CN114634928B - 一种降低stat3转录功能的核酸片段及其制药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降低STAT3转录功能的核酸片段及其制药用途，属于肿瘤、自身免疫疾病和神经疾病用药物领域。所述核酸片段包括依次直接或间接连接的启动子序列、KRAB序列、Linker序列、STAT3序列；所述启动子序列是可被STAT3识别而起始转录的启动子序列。本发明还公开了前述核酸片段用于制备治疗肿瘤、自身免疫疾病或神经退行性疾病的药物中的用途。本发明的核酸片段可特异性表达于STAT3转录功能异常激活的细胞，降低STAT3下游基因的表达，以产生治疗肿瘤、自身免疫疾病或神经退行性疾病的作用。

Description

一种降低STAT3转录功能的核酸片段及其制药用途
技术领域
本发明属于肿瘤、自身免疫病和神经疾病用药物领域。
背景技术
STAT3是重要的JAK-STAT信号通路成员，正常情况下，STAT3位于细胞质，不发挥转录功能。当STAT3接受到上游激活信号，如IL-6，EGF，FGF，IFN-β等，STAT3被磷酸化激活形成二聚体，并迅速从细胞质转移至细胞核，与靶基因启动子区结合，作为转录因子激活下游靶基因表达(即发挥转录功能)。这些靶基因包括促进增殖的Myc、Cyclin D1/D2，促进肿瘤转移的MMP2，促进炎症的IL-6，抑制细胞凋亡的BCL-xl、Survivin等。因此，STAT3转录功能异常升高是引发自身免疫病、肿瘤及神经退行性疾病等多种疾病的关键因素，阻止STAT3发挥转录功能可治疗自身免疫病、肿瘤及神经退行性疾病。
目前针对STAT3磷酸化的小分子抑制剂有STAT3-IN-1、S3I-201、WP1066、Stattic等，针对STAT3与DNA结合的抑制剂有STA-21等，但这些小分子抑制剂存在未知靶点的可能性，副作用风险较大。
有研究者最近开发了利用PROTAC技术直接降解STAT3的方法，然而STAT3蛋白在转录功能之外，还有调控线粒体及溶酶体活性等功能。此外，STAT3对细胞正常功能发挥至关重要，研究发现，敲除STAT3基因导致小鼠胚胎致死，在T细胞中特异性敲除STAT3引起小鼠免疫功能异常。因此，直接将STAT3蛋白从细胞中清除的做法具有一定安全隐患。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种抑制STAT3转录功能异常升高的DNA。
本发明的技术方案如下：
一种降低STAT3转录功能的核酸片段，所述核酸片段包括依次直接或间接连接的启动子序列、KRAB序列、Linker序列、STAT3序列；
所述启动子序列是可被STAT3识别而起始转录的启动子序列；
所述KRAB序列是转录抑制因子Krüppel-Associated Box；
所述Linker序列是长度为3～300bp的随机核酸序列；
所述STAT3序列是STAT3基因序列(有内含子)，或STAT3基因mRNA的cDNA序列(无内含子)；
所述间接连接指通过核酸内切酶酶切位点序列连接。
进一步地，所述启动子序列是GAS序列或2个以上GAS序列通过随机序列相连组成的序列；优选地，所述启动子序列为2个GAS序列通过随机序列相连组成的序列；
所述随机序列的长度为5～15bp。
进一步地，所述启动子序列为CGATTTCCGGGAACCACTGTACATTCCGGGAAG(SEQ IDNO.1)；
和/或，所述KRAB序列为：
ATGGGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTGTTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCCTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTG(SEQ ID NO.2)；
和/或，所述Linker序列为：
TCAAGTCGGACTGTAACAACTGGTGGAAGTAACTTACATGGTTCATTAGGTCATGTCAGTCTACC(SEQID NO.3)；
和/或，所述STAT3序列为：
CTGGCCCAATGGAATCAGCTACAGCAGCTTGACACACGGTACCTGGAGCAGCTCCATCAGCTCTACAGTGACAGCTTCCCAATGGAGCTGCGGCAGTTTCTGGCCCCTTGGATTGAGAGTCAAGATTGGGCATATGCGGCCAGCAAAGAATCACATGCCACTTTGGTGTTTCATAATCTCCTGGGAGAGATTGACCAGCAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAATGTTCTCTATCAGCACAATCTACGAAGAATCAAGCAGTTTCTTCAGAGCAGGTATCTTGAGAAGCCAATGGAGATTGCCCGGATTGTGGCCCGGTGCCTGTGGGAAGAATCACGCCTTCTACAGACTGCAGCCACTGCGGCCCAGCAAGGGGGCCAGGCCAACCACCCCACAGCAGCCGTGGTGACGGAGAAGCAGCAGATGCTGGAGCAGCACCTTCAGGATGTCCGGAAGAGAGTGCAGGATCTAGAACAGAAAATGAAAGTGGTAGAGAATCTCCAGGATGACTTTGATTTCAACTATAAAACCCTCAAGAGTCAAGGAGACATGCAAGATCTGAATGGAAACAACCAGTCAGTGACCAGGCAGAAGATGCAGCAGCTGGAACAGATGCTCACTGCGCTGGACCAGATGCGGAGAAGCATCGTGAGTGAGCTGGCGGGGCTTTTGTCAGCGATGGAGTACGTGCAGAAAACTCTCACGGACGAGGAGCTGGCTGACTGGAAGAGGCGGCAACAGATTGCCTGCATTGGAGGCCCGCCCAACATCTGCCTAGATCGGCTAGAAAACTGGATAACGTCATTAGCAGAATCTCAACTTCAGACCCGTCAACAAATTAAGAAACTGGAGGAGTTGCAGCAAAAAGTTTCCTACAAAGGGGACCCCATTGTACAGCACCGGCCGATGCTGGAGGAGAGAATCGTGGAGCTGTTTAGAAACTTAATGAAAAGTGCCTTTGTGGTGGAGCGGCAGCCCTGCATGCCCATGCATCCTGACCGGCCCCTCGTCATCAAGACCGGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCAGGTTGCTGGTCAAATTCCCTGAGTTGAATTATCAGCTTAAAATTAAAGTGTGCATTGACAAAGACTCTGGGGACGTTGCAGCTCTCAGAGGATCCCGGAAATTTAACATTCTGGGCACAAACACAAAAGTGATGAACATGGAAGAATCCAACAACGGCAGCCTCTCTGCAGAATTCAAACACTTGACCCTGAGGGAGCAGAGATGTGGGAATGGGGGCCGAGCCAATTGTGATGCTTCCCTGATTGTGACTGAGGAGCTGCACCTGATCACCTTTGAGACCGAGGTGTATCACCAAGGCCTCAAGATTGACCTAGAGACCCACTCCTTGCCAGTTGTGGTGATCTCCAACATCTGTCAGATGCCAAATGCCTGGGCGTCCATCCTGTGGTACAACATGCTGACCAACAATCCCAAGAATGTAAACTTTTTTACCAAGCCCCCAATTGGAACCTGGGATCAAGTGGCCGAGGTCCTGAGCTGGCAGTTCTCCTCCACCACCAAGCGAGGACTGAGCATCGAGCAGCTGACTACACTGGCAGAGAAACTCTTGGGACCTGGTGTGAATTATTCAGGGTGTCAGATCACATGGGCTAAATTTTGCAAAGAAAACATGGCTGGCAAGGGCTTCTCCTTCTGGGTCTGGCTGGACAATATCATTGACCTTGTGAAAAAGTACATCCTGGCCCTTTGGAACGAAGGGTACATCATGGGCTTTATCAGTAAGGAGCGGGAGCGGGCCATCTTGAGCACTAAGCCTCCAGGCACCTTCCTGCTAAGATTCAGTGAAAGCAGCAAAGAAGGAGGCGTCACTTTCACTTGGGTGGAGAAGGACATCAGCGGTAAGACCCAGATCCAGTCCGTGGAACCATACACAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCATTTGCTGAAATCATCATGGGCTATAAGATCATGGATGCTACCAATATCCTGGTGTCTCCACTGGTCTATCTCTATCCTGACATTCCCAAGGAGGAGGCATTCGGAAAGTATTGTCGGCCAGAGAGCCAGGAGCATCCTGAAGCTGACCCAGGTAGCGCTGCCCCATACCTGAAGACCAAGTTTATCTGTGTGACACCAACGACCTGCAGCAATACCATTGACCTGCCGATGTCCCCCCGCACTTTAGATTCATTGATGCAGTTTGGAAATAATGGTGAAGGTGCTGAACCCTCAGCAGGAGGGCAGTTTGAGTCCCTCACCTTTGACATGGAGTTGACCTCGGAGTGCGCTACCTCCCCCATG(SEQ ID NO.4)。
进一步地，所述片段包括依次直接或间接连接的启动子序列、KRAB序列、Linker序列、STAT3序列、蛋白纯化检测用标签序列。
进一步地，所述核酸片段的序列为：
