CN115697354A - 用于治疗sars-cov-2感染的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于在有其需要的受试者中治疗受试者的SARS‑CoV‑2感染的组合物和方法。所述组合物包含在药学上可接受的载体中的一种或多种含铋(III)化合物、其类似物或其药学上可接受的盐，并且其单独使用或与含硫醇的小分子化合物组合使用。示例性含铋(III)化合物包括胶体次柠檬酸铋(CBS)；雷尼替丁柠檬酸铋(RBC)；Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)；和Bi(TPyP)(TPyP：四(4‑吡啶基)卟啉)。所公开的化合物和组合物可用于在有其需要的受试者中治疗SARS‑CoV‑2感染。可将所述组合物给予目前患有SARS‑CoV‑2感染的受试者，所述受试者正表现出一种或多种COVID‑19症状。也可将所述组合物给予已暴露于SARS‑CoV‑2但无症状的受试者。

Description

用于治疗SARS-COV-2感染的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月1日提交的第63/032,888号美国临时申请的申请日的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明总体上属于用于治疗SARS-CoV-2感染的组合物和方法的领域。

发明背景

目前由新型严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)¹引起的2019年冠状病毒疾病(COVID-19)大流行代表了一场全球性公共卫生危机，导致全球约500万例确诊病例，包括323000人死亡。该突发事件对迅速确定有效的预防和治疗药物提出了前所未有的挑战。与其他冠状病毒²相似，SARS-CoV-2合成一系列对于病毒进入、复制和发病至关重要的病毒酶和蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白(nsp)。对病毒进入或复制进行干预使得疫苗或治疗方法能够被开发^3-6。包括RNA依赖性RNA聚合酶、3-糜蛋白酶样蛋白酶以及木瓜蛋白酶样蛋白酶的一些酶^7-9可作为有希望的潜在治疗药物的靶点。

鉴于大流行的紧迫性和严重性，将已在临床使用的药物重新用于治疗COVID-19是唯一实用的方法^10,11。已经报道，瑞德西韦，一种广谱抗病毒药物，针对SARS-CoV-2¹²显示疗效。瑞德西韦表现出真实但并不显著的益处，患者康复的中位时间从15天减少了约4天，以及死亡率也下降¹³。然而，在严重的COVID-19患者中，没有观察到瑞德西韦治疗的显著临床益处¹⁴。总的来说，目前对一系列抗病毒药物的临床试验表明改善COVID-19患者的临床结果的巨大挑战^10,15。因此，最迫切的是需要重新努力。仍然需要能够有效治疗COVID-19的组合物。

本发明的目的是提供用于治疗与SARS-CoV-2感染相关的症状的组合物。

本发明的另一个目的是提供用于治疗与SARS-CoV-2感染相关的一种或多种症状的方法。

发明概述

公开了用于在有其需要的受试者中治疗受试者的SARS-CoV-2感染的组合物和方法。所述组合物包含单独的或与含硫醇的小分子组合的在药学上可接受的载体中的一种或多种含铋(III)化合物、其类似物或其药学上可接受的盐。优选的含硫醇的小分子是NAC。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含一种或多种选自以下的化合物：

胶体次柠檬酸铋；

雷尼替丁柠檬酸铋(RBC)；

Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)；和

Bi(TPyP)(TPyP：四(4-吡啶基)卟啉)。

含铋(III)化合物或其药学上可接受的盐单独给予或优选与含硫醇的小分子组合给予，以减少与SARS-CoV-2感染相关的疾病、障碍或疾患的一种或多种症状。优选的含硫醇的小分子是NAC。

还公开了在有其需要的受试者中治疗SARS-CoV-2感染的方法。所述方法包括以减少SARS-CoV-2感染的一种或多种症状的治疗有效量向受试者给予包含在药学上可接受的载体中的一种或多种含铋(III)化合物、其类似物或其药学上可接受的盐的组合物，单独给予或与含硫醇的小分子组合给予。在一个优选的实施方案中，所述治疗有效地抑制受试者中的SARS-CoV-2的解旋酶蛋白，即所述组合物以抑制受试者中的SARS-CoV-2的解旋酶蛋白的有效量给予。

所述治疗有效地减少与COVID-19相关的一种或多种症状，包括但不限于发热、鼻窦和/或肺充血、流鼻涕或鼻塞、咳嗽、打喷嚏、喉咙痛、身体疼痛、疲劳、气短、胸闷、呼气时喘息、寒战、肌肉疼痛、头痛、腹泻、疲倦、恶心、呕吐及其组合。

