min，
步骤四，弃上清，PBS 重复洗涤两次，
步骤五，弃上清，用完全培养液悬浮，以1×105/cm3 的密度接种于培养瓶，置于37℃，50mL/L CO2 及饱和湿度条件下培养，标记为原代，即P0，
步骤六，视细胞生长情况48 小时首次更换培养基，
所述人BMSCs 的换液过程包括以下步骤：
步骤一，培养人BMSCs 采用含10% V/V胎牛血清的LG-DMEM 完全培养基，根据细胞生长状态，每3-4 天左右更换一次培养基，
步骤二， 换液时，先用巴斯德吸管柔和吹细胞面，把衰老的细胞吹下来，弃用旧培养基，加入3-5mL 新的培养基，置于37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，
所述人BMSCs 的传代过程，包括以下步骤：
步骤一， 显微镜下观察人BMSCs 生长状态，当细胞长到80%-90%融合时，需要进行消化、传代，
步骤二，轻晃培养瓶，弃去旧的细胞培养基，用5mL PBS 洗涤细胞两次，以去除血清残留，
步骤三，每瓶加入1 mL 0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA 消化液，在37℃消化不超过分钟，在纤维镜下控制消化时间，细胞突起收缩变形即可终止，
步骤四，弃上清，加入3mL 完全培养基或胎牛血清终止胰蛋白酶作用，
步骤五， 弃上清，用PBS 清洗细胞2 遍，加入新的完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞脱落形成单细胞悬液，
步骤六，根据细胞数量的多少按1:3 或更高比例接种于新的培养瓶，接种密度为1.0-2.0×103/cm3,置37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，
所述人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，包括以下步骤：
步骤一， 培养至第5 代的人BMSCs,进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单
细胞悬液，细胞计数板计数，
步骤二，将人BMSCs 以1×104/cm2 的密度接种于24 孔培养板中，使各孔中准确接种相同数量的细胞，
步骤三，从接种后第2 天起每日的相同时点，分别计数3 个孔中的细胞总数，连续计数到第8 天，
步骤四， 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，
步骤五， Patterson 公式计算细胞在对数生长期倍增时间，即Td =Tlg2/lg(Nt/No)，Td：倍增时间，小时；T:细胞由No 增至Nt 时所用的时间，小时；N:细胞数，
所述流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs 进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，不少于106，
步骤二， PBS 洗涤，800rpm，离心6min，2 次，
步骤三， 弃上清，轻敲离心管使细胞适当分散，缓慢滴加1mL -20℃预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时，
步骤四， 800rpm，离心6min，去除乙醇固定液，PBS 洗2 次，
步骤五，用0.5 mL 重悬细胞并转至Tube 中轻轻吹打，防止细胞破碎，
步骤六，加RNase-A 约3μL 至终浓度约为50μg/ mL,37℃水浴消化30min，
步骤七， 加PI 约400μL 至终浓度约为65μg/ mL，37℃避光染色30min，
步骤八， 用300 目，孔径40-50 微米，尼龙网过滤，上机检测，
所述流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，包括以下步骤：
步骤一，培养至第5 代的人BMSCs，胰蛋白酶溶液消化，PBS 重悬成单细胞悬液，计数，根据需要用台盼蓝进行细胞活性检测，
步骤二， 1000rpm,离心10min，用适量的PBS 缓冲液重悬细胞为1×106 个/mL，
步骤三， 移入流式管，加入不同一抗，轻轻混匀，不同抗体均设对应的IgG 同型对照，
步骤四，避光室温孵育30 分钟，
步骤五，加入缓冲液重复洗涤2 次，重悬细胞后上流式仪检测，
步骤六，根据同型对照的突光强度设定阴性细胞群阈值，观察每一种单抗的阳性细胞表达率及荧光强度；
所述乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程按顺序包括： 感染血清的准备过程， HBV 病毒感染人BMSCs的过程， HBV 感染后的人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 细胞周期的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程， HBV感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程，地高辛，即digoxigenin，DIG，标记全长DNA探针过程，DNA 印记，即Southern blotting，检测感染HBV 后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA过程， 电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程，间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程，特异性抗体阻断实验的过程，
所述感染血清的准备过程包括以下步骤：
取同时满足下列三项指标的患者乙肝患者血清,采集后超净工作台内0.22 微米滤器过滤除菌，分装，-80℃储存备用；
条件一， HBsAg(+),Anti-HBsAg(-),HBeAg(+),Anti-HBeAg(-),HBcAg-Ab-IgG(+)
条件二， HBV DNA:5.4×108copies/mL
条件三， 患者之前未接受抗病毒治疗，HCV(-),HIV(-)
所述HBV 病毒感染人BMSCs的过程包括以下步骤：
步骤一，处于对数生长期的第5 代人BMSCs，在超净工作台里吸净完全培养基，更换无血清无抗生素的LG-DMEM 培养基，37℃，50mL/CO2 条件下培养24 小时，
步骤二，取出细胞，吸净LG-DMEM 培养基，更换含10% (V/V)的感染血清的双无，即无FCS、无抗生素，培养基在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时，
步骤三，吸净含有病毒血清的培养基，为免除感染血清对实验结果的干扰，PBS 冲洗细胞6 次，收集最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，
步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃、50mL/CO2 的培养箱中继续培养，此时开始计算为0 天，
所述HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程包括以下步骤
步骤一， 从感染后第1 天起，每天用胰蛋白酶溶液消化、收集人BMSCs，PBS 洗涤细胞5次，弃上清，细胞沉淀用100μL PBS 重悬，
步骤二， 用微量样品基因组DNA 提取试剂盒，即TIANamp Micro DNA Kit，提取感染后各天的人BMSCs 的细胞基因组DNA,所有样品使用前平衡至15℃-25℃的室温下，提取过程按试剂盒说明书进行，
所述 HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程包括以下步骤：
