CN117298280B - 以creb1或其编码基因为靶点的物质在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用 - Google Patents
以creb1或其编码基因为靶点的物质在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了医用配制品领域中以CREB1或其编码基因为靶点的物质在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。本发明所要解决的技术问题是如何抑制新型冠状病毒感染细胞。本发明提了抑制细胞中CREB1基因表达的物质、抑制细胞中CREB1蛋白活性的物质和降低细胞中CREB1蛋白含量的物质在制备新型冠状病毒抑制剂或新型冠状病毒复制抑制剂中的应用。本发明可用于预防或治疗新型冠状病毒感染细胞所致疾病。
Description
技术领域
本发明涉及医用配制品领域中以CREB1或其编码基因为靶点的物质在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。
背景技术
新型冠状病毒是一种RNA病毒,其基因组为单股正链RNA,共编码四种结构蛋白,同时基因组的5’末端2/3部分编码两个前体蛋白Pol1a和Pol1b,进一步裂解为16个非结构蛋白,参与RNA的复制和转录。Nsp13是冠状病毒ORF1b编码的一种非结构蛋白,具有ATP酶及解旋酶活性,是冠状病毒复制转录复合物的重要组成部分,可以在NTP依赖条件下将双链核苷酸解旋为单链核苷酸。Nsp13蛋白序列高度保守,SARS-CoV和SARS-CoV-2仅仅相差一个氨基酸(V570I),因此推测该蛋白在冠状病毒的生命周期中具有十分重要的作用。
转录因子cAMP-应答元件结合蛋白(CREB1)是位于细胞核中的转录调节因子,与启动子上的cAMP应答元件(CRE)结合进而启动下游基因的转录。CREB1磷酸化可促使诸如Bcl-2、IL-6等基因的转录,进而调节细胞的生长代谢、免疫等一系列生命活动。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何抑制新型冠状病毒感染细胞。
为了解决以上技术问题,本发明提供了抑制细胞中CREB1基因表达的物质或抑制细胞中CREB1蛋白活性或含量的物质在下述任一种中的用途:
1)抑制细胞中CREB1基因表达的物质在制备新型冠状病毒抑制剂或新型冠状病毒复制抑制剂中的应用;
2)抑制细胞中CREB1基因表达的物质在制备治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物中的应用;
3)抑制细胞中CREB1蛋白活性的物质在制备新冠病毒抑制剂中的应用;
4)抑制细胞中CREB1蛋白活性的物质在制备治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物中的应用;
5)降低细胞中CREB1蛋白含量的物质在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用;
6)降低细胞中CREB1蛋白含量的物质在制备治疗新型冠状病毒感染或/和预防新型冠状病毒感染的药物中的应用;
7)CREB1蛋白在制备促进新型冠状病毒复制的药物中的应用。
上述应用中,所述抑制CREB1基因表达的物质或抑制CREB1蛋白活性的物质均可为下述中任一种生物材料:
1)双链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐;
B1)产生1)所述双链RNA分子的DNA分子;
B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒;
B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
所述双链RNA分子的一条链的从5’端至3’端的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.1,所述双链RNA分子的另一条链的从3’端至5’端的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.2。
各序列的核苷酸信息分别如下:
5’-GGCCUGCAAACAUUAACCATT-3’(SEQ ID No.1);
5’-UGGUUAAUGUUUGCAGGCCTT-3’(SEQ ID No.2)。
所述双链RNA分子的化学修饰物是对所述双链RNA分子进行化学修饰得到的物质。所述化学修饰可包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合。
上述应用中,所述产品可为药物或疫苗。
本发明所提供的治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物,含有所述双链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。
上述新冠病毒抑制剂或药物的剂型可为片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂或冻干粉针剂。
上文中,所述新冠病毒抑制剂或/和治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物的活性成分可为所述双链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐,所述新冠病毒抑制剂或/和治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物的活性成分还可含有其他物质,其他物质本领域技术人员可根据所述新冠病毒抑制剂或/和治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物的效果确定。
上文中,所述新冠病毒抑制剂或/和治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物,除含有所述双链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐外,还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型,包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片,例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片,或双层片和多层片。
为了将单位给药剂型制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等;粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等;崩解剂,如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将单位给药剂型制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。