可给予目前患有SARS-CoV-2感染的受试者所述组合物，任选地，所述受试者正表现出一种或多种COVID-19症状。也可将所述组合物给予已暴露于SARS-CoV-2但无症状的受试者。

附图简述

图1A-1H显示感染SARS-CoV-2(0.1MOI)并用不同浓度的Pylorid和如所示的相关化合物处理的VeroE6和Caco2细胞的结果。细胞内病毒载量在感染后48小时检测，并以人β-肌动蛋白归一化(图1A-1D为Vero E6细胞，图1E-1H为Caco2细胞)。图1M-1P：通过qRT-qPCR在感染后48小时测定细胞培养上清液中的病毒拷贝数(图1I-1L为Vero E6细胞，图1M-1P为Caco2细胞)。

图2A：在两个独立的实验期间，来自随机选择的800×800像素区域(n＝4)的抗原阳性细胞的定量(单因素方差分析，ANOVA，为确定四种药物化合物中的每一种所靶向的病毒复制周期的步骤进行时间加药进程试验(time-of-drug-addition assay))。图2B是显示实验设计的方案，表明细胞-化合物孵育的时段。病毒吸附在约0-1h时进行(MOI＝2)，随后更换补充了测试药物或DMSO的新鲜培养基。图2C显示柱状图，其显示所有组的上清液中的病毒产量，通过qRT-PCR在感染后9小时定量。使用单因素方差分析来比较处理组与阴性对照组(0μM，0.1％DMSO)。NP表示SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。图2D：在DMSO或如所示的药物化合物(n＝3)存在下，用假SARS-CoV-2-Luc感染HEK293-hACE2稳定细胞。在感染后48小时测量荧光素酶活性，并将其归一化为DMSO对照的百分比。用单因素方差分析来比较处理组与阴性对照组(0μM，即0.1％DMSO)。结果显示为平均值±标准偏差(S.D.)。*p表示<0.05，**p表示<0.01并且***p表示<0.001。所有的实验都以一式三份进行，并重复两次。图2E：雷尼替丁处理SARS-CoV-2感染的VeroE6细胞(0.1MOI，感染后48小时)后，细胞培养上清液中的病毒拷贝数。用单因素方差分析来比较处理组与阴性对照组(0μM，即0.1％DMSO)。结果显示为平均值±标准偏差(S.D.)。n.s.表示不显著。图2F：在溶媒(水)或RBC(500μM)存在下，用假SARS-CoV-2-Luc感染Vero E6和Calu-3细胞。在溶媒(水)或RBC(500μM)存在下，用假SARS-CoV-2-Luc感染Vero E6和Calu-3细胞。感染后48h测量荧光素酶活性，并将其归一化为未经任何处理的感染细胞的百分比。结果显示为n＝3个生物学独立样本的平均值±S.D。使用非配对双尾学生t检验计算统计显著性，使用学生t检验**p<0.01。灰色虚线代表RBC处理的Vero E6组的平均值，这是为了更容易地与RBC处理的Calu-3组的平均值进行比较。

图3A-3B显示对仓鼠(n＝5)的研究，用1000PFU的SARS-CoV-2对仓鼠进行鼻内接种并且连续4天腹膜内给予Pylorid或瑞德西韦或PBS，第一剂在感染后6小时给予。在感染后4天，分别通过qRT-PCR试验(图3A)和TCID₅₀试验(图3B)检测仓鼠的鼻甲和肺组织中的呼吸道组织病毒产量。图3C：如在感染后4天肺组织匀浆中检测的指定组的肺组织的代表性趋化因子和细胞因子。结果显示为平均值±SD。与DMSO组相比，*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。单因素方差分析。图3D-3E显示SARS-CoV-2解旋酶的纯化。图3D：SARS-CoV-2解旋酶的SDS-PAGE凝胶。左侧泳道：标记物；右侧泳道：解旋酶。图3E：SARS-CoV-2解旋酶的尺寸排阻色谱图。图3F：表示每个组的肺部组织病理学严重程度的组织学评分。计分方法详见方法部分。数据作为来自每组的随机选择的四张切片的平均值±s.d.显示。非配对的双尾学生t检验，与DMSO对照组相比时，***P<0.001。模拟感染的组织学评分被设定为零。