ATCGATTTCCGGGAACCACTGTACATTCCGGGAAGAATTCGCCACCATGGGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTGTTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCCTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGCTCGAGTCAAGTCGGACTGTAACAACTGGTGGAAGTAACTTACATGGTTCATTAGGTCATGTCAGTCTACCGCGGCCGCTGGCCCAATGGAATCAGCTACAGCAGCTTGACACACGGTACCTGGAGCAGCTCCATCAGCTCTACAGTGACAGCTTCCCAATGGAGCTGCGGCAGTTTCTGGCCCCTTGGATTGAGAGTCAAGATTGGGCATATGCGGCCAGCAAAGAATCACATGCCACTTTGGTGTTTCATAATCTCCTGGGAGAGATTGACCAGCAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAATGTTCTCTATCAGCACAATCTACGAAGAATCAAGCAGTTTCTTCAGAGCAGGTATCTTGAGAAGCCAATGGAGATTGCCCGGATTGTGGCCCGGTGCCTGTGGGAAGAATCACGCCTTCTACAGACTGCAGCCACTGCGGCCCAGCAAGGGGGCCAGGCCAACCACCCCACAGCAGCCGTGGTGACGGAGAAGCAGCAGATGCTGGAGCAGCACCTTCAGGATGTCCGGAAGAGAGTGCAGGATCTAGAACAGAAAATGAAAGTGGTAGAGAATCTCCAGGATGACTTTGATTTCAACTATAAAACCCTCAAGAGTCAAGGAGACATGCAAGATCTGAATGGAAACAACCAGTCAGTGACCAGGCAGAAGATGCAGCAGCTGGAACAGATGCTCACTGCGCTGGACCAGATGCGGAGAAGCATCGTGAGTGAGCTGGCGGGGCTTTTGTCAGCGATGGAGTACGTGCAGAAAACTCTCACGGACGAGGAGCTGGCTGACTGGAAGAGGCGGCAACAGATTGCCTGCATTGGAGGCCCGCCCAACATCTGCCTAGATCGGCTAGAAAACTGGATAACGTCATTAGCAGAATCTCAACTTCAGACCCGTCAACAAATTAAGAAACTGGAGGAGTTGCAGCAAAAAGTTTCCTACAAAGGGGACCCCATTGTACAGCACCGGCCGATGCTGGAGGAGAGAATCGTGGAGCTGTTTAGAAACTTAATGAAAAGTGCCTTTGTGGTGGAGCGGCAGCCCTGCATGCCCATGCATCCTGACCGGCCCCTCGTCATCAAGACCGGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCAGGTTGCTGGTCAAATTCCCTGAGTTGAATTATCAGCTTAAAATTAAAGTGTGCATTGACAAAGACTCTGGGGACGTTGCAGCTCTCAGAGGATCCCGGAAATTTAACATTCTGGGCACAAACACAAAAGTGATGAACATGGAAGAATCCAACAACGGCAGCCTCTCTGCAGAATTCAAACACTTGACCCTGAGGGAGCAGAGATGTGGGAATGGGGGCCGAGCCAATTGTGATGCTTCCCTGATTGTGACTGAGGAGCTGCACCTGATCACCTTTGAGACCGAGGTGTATCACCAAGGCCTCAAGATTGACCTAGAGACCCACTCCTTGCCAGTTGTGGTGATCTCCAACATCTGTCAGATGCCAAATGCCTGGGCGTCCATCCTGTGGTACAACATGCTGACCAACAATCCCAAGAATGTAAACTTTTTTACCAAGCCCCCAATTGGAACCTGGGATCAAGTGGCCGAGGTCCTGAGCTGGCAGTTCTCCTCCACCACCAAGCGAGGACTGAGCATCGAGCAGCTGACTACACTGGCAGAGAAACTCTTGGGACCTGGTGTGAATTATTCAGGGTGTCAGATCACATGGGCTAAATTTTGCAAAGAAAACATGGCTGGCAAGGGCTTCTCCTTCTGGGTCTGGCTGGACAATATCATTGACCTTGTGAAAAAGTACATCCTGGCCCTTTGGAACGAAGGGTACATCATGGGCTTTATCAGTAAGGAGCGGGAGCGGGCCATCTTGAGCACTAAGCCTCCAGGCACCTTCCTGCTAAGATTCAGTGAAAGCAGCAAAGAAGGAGGCGTCACTTTCACTTGGGTGGAGAAGGACATCAGCGGTAAGACCCAGATCCAGTCCGTGGAACCATACACAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCATTTGCTGAAATCATCATGGGCTATAAGATCATGGATGCTACCAATATCCTGGTGTCTCCACTGGTCTATCTCTATCCTGACATTCCCAAGGAGGAGGCATTCGGAAAGTATTGTCGGCCAGAGAGCCAGGAGCATCCTGAAGCTGACCCAGGTAGCGCTGCCCCATACCTGAAGACCAAGTTTATCTGTGTGACACCAACGACCTGCAGCAATACCATTGACCTGCCGATGTCCCCCCGCACTTTAGATTCATTGATGCAGTTTGGAAATAATGGTGAAGGTGCTGAACCCTCAGCAGGAGGGCAGTTTGAGTCCCTCACCTTTGACATGGAGTTGACCTCGGAGTGCGCTACCTCCCCCATGGGATCCGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGA(SEQ ID NO.5)。
一种重组质粒，所述重组质粒携带前述的核酸片段。
一种重组病毒，所述重组病毒是携带前述核酸片段的病毒。
一种治疗肿瘤、自身免疫疾病或神经退行性疾病的药物，所述药物以前述的核酸片段为活性成分。
进一步地，所述肿瘤为子宫颈癌、肺癌、黑色素瘤、头颈鳞癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、白血病、肾癌、睾丸癌、胰腺癌或脑胶质瘤；
所述自身免疫疾病为：类风湿性关节炎、银屑病、进行性系统性硬化症、系统性红斑狼疮、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、1型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、寻常天疱疮、类天疱疮、肺出血肾炎综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症或急性特发性多神经炎；
所述神经退行性疾病为：脑损伤、脑缺血、癫痫；阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病或脊髓小脑共济失调。
前述的核酸片段、重组载体或重组病毒在制备治疗肿瘤、自身免疫疾病或神经退行性疾病的药物中的用途。
进一步地，所述肿瘤为子宫颈癌、肺癌、黑色素瘤、头颈鳞癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、白血病、肾癌、睾丸癌、胰腺癌或脑胶质瘤；
所述自身免疫疾病为：类风湿性关节炎、银屑病、进行性系统性硬化症、系统性红斑狼疮、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、1型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、寻常天疱疮、类天疱疮、肺出血肾炎综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症或急性特发性多神经炎；
所述神经退行性疾病为：脑损伤、脑缺血、癫痫；阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病或脊髓小脑共济失调。
术语解释：
GAS(Gamma interferon Activation Site)序列是STAT3入核后结合的靶基因启动子区核心序列(TTCCGGGAA)。因此，GAS下游的基因只有在STAT3激活后才会被转录。2×GAS为2个GAS序列由一段随机序列(本发明中该随机序列长度10nt)相连组成的序列。
KRAB(Krüppel-Associated Box)是重要的转录抑制因子，已被用于与dCas9蛋白融合，抑制靶基因转录。
3×Flag为3个Flag序列组成的一段短肽，由于体积较小，不影响目的蛋白功能。与目的蛋白连接后，可被特异性抗体识别，用于判断融合蛋白的表达。
本发明的工作原理为：在STAT3转录功能激活的细胞内，本发明降低STAT3转录功能的核酸片段(简称“本发明的核酸片段”)的启动子序列会被细胞自带的STAT3启动表达，产生融合蛋白，融合蛋白位于细胞质；当正常STAT3被激活(磷酸化后暴露入核信号)进入细胞核后，融合蛋白也会被磷酸化激活，像木马一样，混入正常STAT3蛋白中，一起进入细胞核；融合蛋白的STAT3序列虽然也具有转录功能，但融合蛋白的KRAB序列会随着STAT3结合到靶基因(Myc、MMP2、cyclinD1、BCL-xl、Survivin等)而来到靶基因附近，招募转录抑制因子，抑制靶基因的转录。该过程中，融合蛋白像“木马”一样，伪装成STAT3，但抑制了STAT3靶基因的表达；而本发明的核酸片段的启动子序列则决定了该“木马”仅在STAT3激活的细胞内释放，做到精准调控。
同时，融合蛋白也会反过来识别本发明的核酸片段的启动子，降低其表达水平，这样就可实现负反馈调节，不至于该核酸片段表达过多，影响细胞正常功能。
总之，本发明的核酸片段可以特异性地在STAT3转录功能激活的细胞内表达，进入细胞核，抑制STAT3的靶基因表达，从整个细胞的水平上表现为STAT3转录功能的降低。本发明的核酸片段不会直接针对STAT，且存在负反馈调节，不会剧烈影响细胞的生活状态，总体安全可靠。
实验表明，本发明的核酸片段通过载体病毒载体或脂质体载体进入STAT3转录功能激活细胞表达后，细胞的STAT3转录功能受到抑制，STAT3下游靶基因明显下调表达。基于该原理，本发明的核酸片段可对肿瘤、自身免疫疾病、神经退行性疾病具有治疗效果。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：通过慢病毒过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag抑制宫颈癌细胞本底STAT3转录活性。a，Hela细胞中STAT3下游基因表达情况；b，IL-6刺激下HEK293细胞中STAT3下游基因表达情况。
图2：通过腺病毒过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag抑制肺癌细胞本底STAT3转录活性。a，H1299细胞中STAT3下游基因表达情况；b，荧光素酶报告基于检测信号；c，2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag以及STAT3下游靶基因c-Myc表达情况的免疫荧光检测。
图3：通过PEI过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的表达减少细胞对IL-6刺激的响应。
图4：通过腺相关病毒AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag治疗减少肿瘤细胞增殖。
图5：通过腺相关病毒AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag治疗抑制肿瘤体积增长。a，肿瘤外观比较；b，肿瘤重量比较。