为了将单位给药剂型制成注射用制剂,如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂,可以使用本领域常用的所有稀释剂,例如,水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外,为了制备等渗注射液,可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外,如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药,包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等;腔道给药,如经直肠和阴道;呼吸道给药,如经鼻腔和粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。
上述应用中,所述抑制剂可为抑制新型冠状病毒感染细胞的制剂。所述细胞可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物可为人。所述细胞可为HEK293T细胞、A549细胞或H1299细胞。
上述应用中,所述抑制剂或产品可应用于哺乳动物,如人。
上述应用中,所述抑制细胞中CREB1基因表达的物质或抑制细胞中CREB1蛋白活性的物质可为CREB1抑制剂666-15。
CREB1抑制剂666-15的结构如下:
以上任一所述新型冠状病毒为野生型新型冠状病毒或野生型新型冠状病毒的自然变异株或为新型冠状病毒互补系统。
以上任一所述新型冠状病毒可为野生型新型冠状病毒、新型冠状病毒Alpha株、新型冠状病毒Beta株、新型冠状病毒Gamma株、新型冠状病毒Delta株、新型冠状病毒DeltaPlus株、新型冠状病毒Kappa株、新型冠状病毒Epsilon株、新型冠状病毒Eta株、新型冠状病毒Iota株、SARS-CoV-2 WIV04株或Omicron株。
以上任一所述新型冠状病毒可为新型冠状病毒互补系统。
本发明还提供了上述抑制CREB1基因表达的物质或抑制CREB1蛋白活性的生物材料。
本发明还提供了药物组合物,所述药物组合物含有下述任一种物质:
M1)抑制CREB1基因表达的物质;
M2) 新型冠状病毒抑制剂。
上述药物组合物中,所述物质可为下述中任一种生物材料:
1)双链RNA分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐;
B1)产生1)所述双链RNA分子的DNA分子;
B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒;
B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
本发明证实了新型冠状病毒非结构蛋白Nsp13与宿主转录因子CREB1存在直接相互作用,并且CREB1会促进Nsp13的ATP酶活性及解旋酶活性;敲低CREB1及使用CREB1抑制剂666-15能够显著抑制新型冠状病毒在细胞中的增殖;在动物水平上,666-15可以显著降低新型冠状病毒鼠适应株感染小鼠的致死率。同时本发明利用CCK8检测方法对666-15进行细胞毒性检测发现,666-15在培养基中浓度低于4 μM时表现极低的细胞毒性,因此该药物可作为预防/治疗新型冠状病毒感染的候选药物。本发明阐述了CREB1作为靶点用于新型冠状病毒治疗中的潜力,为其在应用于新型冠状病毒临床防治提供了新的依据,可用于新型冠状病毒感染导致的急性传染病治疗领域。
附图说明
图1为免疫荧光检测Nsp13与CREB1在细胞内共定位。其中上图为转染pEGFP-Nsp13的重组细胞的结果,下图为对照细胞的结果;左起第1列为GFP荧光结果,第2列为anti-CREB1 Rabbit mAb及山羊抗兔IgG/TRITC抗体染色结果,第3列为DAPI染色结果,第4列为前三列图片叠加后的结果。
图2为宿主CREB1促进Nsp13 ATP酶活性。其中组1为CREB1蛋白浓度为0 nM和Nsp13蛋白浓度为300 nM的反应体系结果;组2为CREB1蛋白浓度为150 nM和Nsp13蛋白浓度为300nM的反应体系结果;组3为CREB1蛋白浓度为250 nM和Nsp13蛋白浓度为300 nM的反应体系结果;组4为CREB1蛋白浓度为350 nM和Nsp13蛋白浓度为300 nM的反应体系结果;组5为CREB1蛋白浓度为450 nM和Nsp13蛋白浓度为300 nM的反应体系结果;组6为CREB1蛋白浓度为450 nM的反应体系结果。
图3为宿主CREB1促进Nsp13解旋酶活性。
图4为敲低CREB1抑制冠状病毒的增殖。柱状图为新冠病毒RNA含量,线条图为CREB1表达水平。
图5为CREB1抑制剂666-15显著抑制新型冠状病毒增殖;a为使用新型冠状病毒互补系统感染;b为使用新型冠状病毒WIV04株感染;c为使用新型冠状病毒Omicron株感染。
图6为CREB1抑制剂显著降低新型冠状病毒鼠适应株感染小鼠致死率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验,如无特别说明,均设置三次重复实验。
下述实施例中的质粒pCMV-Myc(目录号为VT1064),pCAGGs(目录号为VT1076),pEGFP-C1(目录号为VT1118),pGEX4T-1(目录号为VT1253)购于优宝生物。
1、细胞株、质粒与病毒
下述实施例中的293T细胞和H1299细胞均为本实验室保存,已记载于授权专利:PKA抑制剂H89及其siRNA在制备治疗新型冠状病毒病药物中的应用。A549细胞购买于北京协和细胞资源中心,目录号为1101HUM-PUMC000002。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的新型冠状病毒互补系统为军事医学研究院程龙课题组赠予,其结构以及相关操作信息已记载于:Ju X, Zhu Y, Wang Y, et al. A novel cell culturesystem modeling the SARS-CoV-2 life cycle. PLoS Pathog. 2021;17(3):e1009439.Published 2021 Mar 12. doi:10.1371/journal.ppat.1009439。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的新型冠状病毒SARS-CoV-2 WIV04株为军事医学研究院军事兽医研究所赠予,已记载于:Yan F, Li E, Wang T, et al. Characterization of TwoHeterogeneous Lethal Mouse-Adapted SARS-CoV-2 Variants RecapitulatingRepresentative Aspects of Human COVID-19. Front Immunol. 2022;13:821664.Published 2022 Feb 7. doi:10.3389/fimmu.2022.821664。