CN114632155A

CN114632155A - PKA抑制剂H89及其siRNA在制备治疗新型冠状病毒病药物中的应用

Info

Publication number: CN114632155A
Application number: CN202210303773.1A
Authority: CN
Inventors: 刘海楠; 刘萱; 曹诚; 柏宇; 张迅
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-03-24
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-03-24
Also published as: CN114632155B

Abstract

本发明涉及丝/苏氨酸激酶PKA作为新型冠状病毒病治疗靶点的应用，所述应用包括：采用能够抑制PKA表达/降低PKA活性的物质制备用于预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒病的产品。经实验证明，使用丝/苏氨酸激酶PKA siRNA/H89化合物处理细胞后，细胞中新型冠状病毒复制显著降低，新型冠状病毒的增殖被抑制。本发明还进一步筛选出了对PKA有显著敲低作用的siRNA。同时，本发明还利用CCK8检测H89药物细胞毒性发现，当培养基中H89浓度不超过10μM时表现出极低的细胞毒性，因此化合物H89可作为预防/治疗新型冠状病毒病的候选药物。本发明为新型冠状病毒感染导致的急性传染病防治提供了新策略。

Description

PKA抑制剂H89及其siRNA在制备治疗新型冠状病毒病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及PKA抑制剂H89及其siRNA在制备治疗新型冠状病毒病药物中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的严重威胁人类健康的传染性疾病。SARS-CoV-2是一种含有包膜的RNA病毒，由外层的包膜和内层的核衣壳构成。目前，针对新型冠状病毒有效的防治策略仍然是亟待解决的难题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种可用于新型冠状病毒病治疗的靶点，该靶点为丝/苏氨酸激酶PKA(Gene ID:5566)；经细胞实验证明，使用丝/苏氨酸激酶PKA siRNA/抑制剂H89处理细胞后，细胞内新型冠状病毒的复制显著降低，证明PKA siRNA/抑制剂H89可有效抑制新型冠状病毒的增殖。本发明为新型冠状病毒感染导致的急性传染病防治提供了新的应对策略。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明涉及丝/苏氨酸激酶PKA作为新型冠状病毒病治疗靶点的应用，所述应用包括：采用能够抑制PKA表达/降低PKA活性的物质制备用于预防新型冠状病毒病感染或治疗新型冠状病毒病的产品。

优选地，所述能够抑制PKA表达/降低PKA活性的物质包括但不限于PKA抑制剂、PKAsiRNA或敲除PKA表达的基因编辑工具。

优选地，所述PKA抑制剂为H89化合物。

优选地，所述PKA siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA，或为由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链退火形成的siRNA，或为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链退火形成的siRNA。

其中，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的PKA siRNA对细胞中PKA的敲低效果最为显著。

各序列分别如下：

5’-CCAGAUCGUCCUGACCUUUTT-3’(SEQ ID No.1)；

5’-AAAGGUCAGGACGAUCUGGTT-3’(SEQ ID No.2)。

5’-GGAACCACUAUGCCAUGAATT-3’(SEQ ID No.3)；

5’-UUCAUGGCAUAGUGGUUCCTT-3’(SEQ ID No.4)。

5’-CCUUCAAGGACAACUCAAATT-3’(SEQ ID No.5)；

5’-UUUGAGUUGUCCUUGAAGGTT-3’(SEQ ID No.6)。

化合物H89的结构如下：

第二方面，本发明涉及PKA siRNA在制备预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒病药物中的应用；所述所述PKA siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

第三方面，本发明提供化合物H89在制备预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒病药物中的应用。

(三)有益效果

本发明提供了一种治疗新型冠状病毒病的新靶点，即丝/苏氨酸激酶PKA(GeneID:5566)，研究表明使用丝/苏氨酸激酶PKA siRNA/抑制剂H89处理细胞后，细胞内新型冠状病毒复制显著降低，有效抑制了新型冠状病毒的增殖。同时，利用CCK8检测H89药物细胞毒性发现，当培养基中H89浓度不超过10μM时表现出极低的细胞毒性，因此化合物H89可作为预防/治疗新型冠状病毒病的候选药物。本发明为新型冠状病毒感染导致的急性传染病防治提供了新策略，在药物研发及疫苗开发方面有重要应用价值。

附图说明

图1为采用免疫共沉淀及免疫印迹法检测NSP13与丝/苏氨酸激酶PKA的相互作用；图中lysate指的是全细胞裂解液、IP之前的细胞产物。

图2为利用免疫印迹手段比较不同siRNA敲低PKA的效率。

图3为采用筛选的PKA siRNA对细胞中PKA进行敲低后，利用荧光定量PCR手段检测PKA siRNA对新型冠状病毒复制的影响；该实验以空白和瑞德西韦为对照组。