图6：通过腺相关病毒AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag治疗延长荷瘤小鼠生存期。
图7通过腺相关病毒AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag治疗减轻系统性红斑狼疮症状。a，体重变化曲线；b，血清抗dsDNA IgG含量。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag引起肿瘤细胞STAT3转录功能缺失
一、实验方法
1、细胞培养
HEK293T及HEK293、HELA等细胞购自ATCC，使用DMEM高糖培养基培养，加入10％胎牛血清和1％青链霉素。细胞于37℃细胞培养箱中培养，CO2浓度为5％。细胞生长密度接近90％即进行传代。每个月使用试剂盒鉴定一次支原体，确保细胞没有支原体感染。保种的细胞使用75cm一次性细胞培养瓶培养，其余细胞使用不同规格培养皿培养。
2、载体构建
(1)细胞RNA提取
用10cm细胞培养皿培养HEK293细胞或HELA细胞，待细胞密度接近70％时，取出培养皿，倒掉细胞培养基，用无菌PBS(灭菌后加入1％双抗，4℃暂存，1周内使用，pH 7.2)快速洗涤3次后，加入1ml TRZOL。用细胞刮铲迅速挂下细胞，用1ml移液枪(RNase free)转移至1.5ml EP管(RNase free)中，冰上放置5min。加入200μl氯仿，混匀后，冰上放置5min后，观察液体分层情况，如果分层良好，则进行下一步操作。将EP管放入提前预冷的4℃离心机中，12000g，4℃离心10min。离心结束后，取出EP管，轻轻吸取400μl上层无色透明液体至新1.5ml EP管(RNase free)中，加入等体积提前预冷的异丙醇(400μl)，上下颠倒混匀后，于冰上放置10min，之后于4℃离心机中离心12000g，3min。离心结束后，取出EP管，观察EP管底部是否存在白色沉淀，如果存在白色沉淀，即为RNA。轻轻吸走管内液体，向EP管中加入1ml提前预冷的75％乙醇，用移液枪吹打沉淀，至沉淀离开EP管底部。之后于4℃离心机中离心，12000g，5min。尽量全部吸走上清(乙醇)，在通风厨中打开EP管盖子，晾干残留酒精后，加入20μl双蒸水(RNase free)，用移液枪反复吹打至完全溶解。取2μl至新EP管中用于浓度检测，浓度检测后立即进行逆转录操作。
(2)DNA及RNA的浓度测定
使用Thermo公司Nano Drop One仪器进行检测。
DNA浓度检测：开机自检后，选择双链DNA选项，自检完成后，加入1μl与待测样品一致的溶剂，进行背景去除操作，背景去除后，用吸水纸擦掉残留液体，加入1μl待测样品进行检测，读出值即为DNA浓度。同时通过观察260nm/280nm的吸收峰之间的比值判断是否有DNA污染，比值为1.7-1.9之间为DNA，比值大于1.9为RNA。
RNA浓度检测：开机自检后，选择单链RNA选项，其余步骤同DNA检测。
(3)逆转录
使用天根公司cDNA合成试剂盒，取1μg RNA至200μl PCR管(RNase free)中，加入1μl DNase及2μl Buffer，7μl ddH2O(RNase free)，37℃20min，去除可能存在的基因组DNA污染。去除基因组DNA操作结束后，加入2μl逆转录酶，4μl 5X逆转录Buffer，4μl ddH2O(RNase free)后，放入PCR仪，逆转录程序：42℃，30min→95℃，5min→4℃，5min。
(4)PCR扩增STAT3 mRNA全长
用SnapGene软件在STAT3 CDS区外侧设计巢式PCR引物，具体引物信息如下：
巢式PCR外侧引物：
正义链：5’-TCGGAGAGGCCCTTCGGCCTG-3’(SEQ ID NO.6)
反义链：5’-ATGATCTGGGGTTTGGCTGTG-3’(SEQ ID NO.7)
巢式PCR内侧引物：
正义链：5’-ATGGCCCAATGGAATCAGCT-3’(SEQ ID NO.8)
反义链：5’-CATGGGGGAGGTAGCGCACT-3’(SEQ ID NO.9)
PCR体系：25μl，使用擎科公司高保真PCR酶Mix(2×)
模板DNA：1μl，为HEK293细胞的cDNA文库；
上下游引物：各1μl；
ddH2O：9.5μl；
2×High-Fidelity Master Mix：12.5μl。
PCR程序：95℃，5min→95℃，30s→55℃，30s；72℃，3min→72℃，10min→4℃，5min。循环数：30。PCR结束后立即进行核酸电泳。
(5)核酸电泳
用1×TAE Buffer配制1％核酸分离胶：称取4g琼脂糖，倒入200ml锥形瓶中。用量筒量取40ml 1X TAE Buffer，加入锥形瓶中，摇匀后，于微波炉加热至沸腾，保持高温状态5min，至琼脂糖彻底溶解后，取出锥形瓶。加入2μl GelRed，混匀后，倒入制胶板，插入10孔梳子。室温放置30min，胶凝固后，取出核酸胶，放入水平电泳槽。PCR产物上样后，120v，30min。电泳结束后，将核酸胶转移至凝胶成像仪，根据Marker大小，分别切下相应位置核酸条带，放入2ml EP管中，进行后续操作。
(6)胶回收
使用天根公司胶回收试剂盒。提前向收集柱中加入300μl平衡Buffer，7000g，室温离心5min。取出装有DNA凝胶的2ml EP管，用1.5ml移液枪尖捣碎，使用电子天平称量胶块重量，加入等量buffer PN(1g胶加入1ml PN)，于热块上60℃溶解30min，期间上下颠倒混匀一次，确保核酸胶溶解完全。取下EP管，冷却至室温。将溶解后的液体转移至DNA收集柱，7000g，室温离心5min。弃掉废液后，向收集柱中加入500μl漂洗液(PW)，7000g，室温离心5min。漂洗两次后，空管于室温离心5min，通风厨中晾干收集管中的残留液体后，向收集管中加入30μl洗脱液(TB)，60℃孵育10min，7000g，室温离心5min。经Nano Drop测定DNA浓度后，进行后续操作。
(7)连接T载体及转化感受态细胞
使用全式金公司平末端T载体，取1μg胶回收PCR产物，加入1μl T载体，用双蒸水调整体积至5μl，放入PCR仪，37℃反应30min后，得到STAT3与T载体的连接产物，4℃暂存。感受态细胞购自全式金公司(Trans T1)，转化时，取出-80℃保存的感受态细胞，冰上融化。取2.5μl STAT3与T载体的连接产物，加入300μl感受态细胞中，冰上孵育20min后，于42℃水浴锅中热激90s后，立即放至冰上，加入200μl无抗性液体LB后，放入水平细菌摇床中，37℃，100转，复苏30min。取出复苏的感受态细胞，置于离心机中，5000g，室温离心5min，在超净台中吸走上清，留下100μl菌液，用移液枪重悬菌体沉淀后，取出含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB细菌培养平板，用玻璃棒将菌液均匀涂布于细菌培养平板表面。于37℃细菌培养箱中倒置培养12h后，观察菌落生长状态。
(8)细菌单克隆扩大培养及菌种保存
取10ml细菌培养管，加入5ml液体LB培养基，加入1X抗生素。用10μl无菌移液器枪尖挑取单菌落，将枪尖丢进10ml细菌培养管中，于水平细菌摇床中，37℃，200转，培养12h。选择处于对数生长期的菌液，在超净台中吸取700μl菌液，加入300μl 50％甘油中(甘油提前灭菌)，上下颠倒混匀后，于-80℃冰箱中保存。
(9)质粒抽提
质粒抽提使用全式金公司质粒小提试剂盒。经两次离心，经多次离心，每次2ml，共收集4ml菌液至2ml EP管中，弃上清，加入250μl溶液1(25mM Tris-HCl、10mM EDTA、50mM葡萄糖，调节pH至8.0)，涡旋重悬后，加入250μl溶液2(0.2N NaOH、1％SDS)，颠倒混匀后，室温放置5min，加350μl溶液3(2M醋酸、3M醋酸钾、75％酒精)，颠倒混匀后，室温放置10min，12000g，室温离心10min。将上清转移至收集柱中，12000g，室温离心2min。倒掉收集管中的废液，向收集柱中加入500μl漂洗液，12000g，室温离心2min。倒掉收集管中的废液，将收集管换成新的1.5ml EP管，向收集柱中加入30μl TB buffer，60℃孵育10min，12000g，室温离心2min，EP管中的液体即为质粒。
(10)PLVX-2×GAS-3x Flag质粒构建
使用PLVX-3×Flag载体作为真核表达载体，载体购自Addgene。选择双酶切方案进行构建，去除载体自身的CMV增强子及启动子元件，上游酶切位点选择：ClaI，下游酶切位点选择：EcoRI。使用NEB公司内切酶进行双酶切反应，反应体系：50μl，具体成分比例：
DNA：1μg；
Cutsmart buffer：5μl；
ClaI：1μl；
EcoRI：1μl；
H2O：补齐至50μl。
酶切条件：37℃，1h。
酶切结束后，加入5μl 10X loading Dye，电泳及胶回收，胶回收产物暂存于-20℃冰箱中。取出含有2×GAS正义链及反义链的DNA，按1:1比例混合退火。将退火产物稀释至1ng/ul。连接：将2×GAS退火片段与载体片段按摩尔比3:1进行连接，使用全式金公司T4连接试剂盒，连接体系：20μl，连接条件：16℃，过夜连接。连接产物转化感受态细胞，挑单克隆，测序确定正确插入片段后，质粒大量抽提。2×GAS序列信息如下：
正义链：CGATTTCCGGGAACCACTGTACATTCCGGGAAG(SEQ ID NO.1)
反义链：AATTCTTCCCGGAATGTACAGTGGTTCCCGGAAAT(SEQ ID NO.10)
(11)PLVX-2×GAS-KRAB-3×Flag质粒构建
使用PLVX-2×GAS-3×Flag质粒作为模板。选择双酶切方案进行构建。上游酶切位点选择：EcoRI，下游酶切位点选择：XhoI。使用NEB公司内切酶进行双酶切反应，反应体系：50μl，具体成分比例：
DNA：1μg；
Cutsmart buffer：5μl；
EcoRI：1μl；
XhoI：1μl；
H2O：补齐至50μl。
酶切条件：37℃，1h。
酶切结束后，加入5μl 10×loading Dye，电泳及胶回收，胶回收产物暂存于-20℃冰箱中。
使用PB-TRE-dCas9-KRAB-MeCP2载体作为模板(载体购自addgene)，经PCR获得KRAB表达序列，并在上游引入EcoRI酶切位点及Kozak序列，在下游引入XhoI酶切位点，序列信息如下：
正义链：GAATTCGCCACCATGGGGACACTGGTG(SEQ ID NO.11)
反义链：CTCGAGCAGCCAGGGCTC(SEQ ID NO.12)
PCR结束后，连接T载体，转化感受态并挑取单克隆，对测序正确的单克隆进行质粒大提，经EcoRI及XhoI双酶切、胶回收。使用T4 DNA连接酶，按摩尔比3:1与PLVX-2×GAS-3×Flag载体双酶切产物进行连接，获得PLVX-2×GAS-KRAB-3×Flag质粒。