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的SARS-CoV-2 Omicron株为军事医学研究院军事兽医研究所赠予,已记载于:Tai W, Chai B, Feng S, et al. Development of a ferritin-basednanoparticle vaccine against the SARS-CoV-2 Omicron variant. Signal TransductTarget Ther. 2022;7(1):173. Published 2022 Jun 1. doi:10.1038/s41392-022-01041-8。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的新型冠状病毒鼠适应株C57MA14来源于军事医学研究院军事兽医研究所,已记载于:Yan F, Li E, Wang T, et al. Characterization of TwoHeterogeneous Lethal Mouse-Adapted SARS-CoV-2 Variants RecapitulatingRepresentative Aspects of Human COVID-19. Front Immunol. 2022;13:821664.Published 2022 Feb 7. doi:10.3389/fimmu.2022.821664。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
2、分子生物学试剂与抗体
PBS(目录号为C10010500BT)、DMEM培养基(目录号为C11995500BT)、胎牛血清(目录号为16000-044)、OPTI-MEM培养基(31985-062)购于Gibco;转染试剂Lipofectamine2000(目录号为11668-019)、TRIzol(目录号为15596026)、BCA蛋白检测试剂盒(目录号为A53225)购于Thermo公司;蛋白酶抑制剂Cocktail(目录号为:04693132001)购于罗氏公司;5×上样缓冲液(目录号为P1041)、5’三磷酸腺苷(ATP)(目录号为A903)、CCK8试剂盒(目录号为CA1210)购于索莱宝公司;HRP标记的Flag抗体(目录号为H7425)、HRP标记的Myc抗体(目录号为16-213)、偶联抗Flag抗体的琼脂糖珠(目录号为A2220)、偶联抗Myc抗体的琼脂糖珠(目录号为A7470)、IgG琼脂糖珠(目录号为A2909)、还原型谷胱甘肽(目录号为G5251)、ATP酶活性检测试剂盒(目录号为MAK113)购买于Sigma公司;HRP标记的GFP抗体(目录号AE030)、偶联抗GFP抗体的琼脂糖珠(目录号为AE074)购买于 ABclonal公司;anti-CREB1Rabbit mAb(目录号为#9197)购买于Cell Signaling Technology公司;山羊抗兔IgG/TRITC(目录号为ZF-0311)购买于中杉金桥公司;TransIT-X2(目录号为MIR6003)购买于Mirus Bio公司;谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B(目录号为17-0756-01)购买于Cytiva公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit(目录号为52904)购买于Qiagen公司;GoTaq 1-Step RT-qPCR System试剂盒(目录号为A6020)购买于Promega公司;CREB1-N-His蛋白(目录号为WX0335FE)购买于Origene公司;666-15(目录号为S8846)购买于Selleck公司;新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒购买于深圳市普瑞康生物技术有限公司。
其中,666-15是CAS编号为1433286-70-4的化合物,是CREB抑制剂。
下述实施例采用Prism 9统计软件对数据进行处理,实验结果以平均值±标准偏差表示,采用One-way ANOVA检验,P<0.05(*)表示具有显著性差异,P<0.01(**)表示具有极显著性差异,P<0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例1、免疫沉淀与免疫印迹检测Nsp13与CREB1的相互作用研究
1、质粒pCMV-Myc-CREB1、pCAGGs-Flag-Nsp13和pEGFP-Nsp13的构建方法
在数据库NCBI上查找CREB1、Nsp13基因序列,使用primer 5设计出扩增引物,扩增引物为:
CREB1-F:5’-GAATTCATGACCATGGAATCTGGAGCCG-3’(SEQ ID No.3);
CREB1-R:5’-GCGGCCGCTTAATCTGATTTGTGGCAGTAAAGGT-3’(SEQ ID No.4);
Nsp13-F:5’-GAATTCGCTGTTGGGGCTTGTGTTCT-3’(SEQ ID No.5);
Nsp13-R:5’-CTCGAGTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACGT-3’(SEQ ID No.6);
Nsp13-2-F:5’-CTCGAGGCTGTTGGGGCTTGTGTTCT-3’(SEQ ID No.7);
Nsp13-2-R:5’-GAATTCTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACGT-3’(SEQ ID No.8);
其中下划线为酶切位点,PCR扩增目的片段,分别获得含有CREB1蛋白(氨基酸序列为SEQ ID No.9)的编码序列,具体为SEQ ID No.10;获得含有Nsp13蛋白(氨基酸序列为SEQID No.11)的编码序列,具体为SEQ ID No.12。
在37℃分别使用EcoRI、NotI;EcoRI、XhoI;XhoI、EcoRI对出发载体pCMV-Myc、pCAGGs、pEGFP-C1及扩增片段进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳后将酶切产物进行回收。使用T4连接酶将酶切后的片段和线性载体在16℃反应2h以上,转化DH5α感受态细胞,然后将菌液均匀涂布在含有载体对应抗生素(氨苄青霉素钠:工作浓度100 μg/mL;硫酸卡那霉素:工作浓度50 μg/mL)的固体LB培养基上。37℃培养12h后,挑取单个菌落在5 mL含有抗生素(氨苄青霉素钠:工作浓度100 μg/mL;硫酸卡那霉素:工作浓度50 μg/mL)的液体LB培养基中培养,提质粒后送北京擎科生物科技有限公司进行测序,成功获得重组载体pCMV-Myc-CREB1、pCAGGs-Flag-Nsp13和pEGFP-Nsp13。
重组载体pCMV-Myc-CREB1的结构描述如下:以核苷酸序列是SEQ ID No.10的DNA分子替换了载体pCMV-Myc载体的EcoRI和NotI识别位点之间的片段,并且保持pCMV-Myc载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