图4A-4D显示如所示的不同浓度的Pylorid和相关化合物对SARS-CoV-2解旋酶的ATP酶活性的抑制。图4E-4H：如所示的，通过基于FRET的试验用不同浓度的Pylorid和相关化合物对SARS-CoV-2解旋酶的DNA解旋活性的滴定。图4A-4H：数据表示为不存在抑制剂时对照反应的百分比。半数最大抑制浓度(IC₅₀)值的剂量-反应曲线是通过非线性回归确定的。图4I-4H：如所示的补充不同比例的锌(II)后，Bi-SARS-CoV-2解旋酶的(i)ATP酶和(图4J)DNA解旋活性的恢复。图4A-4J：所有试验均以一式三份进行，数据显示为平均值±SD。图4K-4L：Lineweaver-Burk图显示Pylorid对SARS-CoV-2解旋酶的(图4K)ATP酶活性和(图4L)DNA解旋活性的动力学抑制。在不同浓度的Pylorid存在下，抑制剂对酶的影响是由1/速率(1/V₀)相对于1/底物浓度的双倒数图确定的。K_i值是通过绘制1/V相对于抑制剂浓度获得的曲线的交点计算的。

图5A显示不同的相对apo-SARS-CoV-2解旋酶的摩尔当量的铋(III)滴定的不同紫外-可见光谱。插图显示在约340纳米处针对[铋(III)]/[apo-SARS-CoV-2解旋酶]的摩尔比绘制的滴定曲线。试验进行了两次，并显示了代表性数据。图5B：在平衡透析期间Pylorid对SARS-CoV-2解旋酶中的锌(II)的取代。锌(II)和铋(III)的金属含量通过ICP-MS测定。显示三次重复的平均值，误差条表示±SD。

图6A-6I：NAC在体外和体内稳定并促进铋药CBS的吸收。图6A显示在逐步增加的量的NAC存在下，CBS(2.5mM)在pH 1.2(左)、pH 7.4(中)和pH 9.2(右)下的体外化学稳定性。剩余铋的百分比是由1小时与0小时测量的上清液中铋含量的比率计算的(n＝3)。图6B：使用PAMPA渗透性试验(n＝3)，在不存在和存在适量NAC的情况下，三种铋药物在酸性等pH值1.2的受体区室中的铋累积量。图6C：在Caco-2细胞单层模型中(n＝3)，在不存在和存在10NAC(1.5mM)的情况下，CBS(150μM)在受体区室中的铋随时间的累积量。图6D：Caco-2细胞单层中的铋累积(n＝3)。图6E：CBS(150μM)和CBS(150μM)+10NAC(1.5mM)通过Caco-2单层的表观渗透系数(P_app，cm/s)(n＝3)。图6F：在外翻大鼠肠囊模型中(n＝3)，在逐步增加的量的NAC的存在下，CBS(200μM)通过十二指肠转运的铋相对于时间的累积量。图6G：在逐步增加的量的NAC存在下，口服给予Balb/c小鼠CBS(150mg/kg)后1小时和2小时的血铋浓度(n＝3)。图6H：在SD大鼠中口服给予后CBS和CBS(150mg/kg)+10NAC(610mg/kg)的平均血铋浓度相对于时间的曲线(每个时间间隔n＝5)。图6I：在SD大鼠中口服给予CBS和CBS+10NAC后铋在不同器官的分布(n＝5)。样品是在给药后24小时从图6H中的同一批大鼠中收集的。图6A-I：药物浓度的测量基于通过使用ICP-MS获得的金属含量。数据显示为平均值±SD。使用非配对双尾学生t检验计算统计显著性，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