(12)PLVX-2×GAS-KRAB-STAT3-3×Flag质粒构建
使用NotI及BamHI对PLVX-2×GAS-KRAB-3×Flag质粒进行双酶切，反应体系：50μl，具体成分比例：
DNA：1μg；
Cutsmart buffer：5μl；
NotI：1μl；
BamHI：1μl；
H2O：补齐至50μl。
酶切条件：37℃，1h。
酶切结束后，加入5μl 10×loading Dye，电泳及胶回收，胶回收产物暂存于-20℃冰箱中。
经PCR从STAT3 T载体上获得含有PLVX-2×GAS-KRAB-3×Flag载体同源臂的STAT3CDS区全长序列，序列信息如下：
正义链：
GAGACTAGTTCTAGAGCGGCCGCTGGCCCAATGGAATCAGCT(SEQ ID NO.13)
反义链：GTCATCCTTGTAGTCGGATCCCATGGGGGAGGTAGCGCA(SEQ ID NO.14)
PCR结束后，经胶回收获得STAT3片段，将胶回收产物与PLVX-2×GAS-KRAB-3×Flag质粒双酶切产物按摩尔比3:1进行同源重组，获得PLVX-2×GAS-KRAB-STAT3-3×Flag质粒。
(13)PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒构建
使用XhoI及NotI对PLVX-2×GAS-KRAB-STAT3-3×Flag质粒进行双酶切，反应体系：50μl，具体成分比例：
DNA：1μg；
Cutsmart buffer：5μl；
XhoI：1μl；
NotI：1μl；
H2O：补齐至50μl。
酶切条件：37℃，1h。
酶切结束后，加入5μl 10×loading Dye，电泳及胶回收，胶回收产物暂存于-20℃冰箱中。
使用PCR仪对合成的Linker正义链及反义链DNA进行退火，将退火产物稀释至1ng/ul。使用T4 DNA连接酶将Linker片段退火产物连接至PLVX-2×GAS-KRAB-STAT3-3×Flag载体，获得PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒，序列信息如下：
正义链:
TCGAGTCAAGTCGGACTGTAACAACTGGTGGAAGTAACTTACATGGTTCATTAGGTCATGTCAGTCTACCGC(SEQ ID NO.15)
反义链：
GGCCGCGGTAGACTGACATGACCTAATGAACCATGTAAGTTACTTCCACCAGTTGTTACAGTCCGACTTGAC(SEQ ID NO.16)
注：Linker的作用是将KRAB和STAT3连接在一起，其序列可随意设置，Linker的氨基酸长度可以是1～100中的任意数值。
(14)pDC315-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒构建
利用XbaI及BamHI对pDC315载体进行双酶切，去除载体自身的CMV增强子及启动子元件，经核酸电泳及胶回收获得酶切产物；经PCR从PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒上获得2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段，PCR引物序列信息如下：
正义链：TATTATTATAGTCAGTCTAGAATCGATTTCCGGGAACCACT(SEQ ID NO.17)
反义链：
CGAAGTCGACAAGCTGGATCCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTC(SEQ ID NO.18)
经同源重组，将2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段与pDC315载体连接，获得pDC315-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒。
(15)pcDNA3.1-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒构建
利用MluI及BamHI对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，去除载体自身的CMV增强子及启动子元件，经核酸电泳及胶回收获得酶切产物；经PCR从PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒上获得2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段，PCR引物序列信息如下：
正义链：GTACGGGCCAGATATACGCGTATCGATTTCCGGGAACCACT(SEQ ID NO.19)
反义链：
CCACACTGGACTAGTGGATCCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTC(SEQ ID NO.20)
经同源重组，将2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段与pcDNA3.1(+)载体连接，获得pcDNA3.1(+)-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒。
2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段(正义链)的DNA序列(SEQ ID NO.5)如下：
【注：小写(示例：atcg)部分为2×GAS序列，大写(示例：ATCG)部分为KRAB序列，小写斜体(示例：atcg)为酶切位点，大写斜体(示例：ATCG)为Linker序列，小写加粗(atcg)为3×Flag序列，大写加粗(ATCG)为3×Flag序列】
2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段(正义链)的氨基酸序列(SEQ IDNO.21)如下：
MGTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQILYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLLESSRTVTTGGSNLHGSLGHVSLPRPLAQWNQLQQLDTRYLEQLHQLYSDSFPMELRQFLAPWIESQDWAYAASKESHATLVFHNLLGEIDQQYSRFLQESNVLYQHNLRRIKQFLQSRYLEKPMEIARIVARCLWEESRLLQTAATAAQQGGQANHPTAAVVTEKQQMLEQHLQDVRKRVQDLEQKMKVVENLQDDFDFNYKTLKSQGDMQDLNGNNQSVTRQKMQQLEQMLTALDQMRRSIVSELAGLLSAMEYVQKTLTDEELADWKRRQQIACIGGPPNICLDRLENWITSLAESQLQTRQQIKKLEELQQKVSYKGDPIVQHRPMLEERIVELFRNLMKSAFVVERQPCMPMHPDRPLVIKTGVQFTTKVRLLVKFPELNYQLKIKVCIDKDSGDVAALRGSRKFNILGTNTKVMNMEESNNGSLSAEFKHLTLREQRCGNGGRANCDASLIVTEELHLITFETEVYHQGLKIDLETHSLPVVVISNICQMPNAWASILWYNMLTNNPKNVNFFTKPPIGTWDQVAEVLSWQFSSTTKRGLSIEQLTTLAEKLLGPGVNYSGCQITWAKFCKENMAGKGFSFWVWLDNIIDLVKKYILALWNEGYIMGFISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSKEGGVTFTWVEKDISGKTQIQSVEPYTKQQLNNMSFAEIIMGYKIMDATNILVSPLVYLYPDIPKEEAFGKYCRPESQEHPEADPGSAAPYLKTKFICVTPTTCSNTIDLPMSPRTLDSLMQFGNNGEGAEPSAGGQFESLTFDMELTSECATSPMGSDYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK
注：Linker的作用是将KRAB和STAT3连接在一起，其序列可随意设置，Linker的氨基酸长度可以是1～100中的任意数值。
3、慢病毒包装及稳定敲入单克隆细胞系构建
(1)慢病毒包装
将构建好的慢病毒骨架载体(PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag)连同psPAX2、pMD2.G包装质粒一同转染293T细胞，PLVX：psPAX2：pMD2.G＝4:2:1(质量比)。转染48小时后收集细胞上清，转染72h后收集第二次细胞上清。使用PEG对病毒进行浓缩后，分装，暂存于-80℃冰箱。
(2)稳定敲入单克隆细胞系构建
使用10cm细胞培养皿培养293细胞，感染PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag慢病毒，感染一段时间后，加入Puromycin筛选，之后消化贴壁细胞，用含有青链霉素的DMEM培养基制成单细胞悬液后，经流式细胞仪筛选单个细胞。获得的单个细胞继续培养，显微镜下观察细胞生长状态，选20个单克隆细胞进行扩大培养，经抗Flag标签单克隆抗体进行Western-Blot，以及利用基因测序方法鉴定PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag表达状态，选出含有KRAB-Linker-STAT3-3×Flag蛋白的细胞作为稳定敲入单克隆细胞系。经qRT-PCR检测STAT3下游靶基因表达。
4、腺病毒包装及感染细胞
将腺病毒骨架质粒pDC315-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag，包装质粒pBHGlox_E1,3Cre按摩尔比1:1共转染HEK293T细胞，培养10天后，消化细胞，经离心收集细胞，经多次冻融裂解细胞，经低温高速离心获得细胞内容物，用收集到的细胞内容物感染新的HEK293细胞，感染4-5天至毒斑形成，收集细胞内容物，即得到pDC315-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag腺病毒。
用pDC315-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag腺病毒感染H1299细胞，4天后经qRT-PCR检测STAT3下游靶基因表达，经双荧光素酶报告基因实验检测STAT3转录因子活性。
5、质粒传染细胞
用pcDNA3.1(+)-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒转染HEK293细胞，36小时后加入IL-6，激活STAT3转录活性，共分两轮刺激，在第一轮刺激结束2小时后进行第二轮刺激，经qRT-PCR检测STAT3下游靶基因表达。