重组载体pCAGGs-Flag-Nsp13的结构描述如下:以核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子替换了载体pCAGGs载体的EcoRI和XhoI识别位点之间的片段,并且保持pCAGGs载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
重组载体pEGFP-Nsp13的结构描述如下:以核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子替换了载体pEGFP-C1载体的XhoI和EcoRI识别位点之间的片段,并且保持pEGFP-C1载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
2、免疫沉淀与免疫印迹检测Nsp13与CREB1的相互作用
以在100 cm培养皿中的293T细胞中共转染pCAGGs-Flag-Nsp13和pCMV-Myc-CREB1为例,使用Thermo公司Lipofectamine 2000,按照说明书进行质粒转染,具体步骤如下:先将6 μg pCAGGs-Flag-Nsp13和6 μg pCMV-Myc-CREB1加入含有800 μL opti-MEM的1.5 mLEP管中混匀,再以质粒:lipo2000=1:1.5的比例,将lipo2000加入到体系中混合均匀,室温静置15 min,将混合液缓慢均匀地加入培养基中。转染后36-48 h后,得到转染pCAGGs-Flag-Nsp13和pCMV-Myc-CREB1的重组细胞(将其命名为293T/Flag-Nsp13/Myc-CREB1)
将培养皿中的293T/Flag-Nsp13/Myc-CREB1细胞重悬于预冷的PBS中,并使用PBS清洗两次,4 ℃、2000 rpm离心3 min收集细胞;加入800 μL细胞裂解液(50 mM Tris,pH8.0;150 mM NaCl;2 mM EDTA;1% NP40;含EDTA蛋白酶抑制剂一片),充分混匀后置于冰上裂解30 min后,4 ℃、12000 rpm离心10 min沉淀细胞碎片,将上清转移至1.5 mL EP管中,另取80 μL与20 μL 5×上样缓冲液混合均匀后,沸水浴5 min,作为全细胞裂解液样品,立即于-80 ℃保存;在剩余样品中加入20 μL偶联抗Flag抗体的琼脂糖珠,置于旋转混匀器上4 ℃孵育2 h进行免疫共沉淀。然后,4 ℃、5000g离心3 min后去除上清,并使用1 mL不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液将琼脂糖珠上未结合的蛋白洗净(洗涤3-5次),最终在收集到的琼脂糖珠中加入100 μL 1×上样缓冲液并混合均匀,沸水浴5 min后,4 ℃、12000 rpm离心3 min,取全部上清,与全细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹试验。
取5-15 μL免疫沉淀及全细胞裂解液样品进行SDS-PAGE电泳,电压初始设定为80V,待溴酚蓝指示剂迁移至分离胶后将电压调整为120 V,继续电泳至溴酚蓝迁移至丙烯酰胺凝胶底部即可停止电泳;将PVDF膜用甲醇激活30 s,并将滤纸在1×转膜缓冲液中(Tris碱 24 mM,甘氨酸192 mM,20%甲醇)浸泡20 min;电泳结束后按照从上至下滤纸-丙烯酰胺凝胶-PVDF膜-滤纸的顺序放置于半干转膜仪上,18 V转2 h;将转膜完成后的PVDF膜室温封闭1 h(含5%脱脂奶粉的TBST);1×TBST 洗涤三次,每次10 min;分别加入anti-Myc-HRP及anti-Flag-HRP抗体室温孵育1 h;1×TBST洗涤三次,每次10 min后进行ECL显影。
结果表明,在共同转染pCAGGs-Flag-Nsp13和pCMV-Myc-CREB1的细胞样品中,Flag-Nsp13的免疫沉淀产物中存在Myc-CREB1,同时在对照组(共同转染pCAGGs-Flag空载体和pCMV-Myc-CREB1的细胞)中,Flag的免疫沉淀产物中没有检测到Myc-CREB1;并且在转染pEGFP-Nsp13的细胞样品中,GFP-Nsp13的免疫沉淀产物中存在内源性的CREB1,同时在对照组(转染pEGFP的细胞)中,GFP的免疫沉淀产物中没有检测到内源性的CREB1。上述结果证实新型冠状病毒蛋白Nsp13与CREB1存在相互作用。
实施例2、免疫荧光检测Nsp13与CREB1在细胞内共定位
在六孔板中放入20 cm盖玻片,铺入约10% A549细胞(实验组及对照组细胞),待细胞贴壁后使用转染试剂TransIT-X2按照说明书进行转染,实验组每孔转染2 μg pEGFP-Nsp13,对照组不做处理,培养36 h后将盖玻片从培养皿中取出,并用1×PBS清洗三次,每次5 min,分别得到转染pEGFP-Nsp13的重组细胞及未经处理的对照组细胞(后续操作两组细胞均做相同处理);吸尽残留液体后,加入4%多聚甲醛室温固定10 min;PBS清洗三次后使用0.2% Triton X-100室温穿孔15 min;PBS清洗三次后使用5%山羊血清(使用PBS配制)室温封闭1 h;PBS清洗后加入anti-CREB1 Rabbit抗体(使用含2%山羊血清的PBS 1:50配制),4℃孵育过夜;1×PBS洗涤三次每次15 min;加入含有Tritc标记的二抗(使用含2%山羊血清的PBS 1:50配制),后续需避光操作,室温孵育1 h;1×PBS洗涤三次每次15 min;使用含有1μg/mL DAPI的封片液使其固定于载玻片上,静置15 min后在荧光共聚焦显微镜(CarlZeiss LSM800)下观察。
结果如图1所示,上图为转染pEGFP-Nsp13的重组细胞,下图为对照细胞的结果。左起第1列为GFP荧光蛋白(绿色)在细胞中的定位,第2列为anti-CREB1 Rabbit mAb及山羊抗兔IgG/TRITC抗体染色后的结果,即为细胞内源CREB1(红色)在细胞中的定位,第3列为DAPI染色的结果,即为细胞核(蓝色)的定位,第4列为前3列图片叠加,其中绿色与红色信号存在共定位。上述结果表明GFP-Nsp13(绿色)与CREB1(红色)共定位于细胞质中。
实施例3、Far-western blotting技术检测Nsp13与CREB1相互作用的结构域
1、构建GST融合表达的Nsp13及其截短、缺失突变体
质粒pGEX4T-1-Nsp13、pGEX4T-1-Nsp13△2A、pGEX4T-1-Nsp13△1A2A、pGEX4T-1-Nsp13 1A和pGEX4T-1-Nsp13 2A的构建步骤如下:
针对Nsp13各结构域基因序列,使用primer 5设计出扩增引物,扩增引物为:
Nsp13-F:5’-GGATCCGCTGTTGGGGCTTGTGTTCT-3’(SEQ ID No.13);
Nsp13-R:5’-CTCGAGTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACGT-3’(SEQ ID No.14);
Nsp13 △2A-F:5’-GGATCCGCTGTTGGGGCTTGTGTTCT-3’(SEQ ID No.13);