图7A-7D显示CBS+3NAC以剂量依赖的方式对人致病性冠状病毒在人细胞模型中的复制的影响(n＝3)。图7A：Vero E6细胞中的SARS-CoV-2。图7B：Vero E6细胞中的SARS-CoV-2(B.1.1.7变异株)。图7C：Vero E6细胞中的MERS-CoV。图7D：HELF细胞中的HCoV-229E。细胞培养上清液中的病毒载量是通过采用反转录的qPCR(RT-qPCR)定量的。数据显示为平均值±SD。所有的统计分析都与对照组(0μM)比较，使用非配对双尾学生t检验计算显著性，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。图7E：在两个独立的实验期间，对来自随机选择的800×800像素区(n＝4)的NP-阳性细胞定量(单因素方差分析，ANOVA)。****p<0.0001，**p<0.01。数据显示为平均值±SD。图7F：在时间加药进程试验中，所有组的上清液中的病毒产量通过qRT-PCR在感染后9小时定量(n＝3)。数据显示为平均值±SD。用单因素方差分析比较治疗组与溶媒对照组(0μM)。****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05。图7G：描述经由在第-2、-1、0和1天进行溶媒、CBS(300mg/kg)、NAC(370mg/kg)和CBS(300mg/kg)+3NAC(370mg/kg)的口服给药的治疗性处理的方案，并且仓鼠在第0天受到病毒攻击；在感染后两天收集组织样品。图7H：仓鼠肺部组织中的病毒产量(n＝8)。图7I：细胞因子IL-6基因表达水平。图7H-7I：数据显示为平均值±SD。使用Kruskal-Wallis以Dunn多重比较检验计算统计显著性。***P<0.001。图7J：来自肺组织中随机选择的800×800像素区(n＝4)的NP阳性细胞的定量(单因素方差分析，ANOVA)。****p<0.0001，*p<0.05。数据显示为平均值±SD。图7K：通过对细支气管、肺泡和血管中的损伤严重程度进行分级并累积总得分，给予每个肺组织半定量组织学得分。模拟感染的组织学得分被设定为零。数据显示为平均值±SD。使用非配对双尾学生t检验计算统计显著性，****P<0.0001，**P<0.01，*P<0.05。图7L：在NAC处理后Vero E6细胞培养上清液中的病毒拷贝数(n＝3)。数据显示为平均值±SD。使用非配对的双尾学生t检验，没有发现各组之间的统计显著性的差异。图7M：在Balb/c小鼠(n＝3)中口服给予CBS(150mg/kg)+10NAC(610mg/kg)1天、连续2天、连续3天后，肺中的铋累积。数据显示为平均值±SD。使用非配对的双尾学生t检验，各组之间没有发现统计显著性的差异。

图8A-8L：铋药物通过靶向SARS-CoV-2中多个保守的关键半胱氨酸蛋白酶/酶而表现出抗病毒效力。图8A-D：CBS+3NAC对(图8A)SARS-CoV-2Hel的dsDNA解旋活性、(图8B)SARS-CoV-2Hel的ATP酶活性、(图8C)SARS-CoV-2PL^pro活性、(图8D)SARS-CoV-2M^pro活性的抑制(n＝3)。图8E-F：显示CBS+3NAC对(图8E)SARS-CoV-2PL^pro活性、(图8F)SARS-CoV-2M^pro活性抑制的动力学的Lineweaver-Burk图。在不同浓度的CBS+3NAC存在下，CBS+3NAC对酶的作用由1/速率(1/V)相对于1/底物浓度的双倒数图确定。K_i值是通过对每个底物浓度的1/V相对于抑制剂浓度绘图获得的曲线交点来计算的。图8G-8H：Bi³⁺(20摩尔当量)与(图8G)SARS-CoV-2PL^pro和(图8H)SARS-CoV-2M^pro的反应在340nm处的吸光度相对于时间的依赖性。曲线显示为使用单相指数函数的非线性最小平方拟合。图8I-8J：不同摩尔当量的Bi³⁺滴定(图8I)apo-SARS-CoV-2PL^pro和(图8J)SARS-CoV-2M^pro的紫外-可见光谱差异。插图显示在约340nm处针对(图8I)[Bi³⁺]/[apo-SARS-CoV-2PL^pro]和(图8J)[Bi³⁺]/[SARS-CoV-2M^pro]的摩尔比率绘制的滴定曲线。试验进行两次，显示代表性数据。图8K：与逐步增加浓度的Bi³⁺孵育后，从SARS-CoV-2PL^pro释放的Zn²⁺(n＝3)。图8L：与Bi³⁺孵育后的SARS-CoV-2M^pro中的游离半胱氨酸在Ellman试验中的半定量(n＝3)。图8A-8D、8K、8L：数据显示为平均值±SD。

图9A-9C：口服给予CBS+3NAC表现出小鼠肾脏中的可逆病理变化，如(图9A)相对于时间的体重变化、(图9B)相对于时间的BUN水平(n＝4)、(图9C)相对于时间的肌酐水平(n＝4)所揭示的。数据显示为平均值±SD。使用非配对的双尾学生t检验，没有发现各组之间的统计显著性的差异。