二、实验结果
1.以慢病毒为载体的2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag过表达的相关结果
在过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的Hela细胞中，STAT3下游靶基因(Myc、MMP2、cyclinD1、BCL-xl、Survivin)表达明显受到抑制(图1a)。该结果说明：2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag对STAT3的转录功能具有抑制作用。
HEK293细胞的STAT3处于未激活状态，其下游靶基因表达量较低。而外源的IL-6可导致STAT3激活。为了确定过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag对外源性STAT3激活的影响，对稳定感染2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的HEK293细胞进行两轮IL-6刺激，第一轮刺激结束2小时后进行第二轮刺激。
结果显示，在第一轮刺激时，感染2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的细胞，STAT3下游靶基因表达提高，而第二轮刺激时，该细胞中的STAT3下游靶基因表达明显受到抑制(图1b)。
2.腺病毒为载体的2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag过表达的相关结果
qPCR实验结果表明，在H1299细胞中过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag明显抑制细胞中的内源性STAT3下游靶基因表达(图2a)。经双荧光素酶报告基因实验检测STAT3转录因子活性后发现，感染2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag腺病毒，显著抑制H1299细胞的本底STAT3转录活性(图2b)，通过免疫荧光检测STAT3下游靶基因c-Myc表达，结果显示，感染2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag腺病毒的细胞中，c-Myc表达量明显少于未感染细胞(图2c)。
该结果与第1节的结果一致，表明2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag能抑制STAT3发挥转录功能。
3.PEI转染方式过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒的相关结果
用PEI转染的方式将表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的质粒转染进HEK293细胞中，转染36小时后，对其进行IL-6刺激，结果显示，在第一轮刺激时，感染2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的细胞，STAT3下游靶基因可以被IL-6激活，下游靶基因正常表达，而第二轮刺激时，细胞中的STAT3下游靶基因表达明显受到抑制(图3)。
本实施例的结果表明：
无论以何种载体导入细胞，2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag都能抑制STAT3转录功能，抑制其下游基因的表达。
另外，2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag可抑制IL-6刺激导致的STAT3转录活性升高，这种抑制活性仅针对长时间反复刺激，对单次IL-6刺激不敏感，这种特性使本技术方案不影响正常的IL-6-STAT3信号，只针对异常活化的IL-6-STAT3信号，可减少因干扰正常STAT3功能而引发的副作用。
实施例2、过表达2×GAS-KRAB-Linker-STAT3抑制肿瘤细胞生长
一、实验方法
1、流式检测细胞增殖
小鼠腹腔注射EdU，2小时后，经短颈法处死荷瘤小鼠，用组织匀浆器将肿瘤组织制成单细胞悬液后，使用EdU细胞增殖检测试剂盒进行染色，经流式细胞仪检测增殖细胞占总细胞的比例。
2、pAAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag骨架质粒构建
利用MluI及BamHI对pAAV-MCS载体进行双酶切，去除载体自身的CMV增强子及启动子元件，经核酸电泳及胶回收获得酶切产物；经PCR从PLVX-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒上获得2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段，PCR引物序列信息如下：
正义链：
GGTTCCTGCGGCCGCACGCGTATCGATTTCCGGGAACCACT(SEQ ID NO.22)
反义链：
CAGGTCGACTCTAGAGGATCCTCATTTGTCGTCATCATCCTTATAGTC(SEQ ID NO.23)
经同源重组，将2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag片段与pAAV-MCS载体连接，获得pAAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag质粒
3、腺相关病毒包装
将腺相关病毒骨架质粒pAAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag，包装质粒Helper，9型腺相关病毒外壳质粒RC-9，按摩尔比3:2:1的比例共转染AAV-293细胞，培养5天后，消化细胞，经离心收集细胞，经多次冻融裂解细胞，经低温高速离心获得细胞内容物，即得到AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag腺相关病毒。
4、荷瘤小鼠治疗
(1)取7周龄雌性裸鼠，皮下注射5×104个Hela细胞，并于尾静脉注射AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag病毒(治疗组，标记为：OE)或生理盐水(对照组，标记为：NC)，每2天观察并记录肿瘤生长情况。
(2)取7周龄雌性C57小鼠，尾静脉注射AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag病毒，15天后，经尾静脉注射1×105个小鼠黑色素瘤B16F10细胞，每2天观察并记录小鼠死亡情况。NC：对照组，OE：治疗组。
二、实验结果
1、流式检测的细胞增殖
裸鼠植瘤治疗结果显示，在注射AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag病毒后7天，治疗组小鼠肿瘤增殖细胞的比例相比对照组显著下降(图4)。
2、肿瘤体积观察
通过肿瘤体积及重量的比较分析，我们发现经AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag治疗后7天，裸鼠肿瘤变小(图5)。
3、尾静脉注射B16F10细胞的小鼠生存期观察
尾静脉植瘤C57小鼠生存期统计结果显示，AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag可延长小鼠存活天数(图6)。
实验结果表明：使用AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag腺相关病毒治疗可延缓肿瘤的生长速率，减少肿瘤体积，延长荷瘤小鼠生存期，对肿瘤的治疗具有积极作用。
实施例3、AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag治疗系统性红斑狼疮
系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种自身免疫性炎症性结缔组织病，多发于青年女性，常累及多种脏器。SLE对健康造成了巨大破坏，给患者造成诸多不利影响。STAT3转录功能异常激活在SLE患者中扮演重要角色，因此，通过注射AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的方式抑制STAT3转录活性可以达到治疗SLE的目的。
一、实验方法
干扰AAV病毒治疗：
(1)取6周龄C57雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射200微升降植烷，3个月后观察SLE发病情况。
(2)取成功诱导SLE的小鼠，麻醉后进行AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag病毒(病毒同实施例2)注射；对照组注射等体积生理盐水。
(3)病毒用量：1×1011GC/只鼠，稀释成100μl后，利用显微注射仪进行尾静脉注射。
(4)AAV病毒注射15天后，观察小鼠表型变化。
二、实验结果
对构建成功的SLE模型鼠进行2个月的治疗及观察，体重变化结果显示，AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag的使用显著减缓了SLE小鼠体重下降趋势(图7a)。经Elisa检测血清抗dsDNA IgG(为SLE临床检测常用标志物)含量，发现治疗组小鼠血清中的dsDNA少于对照组(图7b)。
实验结果表明：采用靶向STAT3转录活性的AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag病毒治疗可以减少STAT3靶基因的表达，维持小鼠体重，降低抗dsDNA IgG水平，抑制炎症因子及自身抗体的产生，减轻系统性红斑狼疮症状。
综上，本发明的AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag可用于抑制STAT3转录功能，其抑制效果具有靶向性，不会产生类似基因敲除或蛋白降解清除所产生的副作用。本发明的AAV-2×GAS-KRAB-Linker-STAT3-3×Flag可用于制备抗肿瘤、抗自身免疫疾病的药物，且根据其作用原理可以预期，其还能用于制备治疗神经退行性疾病的药物。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种降低STAT3转录功能的核酸片段及其制药用途
<130> GYKH1669-2020P0111885CC
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgatttccgg gaaccactgt acattccggg aag 33
<210> 2