Nsp13 △2A-R:5’-CTCGAGCCGACAAGTTCCGAGGAACATG-3’(SEQ ID No.15);
Nsp13 △1A2A-F:5’-GGATCCGCTGTTGGGGCTTGTGTTCT-3’(SEQ ID No.13);
Nsp13 △1A2A-R:5’-CTCGAGCTCATCTGAGATATTGAGTGTTGG-3’(SEQ ID No.16);
Nsp13 1A-F:5’-GGATCCTTTTCTAGCAATGTTGCAAATTATCAAAAGGTTG-3’(SEQ IDNo.17);
Nsp13 1A-R:5’-CTCGAGCCGACAAGTTCCGAGGAACATG-3’(SEQ ID No.18);
Nsp13 2A-F:5’-GGATCCCGTTGTCCTGCTGAAATTGTTGAC -3’(SEQ ID No.19);
Nsp13 2A-R:5’-CTCGAGATTCCTACGTGGAATTTCAAGACTTGTAAATTG-3’(SEQ IDNo.20)。
其中下划线为酶切位点,PCR扩增目的片段,在37℃使用BamHI和XhoI对出发载体pGEX4T-1及扩增片段进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳后将酶切产物进行回收。使用T4连接酶将酶切后的片段和载体在16℃反应2h以上,转化DH5α感受态细胞,后将菌液均匀涂布在含有氨苄抗生素的固体LB培养基上。37℃培养12h后,挑取单个菌落在5mL含有抗生素的液体LB培养基中培养,提质粒后送北京擎科生物科技有限公司进行测序。
重组载体pGEX4T-1-Nsp13的结构描述如下:以核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子替换了pGEX4T-1载体的BamHI和XhoI识别位点之间的片段,并且保持pGEX4T-1载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
pGEX4T-1-Nsp13 △2A、pGEX4T-1-Nsp13 △1A2A、pGEX4T-1-Nsp13 1A和pGEX4T-1-Nsp13 2A与pGEX4T-1-Nsp13的区别仅在于:分别用SEQ ID No.12的第1至1326位的DNA分子、SEQ ID No.12的第1至783位的DNA分子、SEQ ID No.12的第784至1326位的DNA分子、SEQID No.12的第1327至1803位的DNA分子替换SEQ ID No.12,并且保持pGEX4T-1载体上其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
以GST-Nsp13融合蛋白的制备方法为例,先将1 μL质粒pGEX4T-1-Nsp13转化至50μL BL21菌株(擎科生物,目录号为TSC-E06)中并混匀,冰浴30 min后,42 ℃孵育90 s后立即置于冰上静置2 min,加入500 μL无抗LB培养基后,置于摇床37 ℃孵育30 min后,将全部菌液加入10 mL(含100 μg/mL氨苄霉素)LB培养基中置于摇床37 ℃孵育过夜;将菌液以1:100加入含有100 mL(含100 μg/mL氨苄霉素)LB培养基的锥形瓶中,置于摇床37 ℃培养2 h左右至对数生长期(A550值为0.5~1.0),加入IPTG至终浓度为0.5mM,置于摇床16 ℃低温诱导16 h,4500 rpm离心10 min收集菌体,获得重组大肠杆菌BL21/Nsp13。
重组大肠杆菌BL21/Nsp13△2A、BL21/Nsp13△1A2A、BL21/Nsp13 1A和BL21/Nsp132A的构建方法同重组大肠杆菌BL21/Nsp13,区别仅在于所转化的重组载体不同。
2、重组融合蛋白Nsp13的纯化
将重组大肠杆菌BL21/Nsp13用20 mL PBS清洗三次后,使用30 mL含有蛋白酶抑制剂的PBST重悬菌体进行超声裂解(需冰浴使样品处于低温环境);将超声探头伸入样品液面下约2 cm(大约10轮超声,每轮输出功率为3的超声暴露时间30 s,每轮超声间隔冷却时间30 s);完成超声后12000 rpm,4 ℃离心30 min后收集上清;每100 mL菌液产生的裂解液加入100 μL谷胱甘肽-琼脂糖树脂珠子(含有50%琼脂糖树脂珠的悬液);4 ℃条件下使用旋转混匀器轻轻混匀2 h使GST融合蛋白结合;500 g,4 ℃离心5 min后小心移除上清,在沉淀中加入10 mL的预冷PBST轻轻颠倒混匀以洗去未结合的蛋白质,500 g,4 ℃离心5 min后移除上清,清洗三次后加入100 μL PBS重悬珠子,得到含有GST-Nsp13的琼脂糖树脂并分装保存于-80 ℃。
取10 μL GST- Nsp13珠子,加入20 μL 1×上样缓冲液并混合均匀,沸水浴5 min后,4 ℃、12000 rpm离心3 min,取全部上清作为固定相样品。并将其经过SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜,将转膜完成后的PVDF膜置于4 ℃封闭液中待用。
采用上述同样的纯化步骤制备得到重组融合蛋白GST-Nsp13 △2A、GST-Nsp13 △1A2A、GST-Nsp13 1A和GST-Nsp13 2A。
3、Myc-CREB1蛋白的获得
在100 cm培养皿中的293T细胞中转染pCMV-Myc-CREB1质粒,转染后得到转染pCMV-Myc-CREB的重组细胞(将其命名为293T/CREB1)。将重组细胞293T/CREB1培养36-48 h后,将细胞重悬于预冷的PBS中,并使用PBS清洗两次,4 ℃、2000 rpm离心3 min收集细胞;加入1000 μL细胞裂解液,充分混匀后置于冰上裂解30 min后,4 ℃、12000 rpm离心10 min沉淀细胞碎片并将上清转移至EP管中;在样品中加入20 μL偶联抗Myc抗体的琼脂糖珠,置于旋转混匀器上4 ℃孵育2 h进行免疫共沉淀后,4 ℃、5000g离心3 min后去除上清,并使用1 mL不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液将琼脂糖珠上未结合的蛋白洗净(洗涤3-5次);使用洗脱缓冲液(含10 μg/mL Myc 肽的PBS)重悬珠子,置于旋转混匀器上4 ℃孵育1 h置换下Myc-CREB1蛋白;4 ℃、5000g离心3 min后转移上清至新的离心管中,使用1 mL PBS清洗珠子三次(4 ℃、5000g离心3 min),并保留全部上清;将全部收集的上清加15mL的10K超滤管中,室温下4000 g离心30 min将样品浓缩至约200 μL;将浓缩后样品使用15 mL PBST稀释,获得Myc-CREB1蛋白。
4、Far-western blotting技术检测蛋白Nsp13与CREB1相互作用
将前期置于封闭液中的PVDF膜(步骤2中获得的含有融合蛋白GST-Nsp13的PVDF膜)使用PBST清洗三次后,加入上述含有Myc-CREB1蛋白的PBST,4 ℃孵育过夜;将膜清洗三次后加入anti-Myc-HRP抗体室温孵育1 h;PBS洗涤三次后进行ECL显影。