HBV 感染人BMSCs 后，视细胞生长情况给予换液或传代处理，每天收集人BMSCs培养上清液，1000rpm，离心10min，去除沉淀，将上清分装到灭菌管EP 管中，标记后-20℃保存备用，样本注意避免反复冻融，不超过3 次，
所述HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程包括以下步骤：
培养上清液-20℃取出后融化，按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明进行，
所述 HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程包括以下步骤：
荧光定量PCR检测感染后人BMSCs 细胞内合成与分泌至培养上清中的HBV DNA 的含量，具体可按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明书及Light Cycler II 型核酸扩增荧光检测仪操作流程进行检测，
所述地高辛标记全长DNA探针过程包括以下步骤：
制作全长的HBV DNA 探针，标记按照标记检测试剂盒说明进行，
所述DNA印记，即Southern blotting，检测感染HBV后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA的过程包括以下步骤：
收集HBV 感染后的第2、4、6、8 天的人BMSCs 基因组DNA 并纯化cccDNA，Southernblotting 检测HBV 感染后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA，
所述电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程包括以下步骤：
检测前-20℃取出待测样品于室温下融化，按Roche 公司的HBsAg、HBeAg 定量检测试剂盒说明书及Elecsys2016 全自动电化学发光免疫分析仪的操作流程进行检测，
所述间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程包括以下步骤：
从感染后第1 天起，每天收集细胞的同时留一孔细胞，用间接免疫荧法检测人BMSCs是否表达HBcAg，
所述特异性抗体阻断实验过程包括以下步骤：
步骤一， 将含10%的感染血清的双无培养基加入不同稀释度的抗HBsAg 的特异性抗体，37℃作用2h，
步骤二， 接种人BMSCs，同期设细胞抗原对照组，即含10%的感染血清的双无培养基接种人BMSCs，在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时，
步骤三，PBS 洗涤6 次，最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，
步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃，50mL/CO2 的培养箱中继续培养，
步骤五， 72h 后收集人的BMSCs 培养上清，用电化学发光法检测HBsAg，检测方法同前面，
步骤六，计算阻断率，阻断率=(（细胞抗原对照组-细胞抗原实验组）/细胞抗原对照组)×100%；
所述南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程包括以下步骤：
步骤一，设立低、中、高含药血清组，含药血清在培养体系中的体积比分别为10%、20%、30%，同时设阴性对照组以及5-Fu 阳性对照组， 终浓度为10 mg/L ，
步骤二，取24 孔培养板，将对数生长期上述感染了HBV 的人BMSCs 细胞密度调整至1×104 个/孔，按需加入各组药物，每组设立6 个复孔，同时设置调零孔；
所述结果检测的过程按顺序包括：
检测感染HBV 后的人BMSCs 合成HBV cccDNA 的水平过程，检测感染HBV 后的人BMSCs培养上清中HBsAg、HBeAg 和HBcAg 的变化过程，检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程，检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，
所述检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程包括以下步骤，步骤一，氯仿－异丙醇法抽提总mRNA，用752紫外光栅分光光度计测定样本的总RNA
纯度及浓度后样本保存于-80℃冰箱备用，按照逆转录试剂盒说明书操作步骤，合成第1链cDNA后冻存于-20℃中备用，
步骤二，使用SYBR Green I 荧光染料法在384 孔ABI Prism 7900 序列检测系统，即Applied Biosystems，CA，上荧光实时定量PCR 扩增，分析MIF 基因表达，为控制不同样本间的基因表达差异，用管家基因3－磷酸甘油醛脱氢酶，即glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH，作为内对照基因，来标化目的基因的表达，以GAPDH 作为内对照基因，计算MIF 基因mRNA 相对定量即2－△△CT，每个样本的MIF 基因和内对照GAPDH 基因均重复3 次，荧光实时定量PCR 扩增体系共10μL：SYBR Green IPCR Mastermix5 μL，上、下游Primer 计0.8μL，RNase-free H2O 3.2μL，cDNA 模板1μL，荧光实时定量PCR用2步法，扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃ 1 min、72℃1 min、40 个循环，采用比较循环数，即cycle threshold，CT，的方法相对定量，荧光定量PCR 的结果以CT 值显示，CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，△CT 值＝单样本平均目标基因CT 值-单样本平均GAPDH 基因CT 值，以2－△△CT 代表目的基因的表达水平，每个样本的△△CT＝每个样本的平均△CT -对照组的平均△CT，来计算表达差异的倍数，每次实验重复3 次，
所述 检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，包括以下步骤：
冰上提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白质含量；用5X蛋白，将总蛋白配置成含1XLB的蛋白上样液，在100℃的block 中煮沸5 min，室温下冷却后冻存于-80℃备用，配置12％的SDS-PAGE 凝胶，用湿转法将蛋白电转到PVDF
膜上；5％脱脂奶粉常温封闭1h；加入MIF、GAPDH 一抗，即1∶2000，1：5000，
在4℃冰箱中孵育过夜，TBST 漂洗10 min×3 次，加入二抗，即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 小时，TBST 漂洗10 min×3 次，混均ECL 显影液后在Fujilas3000显影仪中将免疫复合物显影，用计算机图像分析系统软件IMAGE J 分析测定MIF 及内参照GAPDH，比较MIF的积分光密度比值；
所述的统计学分析过程包括以下步骤：
应用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，数据用（x ± s）表示，采用独立样本 t 检验比较不同处理组与对照组间的差异；采用 one-way ANOVA 方差分析方法，以不同处理方式做为组间因素，比较不同处理对 MIF 表达趋势的影响，检验水准ɑ＝0.05，双侧检验。
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