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggggacac tggtgacctt caaggatgtg tttgtggact tcaccaggga ggagtggaag 60
ctgctggaca ctgctcagca gatcctgtac agaaatgtga tgctggagaa ctataagaac 120
ctggtttcct tgggttatca gcttactaag ccagatgtga tcctccggtt ggagaaggga 180
gaagagccct ggctg 195
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaagtcgga ctgtaacaac tggtggaagt aacttacatg gttcattagg tcatgtcagt 60
ctacc 65
<210> 4
<211> 2310
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggcccaat ggaatcagct acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag 60
ctctacagtg acagcttccc aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt 120
caagattggg catatgcggc cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc 180
ctgggagaga ttgaccagca gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag 240
cacaatctac gaagaatcaa gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag 300
attgcccgga ttgtggcccg gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc 360
actgcggccc agcaaggggg ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag 420
cagcagatgc tggagcagca ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag 480
aaaatgaaag tggtagagaa tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag 540
agtcaaggag acatgcaaga tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg 600
cagcagctgg aacagatgct cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag 660
ctggcggggc ttttgtcagc gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg 720
gctgactgga agaggcggca acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta 780
gatcggctag aaaactggat aacgtcatta gcagaatctc aacttcagac ccgtcaacaa 840
attaagaaac tggaggagtt gcagcaaaaa gtttcctaca aaggggaccc cattgtacag 900
caccggccga tgctggagga gagaatcgtg gagctgttta gaaacttaat gaaaagtgcc 960
tttgtggtgg agcggcagcc ctgcatgccc atgcatcctg accggcccct cgtcatcaag 1020
accggcgtcc agttcactac taaagtcagg ttgctggtca aattccctga gttgaattat 1080
cagcttaaaa ttaaagtgtg cattgacaaa gactctgggg acgttgcagc tctcagagga 1140
tcccggaaat ttaacattct gggcacaaac acaaaagtga tgaacatgga agaatccaac 1200
aacggcagcc tctctgcaga attcaaacac ttgaccctga gggagcagag atgtgggaat 1260
gggggccgag ccaattgtga tgcttccctg attgtgactg aggagctgca cctgatcacc 1320
tttgagaccg aggtgtatca ccaaggcctc aagattgacc tagagaccca ctccttgcca 1380
gttgtggtga tctccaacat ctgtcagatg ccaaatgcct gggcgtccat cctgtggtac 1440
aacatgctga ccaacaatcc caagaatgta aactttttta ccaagccccc aattggaacc 1500
tgggatcaag tggccgaggt cctgagctgg cagttctcct ccaccaccaa gcgaggactg 1560
agcatcgagc agctgactac actggcagag aaactcttgg gacctggtgt gaattattca 1620
gggtgtcaga tcacatgggc taaattttgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc 1680
ttctgggtct ggctggacaa tatcattgac cttgtgaaaa agtacatcct ggccctttgg 1740
aacgaagggt acatcatggg ctttatcagt aaggagcggg agcgggccat cttgagcact 1800
aagcctccag gcaccttcct gctaagattc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact 1860
ttcacttggg tggagaagga catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac 1920
acaaagcagc agctgaacaa catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg 1980
gatgctacca atatcctggt gtctccactg gtctatctct atcctgacat tcccaaggag 2040
gaggcattcg gaaagtattg tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt 2100
agcgctgccc catacctgaa gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac ctgcagcaat 2160
accattgacc tgccgatgtc cccccgcact ttagattcat tgatgcagtt tggaaataat 2220
ggtgaaggtg ctgaaccctc agcaggaggg cagtttgagt ccctcacctt tgacatggag 2280
ttgacctcgg agtgcgctac ctcccccatg 2310
<210> 5
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcgatttcc gggaaccact gtacattccg ggaagaattc gccaccatgg ggacactggt 60
gaccttcaag gatgtgtttg tggacttcac cagggaggag tggaagctgc tggacactgc 120
tcagcagatc ctgtacagaa atgtgatgct ggagaactat aagaacctgg tttccttggg 180
ttatcagctt actaagccag atgtgatcct ccggttggag aagggagaag agccctggct 240
gctcgagtca agtcggactg taacaactgg tggaagtaac ttacatggtt cattaggtca 300
tgtcagtcta ccgcggccgc tggcccaatg gaatcagcta cagcagcttg acacacggta 360
cctggagcag ctccatcagc tctacagtga cagcttccca atggagctgc ggcagtttct 420
ggccccttgg attgagagtc aagattgggc atatgcggcc agcaaagaat cacatgccac 480
tttggtgttt cataatctcc tgggagagat tgaccagcag tatagccgct tcctgcaaga 540
gtcgaatgtt ctctatcagc acaatctacg aagaatcaag cagtttcttc agagcaggta 600
tcttgagaag ccaatggaga ttgcccggat tgtggcccgg tgcctgtggg aagaatcacg 660
ccttctacag actgcagcca ctgcggccca gcaagggggc caggccaacc accccacagc 720
agccgtggtg acggagaagc agcagatgct ggagcagcac cttcaggatg tccggaagag 780
agtgcaggat ctagaacaga aaatgaaagt ggtagagaat ctccaggatg actttgattt 840
caactataaa accctcaaga gtcaaggaga catgcaagat ctgaatggaa acaaccagtc 900
agtgaccagg cagaagatgc agcagctgga acagatgctc actgcgctgg accagatgcg 960
gagaagcatc gtgagtgagc tggcggggct tttgtcagcg atggagtacg tgcagaaaac 1020
tctcacggac gaggagctgg ctgactggaa gaggcggcaa cagattgcct gcattggagg 1080
cccgcccaac atctgcctag atcggctaga aaactggata acgtcattag cagaatctca 1140