图10A显示CBS对SARS-CoV-2PL^pro活性的抑制。图10B显示CBS对SARS-CoV-2M^pro活性的抑制(n＝3)。数据显示为平均值±SD。

图11显示共同给予铋药物和含硫醇药物后对Vero E6细胞中的SARS-CoV-2的影响。数据显示为平均值±SD。所有的统计分析都与对照组(0μM)比较，使用非配对的双尾学生t检验计算显著性，**P<0.01。

发明详述

I.定义

如本文所用的，“载体”或“赋形剂”是指与一种或多种活性成分组合的制剂中的有机或无机成分、天然或合成的非活性成分。

如本文所用的“治疗有效的”或“有效量”是指所使用的组合物的量是足以改善疾病或障碍的一种或多种原因或症状的量。这样的改善只需要减少或改变，不一定消除。如本文所用的，术语“治疗有效量”、“治疗量”和“药学上有效量”是同义的。本领域技术人员可以容易地确定适当的治疗量。

“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文可互换使用，并且指动物，特别是哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，诸如人。

如本文所用的，“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。

如本文使用的，“药学上可接受的盐”是指本文限定的化合物的衍生物，其中通过制备其酸式盐或碱式盐来修饰母体化合物。

如本文所用的，“治疗”是指对患者的医疗管理，目的是治愈、改善、稳定或预防疾病、病理病症或障碍。

II.组合物

公开了含铋(III)化合物，其药物制剂可单独但优选与一种或多种含硫醇的小分子组合用于治疗感染SARS-CoV-2的受试者。

A.化合物

所公开的化合物包括含铋(III)化合物和含硫醇的小分子。

(i)含铋(III)化合物

用于所公开的方法的优选含铋化合物包括基于柠檬酸铋(III)的药物(铋(III)与柠檬酸的复合物)或铋(III)卟啉。具体实例包括但不限于次柠檬酸铋，特别是胶体次柠檬酸铋(CBS)

CBS是柠檬酸的复合铋盐，其可溶于水，但在低于5的pH下沉淀。在胃液中，沉淀的最佳pH为3.5。CBS可以配制成用于口服给药的固体剂型，诸如片剂和胶囊中的药物组合物。

或

雷尼替丁柠檬酸铋(RBC)：

Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)

Bi(TPyP)：(TPyP：四(4-吡啶基)卟啉)

(ii)含硫醇的小分子

含硫醇的小分子的分子量优选小于2000道尔顿，更优选小于1500道尔顿，最优选小于1000道尔顿。

一种优选的含硫醇的小分子是N-乙酰基半胱氨酸(NAC)。NAC是一种通常在患有肺炎以及各种其他医学病症，诸如扑热息痛过量的患者中用作粘液溶解剂的FDA批准的药物⁽¹²⁾。NAC可以作为静脉内(IV)药物、口服药物和吸入药物^(13,14)。它通常是安全的，临床上几乎没有副作用，而且还表现出抗氧化、抗炎和免疫调节作用^(15,16)。然而，已知其他包含硫部分、硫醇部分、氨基硫醇部分或硫酯部分的含硫醇化合物。实例包括谷胱甘肽(GSH)、青霉胺(PCM)、卡托普利(CPL)和硫代水杨酸(TSA)、硫代硫酸钠(STS)、GSH乙酯、D-蛋氨酸、二巯基丙醇(dimecarprol)、D-β,β-二甲基半胱氨酸和硫醇阿米福汀(Ethyol或WR2721)。

B.制剂

所公开的铋(III)化合物或其药学上可接受的盐可被配制在药物制剂中。含硫醇的小分子可配制在与铋(III)化合物或其药学上可接受的盐相同的药物制剂中，并且在该实施方案中，将包含在低pH，例如pH 1.2下稳定铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的有效量的含硫醇的小分子。含硫醇的小分子可以配制在单独的药物制剂中。

药物制剂可用于通过肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)给药、肠道给药。

使用药学上可接受的“载体”制备制剂，所述药学上可接受的“载体”由被认为是安全和有效的并且可在不引起不期望的生物副作用或不想要的相互作用的情况下被给予个体的物质组成。“载体”是存在于药物制剂中除活性成分或多种活性成分以外的所有组分。术语“载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂和包衣组合物。

在一个优选的实施方案中，制剂是片剂或胶囊或胶体悬浮体的形式。在另一个优选的实施方案中，化合物是适合肌内注射或静脉内注射的形式。WO1999011848中公开了CBS的可吞服(片剂)形式。雷尼替丁柠檬酸铋可方便地配制成片剂(包括咀嚼片)、胶囊(硬的或软的类型)或配制成液体制剂，如例如第2220937A和2248185A号英国专利中所述的。一般，片剂是优选的。因此，组合物可通过常规方法用另外的载体或赋形剂，诸如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)制备。可加入第2248185A号英国专利说明书中描述的类型的碱性盐，以改善组合物的崩解速率和/或溶出速率。片剂可通过本领域内众所周知的方法包衣。制剂还可视情况含有调味剂、着色剂和/或甜味剂。