Far-western blotting实验结果发现,在GST-Nsp13和GST-Nsp13 2A条带位置检测到Myc-CREB1的结合,并且在GST-Nsp13 1A结构域、GST-Nsp13缺失2A结构域、GST-Nsp13缺失1A2A结构域的突变体及GST蛋白的条带上均没有检测到Myc-CREB1蛋白的结合。上述实验证实Nsp13的2A结构域与CREB1之间存在直接相互作用。
实施例4、宿主CREB1促进Nsp13 ATP酶活性
1、Nsp13蛋白的纯化
本实施例使用谷胱甘肽亲和树脂纯化蛋白,具体操作方法如下,使用实施例3中得到的含有GST-Nsp13融合蛋白的琼脂糖树脂,采用还原性谷胱甘肽将蛋白进行洗脱;使用与沉降树脂体积等量的谷胱甘肽洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl,10 mM还原性谷胱甘肽,pH8.0)重悬树脂,使用旋转混匀器4 ℃孵育15 min后500 g离心5 min并保留含有GST-Nsp13及还原性谷胱甘肽的上清;重复上述操作三次后收集所得全部上清。
为去除GST标签对蛋白活性的干扰,使用凝血酶对GST标签进行切割;首先将全部样品使用15 mL的30K超滤管室温下4000 g离心30 min,去除还原型谷胱甘肽;将上管中收集到的液体转移至离心管中,加入80 μL凝血酶(80 U),室温孵育16 h;完成酶切反应后,在样品中加入100 μL谷胱甘肽-琼脂糖树脂珠子(含有50%琼脂糖树脂珠的悬液)室温孵育30min以去除切割下的GST蛋白,500 g离心5 min后收集上清,得到含有Nsp13蛋白的样品,使用0.5 mL的30 k超滤管14000 g离心15 min浓缩样品,并使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进行绝对定量。得到纯化的Nsp13蛋白,浓度为1.4 mg/mL。
2、CREB1对Nsp13蛋白ATP酶活性的影响
使用ATP酶活性检测试剂盒检测CREB1对Nsp13蛋白ATP酶活性的影响,具体操作如下:将5 μL Nsp13蛋白(溶于TBS,终浓度300 nM)与5 μL CREB1蛋白(溶于TBS,终浓度分别为150,250,350及450 nM)混合后于室温孵育10 min,将上述蛋白样品加入96孔板中(另取10 μLTBS作为阴性对照);将20 μL反应液与10 μL 4 mM ATP按照2:1混合均匀配置反应体系,每个孔中加入30 μL已配好的反应液,室温反应30 min后,使用排枪在每孔中加入200 μL检测液室温孵育30 min后,使用酶标仪检测620 nM处的吸光值,并根据标准曲线:y=0.0056x+0.0359(R2=0.9406),计算出磷酸基团(Pi)的释放量以代表其ATP酶活性。
上述TBS配制方法如下:先以少量双蒸水溶解9 g NaCl,再加入100 mL Tris-HCl(0.5M pH7.6)缓冲液,加双蒸水定容至1000ml,充分摇匀。
结果如图2所示,Nsp13的ATP酶活性随CRBE1加入浓度的升高显著上调,经体外实验进一步证实,CREB1会促进Nsp13的ATP酶活性。
实施例5、宿主CREB1促进Nsp13解旋酶活性
为检测Nsp13的解旋酶活性,使用基于荧光共振能量转移(FRET)的检测方法:合成两条互补DNA单链(SEQ ID No.21和SEQ ID No.22),SEQ ID No.21的3’端带有CY3修饰,SEQID No.22的5’端带有BHQ-2修饰,上述DNA单链分别配制为10 μM的母液;以1.2:1的比例混合后,加热至75 ℃并缓慢降温至4 ℃使其退火为双链,并分装保存于-80 ℃;还需合成一条与CY3链互补配对的DNA单链Capture(简称DNA-Capture),用于捕获在反应中从双链上解离下的DNA单链,避免其重新结合,影响检测。配制40 μL反应体系,含20 mM Tris-HCl、50mM NaCl、2 μM DNA-Capture、5 mM MgCl2、5 nM CREB1、2.5 nM Nsp13,将含有Nsp13蛋白的反应体系室温孵育10 min后;加入1 mM ATP及750 nM退火后的DNA双链并将样品加入黑色的384孔板中开始反应,37 ℃反应15 min后使用EnVision(PerkinElmer)检测荧光,激发波长为535 nm发射波长为580 nm。
所使用的DNA单链结构为:
DNA-CY3:5’-AGTCTTCTCCTGGTGCTCGAACAGACGC-CY3-3’(SEQ ID No.21);
DNA-BHQ-2:5’-BHQ-2-GCGTCTGTTCGAGCACCACCTCTTCTGA-3’(SEQ ID No.22);
DNA-Capture:5’-TGGTGCTCGAACAGACGC-3’(SEQ ID No.23)。
结果如图3所示,加入CREB1后,Nsp13对双链底物的解旋活性发生显著上调,进一步经体外实验证实,CREB1会促进Nsp13的解旋酶活性。
实施例6、敲低CREB1抑制冠状病毒的增殖
将H1299细胞传代至六孔板中(细胞贴壁后汇合度约为50%),待细胞贴壁后,使用TransIT-X2转染试剂将CREB1 siRNA转染至细胞中,将细胞分为5组,分别为ScramblesiRNA(阴性对照)、siRNA 0.075 nmol组、siRNA 0.15 nmol组、siRNA 0.3 nmol组,Remdesivir(10 μM)组(阳性对照),每组做8个复孔。
Scramble siRNA(0.15 nmol)组:每孔添加2 mL完全培养基及100 μL ScramblesiRNA溶液(由Opti-MEM,TransIT-X2和Scramble siRNA组成),使培养体系中ScramblesiRNA的含量为0.15 nmol,37℃培养24 h后,更换为完全培养基后并同时感染新型冠状病毒互补系统;37℃培养48 h后,按照下述方法进行病毒RNA含量进行测定。
siRNA(0.075 nmol)组:每孔添加2 mL完全培养基及100 μL siRNA溶液(由Opti-MEM,TransIT-X2和CREB1 siRNA组成),使培养体系中siRNA的含量为0.075 nmol,37℃培养24 h后,更换为完全培养基并同时感染新型冠状病毒互补系统;37℃培养48 h后,按照下述方法进行病毒RNA含量进行测定。
siRNA(0.15 nmol)组:与0.075 nmol组的区别仅在于培养体系中CREB1 siRNA的含量为0.15 nmol,其它操作均相同。
siRNA(0.3 nmol)组:与0.075 nmol组的区别仅在于培养体系中CREB1 siRNA的含量为0.3 nmol,其它操作均相同。
Remdesivir(10 μM)组:每孔添加2 mL完全培养基及2 μL Remdesivir溶液(由DMSO和Remdesivir组成,母液浓度为10 mM),使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,37℃培养24 h后,更换为完全培养基并同时感染新型冠状病毒互补系统;感染48 h后,按照下述方法进行病毒RNA含量进行测定。
所使用的CREB1 siRNA序列信息如下:
5’-GGCCUGCAAACAUUAACCATT-3’;(SEQ ID No.1)
5’-UGGUUAAUGUUUGCAGGCCTT-3’(SEQ ID No.2)
本实验中人非小细胞肺癌细胞H1299感染的新型冠状病毒序列为GenBank:MN908947(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947),37 ℃培养48 h后收集细胞,并提取病毒全细胞RNA。
使用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取RNA;使用350 μL AVL溶液重悬细胞并充分混匀,室温孵育10 min后,加入350 μL无水乙醇并混合均匀;将全部溶液分次转移至过滤柱中,6000 g离心1 min并弃去滤液,待全部样品过滤完成后,加入500 μL溶液AW1,6000 g离心1 min并弃去滤液;加入500 μL溶液AW2,14000 rpm离心3 min并弃去滤液,为更好地去除废液再将其14000 rpm离心1 min;将过滤柱放入新的离心管中,并在滤膜上加入60 μL DEPC水,室温静置1 min后6000 g离心1 min,离心管中即可收得含有病毒全细胞RNA的样品。
按照新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)说明书对样品中的新冠病毒RNA含量进行测定:将13.5 μL PCR反应液A与1.5 μL PCR反应液B混匀并3000 rpm离心数秒得到PCR反应液;将15 μL PCR反应液与15 μL样品混合均匀后加入96孔板中,将96孔板2000 rpm离心1 min后,使用BIO-RAD CFX96real-Time System进行PCR扩增检测;循环参数为:50 ℃、20 min;95 ℃、3 min;95 ℃、15 s、55 ℃、30 s(40个循环,并在55 ℃收集荧光信号);25 ℃、10 s。
使用GoTaq 1-Step RT-qPCR System试剂盒对CREB1表达水平进行检测。
CREB1与内参GAPDH表达水平使用GoTaq 1-Step RT-qPCR System试剂盒进行检测,按照说明书配制20 μL反应体系,每20 μL反应样品中含有1 μL RNA样品;将样品一次加入96孔板中,将96孔板2000 rpm离心1 min后,使用BIO-RAD CFX96real-Time System进行PCR扩增检测;循环参数为:45 ℃、5 min;95 ℃、10 s;95 ℃、10 s、60 ℃、30 s、72 ℃、30s(30个循环,并在60 ℃收集荧光信号)。
qPCR引物如下:
CREB1-F:5’-TTAACCATGACCAATGCAGCA-3’(SEQ ID No.24);
CREB1-R:5’-TGGTATGTTTGTACGTCTCCAGA-3’(SEQ ID No.25);
GAPDH-F:5’-GGCCGCAACCAAAATTCAGG-3’(SEQ ID No.26);
GAPDH-F:5’-CGGCAGTAGTGGTGCCTTC-3’(SEQ ID No.27)。
结果如图4所示,随着细胞内CREB1表达水平的降低,新型冠状病毒互补系统在细胞内的增殖水平显著受到抑制。
实施例7、CREB1抑制剂666-15显著抑制新型冠状病毒增殖
1、CREB1抑制剂666-15抑制新型冠状病毒增殖研究
本实施例中所有与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)活病毒相关的实验均在生物安全三级实验室(ABSL3)完成。
1)666-15对新型冠状病毒--新型冠状病毒互补系统的抑制作用
将H1299细胞传入十二孔板(总体积1mL)中,每孔2×105个细胞,37 ℃培养24h后进行加药处理,分别为:DMSO组(阴性对照)、0.0625 μM组、0.25 μM、组、1 μM组、2 μM组、4 μM组和Remdesivir(10 μM)组(阳性对照),每组做8个复孔。
DMSO组:每孔添加1 μL DMSO,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μLDMSO,并同时感染新型冠状病毒互补系统,感染48 h后,按照实施例6的方法进行新冠病毒RNA含量测定。
0.0625 μM组:每孔添加1 μL 666-15溶液(由DMSO和666-15组成,母液浓度62.5 μM),使培养体系中666-15的含量为0.0625 μM,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μL 666-15,使培养体系中666-15含量为0.0625 μM,并同时感染新型冠状病毒互补系统,感染48 h后,按照实施例6的方法进行病毒RNA含量测定。
0.25 μM组:与0.0625 μM组的区别仅在于培养体系中666-15的含量为0.25 μM,其它操作均相同。
1 μM组:与0.0625 μM组的区别仅在于培养体系中666-15的含量为1μM,其它操作均相同。
2 μM组:与0.0625 μM组的区别仅在于培养体系中666-15的含量为2 μM,其它操作均相同。
4 μM组:与0.0625 μM组的区别仅在于培养体系中666-15的含量为4 μM,其它操作均相同。
Remdesivir(10 μM)组:每孔添加1 μL Remdesivir溶液(由DMSO和Remdesivir组成,母液浓度为10 mM),使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μL Remdesivir,使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,并同时感染新型冠状病毒互补系统,感染48 h后,按照实施例6的方法进行病毒RNA含量测定。
2)666-15对新型冠状病毒SARS-CoV-2 WIV04株的抑制作用
将H1299细胞传入十二孔板(总体积1mL)中,每孔2×105个细胞,37 ℃培养24h后进行加药处理,将细胞分为4组,分别为:DMSO组(阴性对照)、1 μM组、2 μM组、Remdesivir(10 μM)组(阳性对照),每组做8个复孔。
DMSO组:每孔添加1 μL DMSO,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μLDMSO,并同时感染SARS-CoV-2 WIV04株,感染48 h后,按照实施例6的方法进行新冠病毒RNA含量测定。
1μM组:每孔添加1 μL 666-15溶液(由DMSO和666-15组成,母液浓度为 1 mM),使培养体系中666-15的含量为1μM,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μL 666-15,并同时感染SARS-CoV-2 WIV04株,感染48 h后,按照实施例6的方法进行新冠病毒RNA含量测定。
2 μM组:与1 μM组的区别仅在于培养体系中666-15的含量为2 μM,其它操作均相同。