图4为采用H89化合物处理细胞以降低PKA活性后，利用荧光定量PCR手段检测H89对新型冠状病毒复制的影响；该实验以空白(DMSO)和瑞德西韦为对照组。

图5利用CCK8检测不同浓度的H89药物的细胞毒性；该实验以空白(DMSO)为对照组。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

下述实验中需使用的试剂或材料说明(来源、获取途径)如下：

质粒：新冠互补系统来自于均为来自军事医学研究院程龙课题组赠予，结构以及迷你基因组相关操作参见丁强等人与2020年在PLOS Pathogens杂志发表的文章中的图1。

(Ju X,Zhu Y,Wang Y,et al.A novel cell culture system modeling theSARS-CoV-2life cycle.PLoS Pathog.2021；17(3):e1009439.Published 2021Mar12.doi:10.1371/journal.ppat.1009439)

试剂：DMEM培养基(目录号为C11995500BT)、胎牛血清(目录号为16000-044)、胰酶(目录号为25200-056)、PBS(目录号为C10010500BT)均购于GIBCO；TransIT X2转染试剂购于Mirus Bio公司(目录号为MIR6003)；PKA抗体购于Proteintech公司(目录号为24503-1-AP)；驴抗兔抗体购于Sigma-Aldrich公司(目录号为AP182P)；GFP抗体购于Proteintech公司(目录号为HRP-66002)；Myc-HRP抗体购买于Sigma-Aldrich公司(目录号为M5546)；CCK-8试剂盒购于索莱宝公司(目录号为CA1210)；β-Actin抗体购买于Proteintech公司(目录号为66009-1-Ig)；QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒购买于Qiagen公司用于RNA提取(目录号为52904)新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)购于深圳市普瑞康生物技术有限公司。

实施例1

本实施例采用免疫共沉淀及免疫印迹法检测确认PKA(PKA催化亚基α，PRKACA)和新冠病毒NSP13的相互作用。NSP13是新型冠状病毒的解旋酶，在复制过程中发挥重要作用。

具体实验方法如下：

(1)构建Myc-PKA表达载体。构建方法为：在数据库NCBI上查找prkaca基因序列，使用primer5设计出PKA扩增引物；PCR扩增目的片段，在37℃使用EcoRI和XhoI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后将酶切产物进行回收。使用T4连接酶将其与pCMV-Myc载体在16℃反应2h以上，转化DH5α感受态细胞，后将菌液均匀涂布在含有载体对应抗生素的固体LB培养基上。37℃培养12h后，挑取单个菌落在5mL含有抗生素的液体LB培养基中培养，提质粒后送到北京诺赛基因有限公司测序。GFP-NSP13质粒参照前述方法构建或直接购买。

(2)将构建好的Myc-PKA和GFP-NSP13质粒利用TransIT X2转染试剂按图1所示组合方式转染至人胚肾293细胞中，质粒转染1μg，48h后将培养基吸去，使用预冷1×PBS收集并重悬细胞，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(Tris-HCl 50mM pH 8.0，NaCl150mM，NP401％，蛋白酶抑制剂1片/50mL)后，置于冰上30min，4℃下12000rpm离心10min，吸取上清至干净1.5mL EP管中，加入15μL偶联Myc抗体的琼脂糖珠，于4℃旋转孵育2h进行免疫共沉淀，4℃下8000rpm离心1min，去上清，使用不含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液清洗3次，将免疫沉淀产物加入75μL的1×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，于4℃、8000rpm离心3min，取15μL上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，80V电泳30min后，将电压调至120V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。

(3)将PVDF膜用10mL甲醇激活10s，去离子水清洗后置于1×半干转膜缓冲液中(Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM、20％甲醇)，随后将完成电泳的SDS-PAGE凝胶置于PVDF膜上；按照从上至下滤纸-胶-膜-滤纸的顺序依次逐层放置于转膜仪上，使用按压棒来去除层间的气泡，18V电压转膜2h。转膜完成后使用含有5％脱脂奶粉的TBST进行室温封闭1h，1×TBST清洗3次，每次5min。使用按1:1000稀释好的抗体(anti-Myc和anti-GFP)孵育，室温1h，1×TBST清洗3次，每次5min。最后使用ECL方法进行显影，使用显影仪来显影。

如图1所示结果发现，Myc-PKA的免疫沉淀产物中存在NSP13，证明了PKA和NSP13之间存在相互作用。且已知NSP13在新型冠状病毒复制过程中的重要作用，PKA又是一种丝/苏氨酸激酶，其参与了调节人体糖代谢等重要生理活动。近50％的新冠患者都存在血糖异常。基于上述实验结果和综合PKA的功能分析，确定PKA参与了新型冠状病毒复制过程。因此，通过改变PKA的活性，进一步可影响到相关基因的表达。