片剂可例如通过直接压制这样的混合物制备。胶囊可通过使用适当的充填机将共混物与适当的赋形剂一起填充到明胶胶囊中制备。

1.肠胃外制剂

本文所述的化合物可被配制用于肠胃外给药。

例如，肠胃外给药可包括向患者静脉内给药、皮内给药、动脉内给药、腹膜内给药、病灶内给药、颅内给药、关节内给药、前列腺内给药、胸膜内给药、气管内给药、玻璃体内给药、肌内给药、皮下给药、结膜下给药、囊内给药、心包内给药、脐内给药、注射给药和输注给药。

肠胃外制剂可以使用本领域已知的技术制备成水性组合物。一般，这样的组合物可以制备成可注射的制剂，例如，溶液或悬浮液；适合用于在注射前加入重组介质后制备溶液或悬浮液的固体形式；乳剂，诸如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体(emulsome)。

载体可以是含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油诸如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合的溶剂或分散介质。例如，可以在分散的情况下通过保持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂，使用包衣，诸如卵磷脂来保持适当的流动性。在许多情况下，将优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。

作为游离酸或碱或其药学上可接受的盐的活性化合物的溶液和分散体可在水或另一种溶剂或适当地与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合的分散介质中制备，药学上可接受的赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的表面活性剂。阴离子表面活性剂的实例包括钠、钾、铵的长链烷基磺酸盐和钠、钾、铵的烷基芳基磺酸盐，诸如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，诸如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，诸如双(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠(sodium bis-(2-ethylthioxyl)-sulfosuccinate)；以及烷基硫酸盐，诸如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，诸如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰油胺。非离子表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、聚甘油-4-油酸酯、山梨聚糖酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁醚、

401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性基乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

制剂可包含防止微生物生长的防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可包含防止(多种)活性剂的降解的抗氧化剂。

制剂一般被缓冲至3-8的pH，用于在重组后进行肠胃外给药。适合的缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。

水溶性聚合物经常被用在用于肠胃外给药的制剂中。适合的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

无菌注射液可通过将所需量的活性化合物与一种或多种上文列出的赋形剂按要求掺入适当的溶剂或分散介质中，然后进行过滤灭菌来制备。一般来说，分散体通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌溶媒中制备，所述无菌载体含有基本的分散介质和来自上文所列的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。粉末可以以这种方式制备，即颗粒本质上是多孔的，这可增加颗粒的溶解度。用于制备多孔颗粒的方法在本领域中是众所周知的。

(a)控释制剂

本文所述的肠胃外制剂可配制成用于受控释放，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。

i.纳米颗粒和微米颗粒

对于肠胃外给药，一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂可掺入微米颗粒、纳米颗粒或其组合，其提供化合物和/或一种或多种另外的活性剂的受控释放。在其中制剂包含两种或更多种药物的实施方案中，药物可被配制成相同的受控释放类型(例如延迟释放、延长释放、立即释放或脉冲释放)，或者药物可被独立配制成不同的释放类型(例如立即释放和延迟释放、立即释放和延长释放、延迟释放和延长释放、延迟释放和脉冲释放等)。

例如，化合物和/或一种或多种另外的活性剂可被掺入聚合物微米颗粒中，其提供(多种)药物的受控释放。(多种)药物的释放通过(多种)药物从微米颗粒中扩散和/或通过水解和/或酶降解对聚合物颗粒的降解来控制。适合的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。

可缓慢溶解的并在水性环境中形成凝胶的聚合物，诸如羟丙基甲基纤维素或聚氧化乙烯也可适合作为含药物微米颗粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酸酐，聚(酯酸酐)，聚羟基酸，诸如聚丙交酯(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)，聚(丙交酯-共-羟基乙酸)(PLGA)，聚3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物，聚4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物，聚己内酯及其共聚物以及其组合。