Remdesivir(10 μM)组:每孔添加1 μL Remdesivir溶液(由DMSO和Remdesivir组成,母液浓度为 10 mM),使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μL Remdesivir,使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,并同时感染新型冠状病毒SARS-CoV-2 WIV04株,感染48 h后,按照实施例6的方法进行病毒RNA含量测定。
3)666-15对新型冠状病毒SARS-CoV-2 Omicron株的抑制作用
将H1299细胞传入十二孔板(总体积1mL)中,每孔2×105个细胞,37 ℃培养24h后进行加药处理,将细胞分为4组,分别为:DMSO组(阴性对照)、1 μM组、2 μM组、Remdesivir(10 μM)组(阳性对照),每组做8个复孔。
DMSO组:每孔添加1 μL DMSO,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μLDMSO,并同时感染SARS-CoV-2 Omicron株,感染48 h后,按照实施例6的方法进行新冠病毒RNA含量测定。
1μM组:每孔添加1 μL 666-15溶液(由DMSO和666-15组成,母液浓度为1 mM),使培养体系中666-15的含量为1μM,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μL 666-15,并同时感染SARS-CoV-2 Omicron株,感染48 h后,按照实施例6的方法进行新冠病毒RNA含量测定。
2μM组:与1μM组的区别仅在于培养体系中666-15的含量为2μM,其它操作均相同。
Remdesivir(10 μM)组:每孔添加1 μL Remdesivir溶液(由DMSO和Remdesivir组成,母液浓度为10 mM),使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,37 ℃培养24 h后,更换完全培养基,每孔添加1 μL Remdesivir使培养体系中Remdesivir的含量为10 μM,并同时感染新型冠状病毒SARS-CoV-2 Omicron株,感染48 h后,按照实施例6的方法进行病毒RNA含量测定。
结果如图5中a、b和c所示:使用CREB1抑制剂666-15能显著抑制新型冠状病毒在细胞内的增殖水平,其IC50为0.703 μM,且2 μM的666-15抑制效果与10 μM Remdesivir相当。
2、CCK8检测不同浓度666-16药物的细胞毒性
以DMSO作为对照组。在96孔板中接种293T细胞,每孔接种5×103个细胞,及100 μL培养基。24 h后更换培养基并加入实验组666-15(666-15添加浓度分别为0.0625 μM、0.25μM、1 μM、2 μM、4 μM)及对照组DMSO,每组做8个复孔;37 ℃培养48 h后,向各孔中加入10 μL CCK8溶液;并于37 ℃孵育1 h后,使用酶标仪测定450 nm吸光值;并通过公式:细胞存活率=实验组/对照组×100%,计算出各样品中细胞存活率。
结果如图5中a折线图所示,添加不同浓度的666-15对细胞活力没有显著影响。
实施例8、CREB1抑制剂对新型冠状病毒鼠适应株感染小鼠的预防感染效果
本实施例中所有与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)鼠适应株C57MA14相关的实验均在生物安全三级实验室(ABSL3)完成。
含666-15的液体配制方法:取5 mg 666-15使用1 mL DMSO充分混匀后,加入4 mLPEG300,充分混匀后加入4.5 mL生理盐水,充分混匀后,加入0.5 mL Tween80,充分混匀,得到含666-15的液体。
10% DMSO液体配制方法:将1 mL DMSO与4 mL PEG300充分混匀后加入4.5 mL生理盐水,充分混匀后,加入0.5 mL Tween80,充分混匀,得到10% DMSO液体。
22只6-8周的健康BALB/c小鼠(购买于北京维通利华),体重为20-30g,随机分为两组,每组11只:
1)实验组:每只每次腹腔注射上述含666-15的液体,使666-15的给药剂量为2 mg/kg,连续给药三次,每次给药间隔24 h,在第3次给药同时用新型冠状病毒鼠适应株C57MA14进行鼻滴感染,感染剂量为1×LD50,以感染当天记为第0天,每天记录各组死亡情况;感染十天后处死小鼠,结束实验。
2)对照组:每只每次腹腔注射上述10% DMSO液体,使DMSO的给药剂量为与实验组中的体积相同,连续给药三次,每次给药间隔24 h,在第3次给药同时用新型冠状病毒鼠适应株C57MA14进行鼻滴感染,感染剂量为1×LD50,以感染当天记为第0天,每天记录各组死亡情况;感染十天后处死小鼠,结束实验。
结果如图6所示:使用新冠病毒鼠适应株C57MA14感染小鼠后第10天,对照组的11只小鼠中死亡7只,存活2只(在感染时因鼻滴导致两只小鼠死亡),其存活率为22.2%;实验组的11只小鼠中死亡2只,存活9只,其存活率为81.8%。结果表明,经过666-15预处理三天后的小鼠在新型冠状病毒感染后死亡率显著降低。
综上所述,CREB1可作为新型冠状病毒病治疗靶点。新型冠状病毒非结构蛋白Nsp13与宿主转录因子CREB1存在直接相互作用,并且CREB1会促进Nsp13的ATP酶活性及解旋酶活性;敲低CREB1及使用CREB1抑制剂666-15能够显著抑制新型冠状病毒在细胞中的增殖;在动物水平,CREB1抑制剂666-15可以显著降低新型冠状病毒鼠适应株感染小鼠的致死率。
同时本发明利用CCK8检测方法对666-15进行细胞毒性检测发现,666-15在培养基中浓度低于4 μM时表现极低的细胞毒性,以上结果提示宿主CREB1可以作为新型冠状病毒防治的靶点,利用CREB1的抑制剂666-15可作为冠状病毒防治候选药物用于新型冠状病毒感染的治疗。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (1)
1.应用,其特征在于,所述应用为下述任一种:
1)抑制CREB1基因表达的物质在制备新型冠状病毒抑制剂或新型冠状病毒复制抑制剂中的应用;
2)抑制CREB1基因表达的物质在制备治疗新型冠状病毒感染或/和预防新型冠状病毒感染的药物中的应用;
3)抑制CREB1蛋白活性的物质在制备新冠病毒抑制剂中的应用;
4)抑制CREB1蛋白活性的物质在制备治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物中的应用;
5)降低CREB1蛋白含量的物质在制备新冠病毒抑制剂中的应用;
6)降低CREB1蛋白含量的物质在制备治疗新冠病毒感染或/和预防新冠病毒感染的药物中的应用;
所述抑制CREB1基因表达的物质、抑制CREB1蛋白活性的物质或降低CREB1蛋白含量的物质为下述任一种:
1)666-15;
2)siRNA,所述siRNA为由核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的双链RNA分子。
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