acttcagacc cgtcaacaaa ttaagaaact ggaggagttg cagcaaaaag tttcctacaa 1200
aggggacccc attgtacagc accggccgat gctggaggag agaatcgtgg agctgtttag 1260
aaacttaatg aaaagtgcct ttgtggtgga gcggcagccc tgcatgccca tgcatcctga 1320
ccggcccctc gtcatcaaga ccggcgtcca gttcactact aaagtcaggt tgctggtcaa 1380
attccctgag ttgaattatc agcttaaaat taaagtgtgc attgacaaag actctgggga 1440
cgttgcagct ctcagaggat cccggaaatt taacattctg ggcacaaaca caaaagtgat 1500
gaacatggaa gaatccaaca acggcagcct ctctgcagaa ttcaaacact tgaccctgag 1560
ggagcagaga tgtgggaatg ggggccgagc caattgtgat gcttccctga ttgtgactga 1620
ggagctgcac ctgatcacct ttgagaccga ggtgtatcac caaggcctca agattgacct 1680
agagacccac tccttgccag ttgtggtgat ctccaacatc tgtcagatgc caaatgcctg 1740
ggcgtccatc ctgtggtaca acatgctgac caacaatccc aagaatgtaa acttttttac 1800
caagccccca attggaacct gggatcaagt ggccgaggtc ctgagctggc agttctcctc 1860
caccaccaag cgaggactga gcatcgagca gctgactaca ctggcagaga aactcttggg 1920
acctggtgtg aattattcag ggtgtcagat cacatgggct aaattttgca aagaaaacat 1980
ggctggcaag ggcttctcct tctgggtctg gctggacaat atcattgacc ttgtgaaaaa 2040
gtacatcctg gccctttgga acgaagggta catcatgggc tttatcagta aggagcggga 2100
gcgggccatc ttgagcacta agcctccagg caccttcctg ctaagattca gtgaaagcag 2160
caaagaagga ggcgtcactt tcacttgggt ggagaaggac atcagcggta agacccagat 2220
ccagtccgtg gaaccataca caaagcagca gctgaacaac atgtcatttg ctgaaatcat 2280
catgggctat aagatcatgg atgctaccaa tatcctggtg tctccactgg tctatctcta 2340
tcctgacatt cccaaggagg aggcattcgg aaagtattgt cggccagaga gccaggagca 2400
tcctgaagct gacccaggta gcgctgcccc atacctgaag accaagttta tctgtgtgac 2460
accaacgacc tgcagcaata ccattgacct gccgatgtcc ccccgcactt tagattcatt 2520
gatgcagttt ggaaataatg gtgaaggtgc tgaaccctca gcaggagggc agtttgagtc 2580
cctcaccttt gacatggagt tgacctcgga gtgcgctacc tcccccatgg gatccgacta 2640
caaggatgac gatgacaagg attacaaaga cgacgatgat aaggactata aggatgatga 2700
cgacaaatga 2710
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggagaggc ccttcggcct g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgatctggg gtttggctgt g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggcccaat ggaatcagct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catgggggag gtagcgcact 20
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattcttccc ggaatgtaca gtggttcccg gaaat 35
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattcgcca ccatggggac actggtg 27
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcgagcagc cagggctc 18
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagactagtt ctagagcggc cgctggccca atggaatcag ct 42
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtcatccttg tagtcggatc ccatggggga ggtagcgca 39
<210> 15
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgagtcaag tcggactgta acaactggtg gaagtaactt acatggttca ttaggtcatg 60
tcagtctacc gc 72
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggccgcggta gactgacatg acctaatgaa ccatgtaagt tacttccacc agttgttaca 60
gtccgacttg ac 72
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tattattata gtcagtctag aatcgatttc cgggaaccac t 41
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgaagtcgac aagctggatc ctcatttgtc gtcatcatcc ttatagtc 48
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtacgggcca gatatacgcg tatcgatttc cgggaaccac t 41
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccacactgga ctagtggatc ctcatttgtc gtcatcatcc ttatagtc 48
<210> 21
<211> 887
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Met Gly Thr Leu Val Thr Phe Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg
1 5 10 15
Glu Glu Trp Lys Leu Leu Asp Thr Ala Gln Gln Ile Leu Tyr Arg Asn
20 25 30
Val Met Leu Glu Asn Tyr Lys Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu
35 40 45
Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp
50 55 60
Leu Leu Glu Ser Ser Arg Thr Val Thr Thr Gly Gly Ser Asn Leu His
65 70 75 80
Gly Ser Leu Gly His Val Ser Leu Pro Arg Pro Leu Ala Gln Trp Asn
85 90 95
Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu Gln Leu His Gln Leu
100 105 110
Tyr Ser Asp Ser Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln Phe Leu Ala Pro Trp
115 120 125
Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser Lys Glu Ser His Ala
130 135 140
Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile Asp Gln Gln Tyr Ser
145 150 155 160
Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln His Asn Leu Arg Arg
165 170 175
Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu Lys Pro Met Glu Ile
180 185 190
Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu Ser Arg Leu Leu Gln
195 200 205
Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln Ala Asn His Pro Thr
210 215 220
Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu Glu Gln His Leu Gln
225 230 235 240
Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln Lys Met Lys Val Val
245 250 255
Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr Lys Thr Leu Lys Ser