供选择地，(多种)药物可被掺入由不溶于水溶液或缓慢溶于水溶液但能够在胃肠道内降解的材料制备的微米颗粒中，所述胃肠道内降解通过包括酶降解、胆汁酸的表面活性剂作用和/或机械侵蚀的方式。如本文所用的，术语“缓慢溶于水”是指在30分钟的时间段内不溶于水的材料。优选实例包括脂肪、脂肪性物质、蜡、蜡状物质及其混合物。合适的脂肪和脂肪性物质包括脂肪醇(诸如月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、十六烷醇或十六十八醇)、脂肪酸和衍生物，其包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(单、双和三甘油酯)和氢化脂肪。具体实例包括但不限于氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、可以商品名

获得的氢化油、硬脂酸、可可油和硬脂醇。适合的蜡和蜡状材料包括天然或合成蜡、烃和普通蜡。蜡的具体实例包括蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡(candelillawax)。如本文使用的，蜡状材料被定义为在室温下通常是固体且熔点为约30至300℃的任何材料。

在一些情况下，改变水渗入微米颗粒的速率可能是期望的。为此，可将控速(芯吸)剂与上述列出的脂肪或蜡一起配制。控速材料的实例包括某些淀粉衍生物(例如蜡质麦芽糊精和滚筒干燥的玉米淀粉)、纤维素衍生物(例如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素)、藻酸、乳糖和滑石粉。此外，可加入药学上可接受的表面活性剂(例如卵磷脂)以促进这样的微米颗粒的降解。

不溶于水的蛋白，诸如玉米蛋白也可用作用于形成含药物微米颗粒的材料。此外，水溶性的蛋白、多糖及其组合可与药物一起被配制成微米颗粒，随后交联以形成不溶性网络。例如，环糊精可与单一的药物分子复合，随后交联。

ii.制备纳米颗粒和微米颗粒的方法

通过已知的药物制剂技术，可实现将药物包封或掺入载体材料中以制造含药物的微米颗粒。在脂肪、蜡或蜡状材料中的制剂的情况下，一般将载体材料加热到其熔化温度以上，然后加入药物，以形成包含悬浮在载体材料中的药物颗粒、溶解在载体材料中的药物或其混合物的混合物。随后可通过几种方法配制微米颗粒，所述方法包括但不限于固体化、挤出、喷雾冷却或水分散的方法。在一个优选的方法中，将蜡加热到其熔化温度以上，加入药物，并在混合物冷却时在不断搅拌下将熔融的蜡-药物混合物固体化。供选择地，熔融的蜡-药物混合物可被挤出和滚圆以形成颗粒或珠。这些方法在本领域中是已知的。

对于一些载体材料，可能期望使用溶剂蒸发技术以制造含药物的微米颗粒。在这种情况下，药物和载体材料共同溶解在互溶剂中，随后可通过几种技术制造微米颗粒，所述技术包括但不限于在水或其他适当的介质中形成乳液、喷雾干燥或通过从主体溶液中蒸发掉溶剂和研磨得到的材料。

在一些实施方案中，颗粒形式的药物被均匀地分散在不溶于水或缓慢溶于水的材料中。为了使组合物内的药物颗粒的尺寸最小化，在配制前可对药物粉末本身进行研磨以产生细小的颗粒。制药领域中已知的喷射研磨方法可用于此目的。在一些实施方案中，通过将蜡或蜡状物质加热到其熔点以上并在搅拌混合物的同时加入药物颗粒，将颗粒形式的药物均匀地分散在蜡或蜡状物质中。在这种情况下，可向混合物中加入药学上可接受的表面活性剂以促进药物颗粒的分散。

颗粒还可以包覆一种或多种改性的释放包衣。被脂肪酶水解的脂肪酸固体酯可被喷涂到微米颗粒或药物颗粒上。玉米蛋白是天然不溶于水的蛋白的实例。它可以通过喷涂或通过湿法造粒技术被包覆在含药物的微米颗粒或药物颗粒上。除了天然不溶于水的材料，消化酶的一些底物可用交联过程处理，导致形成不溶的网络。许多通过化学方法和物理方法两者启动的交联蛋白的方法已被报道。获得交联的最常见方法之一是使用化学交联剂。化学交联剂的实例包括醛(戊二醛和甲醛)、环氧化合物、碳二亚胺和京尼平(genipin)。除了这些交联剂之外，氧化糖和天然糖也已经被用来交联明胶。交联也可使用酶法完成；例如，转谷氨酰胺酶已被批准为用于交联海产品的GRAS物质。最后，交联可通过物理方法，诸如热处理、紫外照射和伽马照射启动。