实施例2

本实施例利用免疫印迹手段比较不同siRNA敲低PKA的效率，用于筛选出对PKA敲低效率最高的siRNA。实验方法如下：

(1)使用TransIT X2转染试剂分别将四对0.15nmol PKA siRNA转染至H1299细胞中(六孔板)，72h后收细胞。

所述四对PKA siRNA结构如下(包含一对控制组)：

siRNA-PKA-1:

5’-GGAACCACUAUGCCAUGAATT-3’；(SEQ ID NO.3)

5’-UUCAUGGCAUAGUGGUUCCTT-3’。(SEQ ID NO.4)

siRNA-PKA-2:

5’-CCUUCAAGGACAACUCAAATT-3’；(SEQ ID NO.5)

5’-UUUGAGUUGUCCUUGAAGGTT-3’。(SEQ ID NO.6)

siRNA-PKA-3:

5’-CCAGAUCGUCCUGACCUUUTT-3’；(SEQ ID NO.1)

5’-AAAGGUCAGGACGAUCUGGTT-3’。(SEQ ID NO.2)

ctrl siRNA:

5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID No.7)；

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID No.8)。

(2)先将培养基吸去，使用预冷1×PBS收集并重悬细胞，清洗3次，完全弃掉上清。加入细胞裂解液(Tris-HCl 50mM pH 8.0，NaCl 150mM，NP40 1％，蛋白酶抑制剂1片/50mL)后，置于冰上30min，于4℃和12000rpm离心10min，吸取60μL上清至干净1.5mL的EP管中，加入15μL的5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，4℃8000rpm离心3min，取10μL上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，80V电泳30min后，将电压调至120V到溴酚蓝迁移到凝胶底部停止电泳。

(3)将PVDF膜用10mL甲醇激活10s，去离子水清洗之后置于1×半干转膜缓冲液中(Tris-HCl 24mM，甘氨酸5mM、20％甲醇)，随后将完成电泳的SDS-PAGE凝胶置于PVDF膜上；按照从上至下滤纸-胶-膜-滤纸的顺序依次逐层放置于转膜仪上，使用按压棒来去除层间的气泡，18V电压转膜2h。转膜完成后使用含有5％脱脂奶粉的TBST进行室温封闭1h，1×TBST清洗3次，每次5min。使用按1:1000的比例稀释好的PRKACA、β-Actin一抗孵育，室温1h，1×TBST清洗3次，每次5min。使用按一定比例稀释好的二抗孵育(驴抗兔)，室温1h，1×TBST清洗3次，每次5min。最后使用ECL方法进行显影。

由图2可以看到，当使用上述三对PKA siRNA对H1299细胞中的PKA进行敲低后，PKA的表达量显著下降，证明敲低是有效果的，尤其是以siRNA-PKA-3的敲低效率最好。

实施例3

本实施例采用筛选的PKA siRNA-3对细胞中PKA进行敲低后，利用荧光定量PCR手段检测PKA siRNA-3对新型冠状病毒复制的影响。实验以空白和瑞德西韦为对照组。实验方法如下：

(1)使用TransIT X2转染试剂将分别将0.075nmol、0.15nmol、0.3nmol siRNA-3转染至H1299细胞中(六孔板)，24h后利用互补系统感染H1299细胞，48h后收细胞，准备提取RNA。

其中，新冠病毒互补系统的感染细胞的方法参见X.Ju et al.,A novel cellculture system modeling the SARS-CoV-2life cycle.PLoS pathogens 17,e1009439(2021)。本实验中H1299感染的新冠病毒序列为MN908947(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947)。

(2)提取RNA的方法为：首先将培养皿(六孔板或小皿)中的培养基吸去，室温PBS漂洗2次，吸尽残留液体，加入350μL Trizol裂解液，混匀后再加入350μL的100％乙醇，充分混匀并将其加入RNA吸附柱，8000rpm离心1min，弃掉废液，接着向吸附柱中加入500μL BufferAW1，8000rpm离心1min，弃掉废液，在向吸附柱中加入500μL Buffer AW2液，8000rpm离心1min，弃掉废液，重复一次。将吸附柱放入一个新的2mL EP管中，13000rpm离心5min，最后将吸附柱转移至一个新的1.5mL EP管中，加入60μL不含RNA酶的水，13000rpm离心1min，EP管中得到的就是细胞的总RNA(包括病毒RNA)。