260 265 270
Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn Gln Ser Val Thr Arg
275 280 285
Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr Ala Leu Asp Gln Met
290 295 300
Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu Leu Ser Ala Met Glu
305 310 315 320
Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu Ala Asp Trp Lys Arg
325 330 335
Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro Asn Ile Cys Leu Asp
340 345 350
Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu Ser Gln Leu Gln Thr
355 360 365
Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln Gln Lys Val Ser Tyr
370 375 380
Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met Leu Glu Glu Arg Ile
385 390 395 400
Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala Phe Val Val Glu Arg
405 410 415
Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro Leu Val Ile Lys Thr
420 425 430
Gly Val Gln Phe Thr Thr Lys Val Arg Leu Leu Val Lys Phe Pro Glu
435 440 445
Leu Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Lys Val Cys Ile Asp Lys Asp Ser Gly
450 455 460
Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ile Leu Gly Thr
465 470 475 480
Asn Thr Lys Val Met Asn Met Glu Glu Ser Asn Asn Gly Ser Leu Ser
485 490 495
Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln Arg Cys Gly Asn Gly
500 505 510
Gly Arg Ala Asn Cys Asp Ala Ser Leu Ile Val Thr Glu Glu Leu His
515 520 525
Leu Ile Thr Phe Glu Thr Glu Val Tyr His Gln Gly Leu Lys Ile Asp
530 535 540
Leu Glu Thr His Ser Leu Pro Val Val Val Ile Ser Asn Ile Cys Gln
545 550 555 560
Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr Asn Met Leu Thr Asn
565 570 575
Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro Pro Ile Gly Thr Trp
580 585 590
Asp Gln Val Ala Glu Val Leu Ser Trp Gln Phe Ser Ser Thr Thr Lys
595 600 605
Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu Ala Glu Lys Leu Leu
610 615 620
Gly Pro Gly Val Asn Tyr Ser Gly Cys Gln Ile Thr Trp Ala Lys Phe
625 630 635 640
Cys Lys Glu Asn Met Ala Gly Lys Gly Phe Ser Phe Trp Val Trp Leu
645 650 655
Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile Leu Ala Leu Trp Asn
660 665 670
Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu Arg Glu Arg Ala Ile
675 680 685
Leu Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu Arg Phe Ser Glu Ser
690 695 700
Ser Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val Glu Lys Asp Ile Ser
705 710 715 720
Gly Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr Thr Lys Gln Gln Leu
725 730 735
Asn Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly Tyr Lys Ile Met Asp
740 745 750
Ala Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile
755 760 765
Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg Pro Glu Ser Gln Glu
770 775 780
His Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Thr Lys
785 790 795 800
Phe Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn Thr Ile Asp Leu Pro
805 810 815
Met Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln Phe Gly Asn Asn Gly
820 825 830
Glu Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe Glu Ser Leu Thr Phe
835 840 845
Asp Met Glu Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser Pro Met Gly Ser Asp
850 855 860
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp
865 870 875 880
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
885
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggttcctgcg gccgcacgcg tatcgatttc cgggaaccac t 41
<210> 23
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caggtcgact ctagaggatc ctcatttgtc gtcatcatcc ttatagtc 48

Claims (10)

1.一种降低STAT3转录功能的核酸片段，其特征在于：所述核酸片段包括依次直接或间接连接的启动子序列、KRAB序列、Linker序列、STAT3序列；
所述启动子序列是可被STAT3识别而起始转录的启动子序列；
所述KRAB序列是转录抑制因子Krüppel-Associated Box；
所述Linker序列是长度为3～300bp的随机核酸序列，长度需要为3的整数倍；
所述STAT3序列是STAT3基因序列，或STAT3基因mRNA的cDNA序列；
所述间接连接指通过核酸内切酶酶切位点序列连接。
2.如权利要求1所述的核酸片段，其特征在于：所述启动子序列是GAS序列或2个以上GAS序列通过随机序列相连组成的序列；所述随机序列的长度为5～15bp。
3.如权利要求2所述的核酸片段，其特征在于：所述启动子序列为2个GAS序列通过随机序列相连组成的序列。
4.如权利要求1所述的核酸片段，其特征在于：所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示；
和/或，所述KRAB序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述Linker序列如SEQ ID NO.3所示；
和/或，所述STAT3序列如SEQ ID NO.4所示。
5.如权利要求1～4任一所述的核酸片段，其特征在于：所述片段包括依次直接或间接连接的启动子序列、KRAB序列、Linker序列、STAT3序列、蛋白纯化检测用标签序列。
6.如权利要求5述的核酸片段，其特征在于：所述核酸片段的序列如SEQ ID NO.5所示。
7.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒携带权利要求1～6任一所述的核酸片段。
8.一种重组病毒，其特征在于：所述重组病毒是携带权利要求1～6任一所述核酸片段的病毒。
9.一种治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物，其特征在于：所述药物以权利要求1～6任一所述的核酸片段为活性成分，所述肿瘤为子宫颈癌、肺癌、黑色素瘤；所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮。
10.权利要求1～6任一所述的核酸片段、权利要求7所述的重组质粒或权利要求8所述的重组病毒在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的用途，所述肿瘤为子宫颈癌、肺癌、黑色素瘤；所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮。
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