(3)对2019-nCoV病毒RNA含量检测：

参照新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)说明书进行操作。即先配置PCR反应液(13.8μL反应液A，1.2μL反应液B)，分别加入对应的反应管中。在已处理好的15μL RNA、阴性对照与15μL反应液在反应管中混合，进行PCR扩增检测。

反应条件为：50℃、20min；95℃、3min；95℃、15s；55℃、30s(收集荧光信号)，40个循环；25℃、10s。

GAPDH(内参)检测：参照Promega公司

1-Step RT-qPCR System试剂盒说明说进行操作。本实验在Bio-Rad公司的iQ5 Real Time PCR仪操作。取1μL RNA配置20μL反应体系。反应条件为：40℃、15min；95℃、10min；95℃、10s，60℃、30s(收集荧光信号)，72℃、30s；40个循环。qPCR引物如下：

GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；

GAPDH-R：5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。

利用GAPDH数据进行平衡，通过计算和统计，结果如图3。由图可以看到，新冠病毒RNA的数量随siRNA用量的增加而显著降低，并且差异显著。证明PKA siRNA能够有效抑制新型冠状病毒复制，且浓度越高抑制越明显。

实施例4

本实施例采用筛选的PKA抑制剂H89对细胞中PKA的活性进行抑制后，利用荧光定量PCR手段检测PKA抑制剂H89对新型冠状病毒复制的影响。实验以空白和瑞德西韦为对照组。实验方法如下：

(1)使用浓度为10μM的PKA抑制剂H89处理H1299细胞，24h后利用互补系统感染细胞，48h后收细胞，准备提取RNA。

(2)提取RNA的方法为：首先将培养皿(六孔板或小皿)中的培养基吸去，室温PBS漂洗2次，吸尽残留液体，加入350μLTrizol裂解液，混匀后再加入350μL的100％乙醇，充分混匀并将其加入RNA吸附柱，8000rpm离心1min，弃掉废液，接着向吸附柱中加入500μL BufferAW1，8000rpm离心1min，弃掉废液，在向吸附柱中加入500μL Buffer AW2液，8000rpm离心1min，弃掉废液，重复一次。将吸附柱放入一个新的2mL EP管中，13000rpm离心5min，最后将吸附柱转移至一个新的1.5mL EP管中，加入60μL不含RNA酶的水，13000rpm离心1min，EP管中得到的就是细胞的总RNA(包括病毒RNA)。

(3)对2019-nCoV病毒RNA含量检测：

GAPDH(内参)检测：参照Promega公司

GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；

GAPDH-R：5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。

利用GAPDH数据进行平衡，通过计算和统计，结果如图4。由图可以看到，当使用10μM H89处理后，新冠病毒RNA数量显著降低，证明H89能够抑制新型冠状病毒的复制。

实施例5

本实施例利用CCK8检测不同浓度的H89药物的细胞毒性；以空白对照(DMSO)为对照组。实验方法如下：

(1)细胞培养：96孔板中每孔接种5×10³个HEK-293细胞，培养基100μL，24h之后加入配制好的预定浓度(100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM)的H89培养基溶液(MDSO)，对照组中加入培养基(MDSO)，每组8个重复；

(2)37℃培养48h后，向培养板中加入10μL CCK-8溶液；

(3)在培养箱中孵育1h后，使用酶标仪测定450nm处的吸光度。

(4)通过计算实验组/对照组*100％，可得出对应孔的细胞存活率。实验结果如图5所示。

其中，当培养基溶液中H89浓度在10μM及10μM以下时，细胞存活率>100％。这说明，当控制H89化合物在合理且有效的浓度下，表现出极低甚至可忽略的细胞毒性，故H89化合物可作为活性成分，用于制备治疗新型冠状病毒病的候选药物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> PKA抑制剂H89及其siRNA在制备治疗新型冠状病毒病药物中的应用

<130> EJS220296I

<141> 2022-03-23

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccagaucguc cugaccuuut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aaaggucagg acgaucuggt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggaaccacua ugccaugaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

uucauggcau agugguucct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccuucaagga caacucaaat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

uuugaguugu ccuugaaggt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.丝/苏氨酸激酶PKA作为新型冠状病毒病治疗靶点的应用，所述应用包括：采用能够抑制PKA表达/降低PKA活性的物质制备用于预防新型冠状病毒病感染或治疗新型冠状病毒病的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述能够抑制PKA表达/降低PKA活性的物质包括但不限于PKA抑制剂、PKA siRNA或敲除PKA表达的基因编辑工具。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PKA抑制剂为H89化合物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PKA siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的两条单链退火形成的siRNA，或为由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链退火形成的siRNA，或为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链退火形成的siRNA。

5.PKA siRNA在制备预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒病药物中的应用；所述所述PKA siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

6.化合物H89在制备预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒病药物中的应用。