为了在含药物的微米颗粒或药物颗粒周围产生交联蛋白的包衣层，可将水溶性蛋白喷涂在微米颗粒上，随后通过上述方法之一进行交联。供选择地，含药物微米颗粒可通过凝聚相分离(例如，通过添加盐)被微胶囊化在蛋白内，随后被交联。一些适合此目的的蛋白包括明胶、白蛋白、酪蛋白和麸质蛋白(gluten)。

多糖也可被交联以形成不溶于水的网络。对于许多多糖来说，这可通过与钙盐或多价阳离子的反应来完成，所述阳离子使主聚合物链交联。果胶、海藻酸盐、葡聚糖、直链淀粉和瓜尔胶在多价阳离子的存在下经受交联。也可形成带相反电荷的多糖之间的复合物；例如，果胶和壳聚糖可经由静电相互作用复合。

2.肠道制剂

合适的口服剂型包括片剂、胶囊、溶液、悬浮液、糖浆和锭剂。片剂可使用本领域众所周知的压制或模制技术制成。明胶胶囊或非明胶胶囊可使用本领域众所周知的技术制备成硬的或软的胶囊壳，其可包封液体、固体和半固体填充材料。

制剂可使用药学上可接受的载体制备。如本文一般地使用的，“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、膨胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。

载体还包括包衣组合物的所有成分，其可包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂和助滑剂。

合适的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯；聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及可以以商品名

(Roth Pharma，Westerstadt，德国)商购的甲基丙烯酸树脂、玉米蛋白、虫胶和多糖。

此外，包衣材料还可包含常规载体，诸如增塑剂、颜料、着色剂、助滑剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

“稀释剂”，也被称为“填充剂”，通常是增加固体剂型的体积所必需的，以便为压制片剂或形成珠和颗粒剂提供实用的尺寸。合适的稀释剂包括但不限于磷酸氢钙二水合物、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。

“粘合剂”用于赋予固体剂型制剂粘聚性，并因此确保片剂或珠或颗粒剂在形成剂型后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉，预胶化淀粉，明胶，糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨醇)，聚乙二醇，蜡，天然和合成胶，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶，海藻酸钠，纤维素，包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸铝镁(veegum)，以及合成聚合物，诸如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

“润滑剂”用于促进片剂制造。合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、甘油山萮酸酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。

“崩解剂”用于促进给药后的剂型崩解或“破裂”，一般包括但不限于淀粉、淀粉乙醇酸钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻蛋白碱(alginine)、树胶，或交联聚合物，诸如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的

XL)。

“稳定剂”用于抑制或延缓药物的分解反应，其包括，例如氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂、丁基化羟基甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐和酯；维生素E、生育酚及其盐；亚硫酸盐，诸如焦亚硫酸钠；半胱氨酸及其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯和丁基化羟基苯甲醚(BHA)。

(a)控释肠道制剂

口服剂型，诸如胶囊、片剂、溶液和悬浮液可被配制成用于受控释放。例如，可将一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂配制成纳米颗粒、微米颗粒及其组合，并包封在软的或硬的明胶或非明胶胶囊中，或分散在分散介质中以形成口服悬浮液或糖浆。颗粒可由药物和控释聚合物或基质形成。供选择地，药物颗粒可在掺入成品剂型之前用一种或多种控释包衣进行包衣。

在另一个实施方案中，一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂被分散在基质材料中，所述基质材料在与水性介质，诸如生理液体接触时胶凝或乳化。在凝胶的情况下，基质膨胀，包裹活性剂，所述活性剂随着时间通过扩散和/或基质材料的降解缓慢释放。这样的基质可被配制为片剂或配制为用于硬胶囊和软胶囊的填充材料。

在又一个实施方案中，一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂被配制成固体口服剂型，诸如片剂或胶囊，并且固体剂型用一种或多种控释包衣，诸如延迟释放包衣或延长释放包衣来包衣。一种或多种包衣也可包含所述化合物和/或另外的活性剂。

(i)延长释放剂型

延长释放制剂一般制备成扩散或渗透体系，其在本领域是已知的。扩散体系一般由两种类型的装置—储器和基质组成，其在本领域是众所周知的并有描述。基质装置一般通过将药物与缓慢溶解的聚合物载体压制成片剂形式来制备。用于制备基质装置的三种主要类型的材料是不溶性塑料、亲水聚合物和脂肪化合物。塑料基质包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水聚合物包括但不限于纤维素聚合物，诸如甲基纤维素和乙基纤维素，羟烷基纤维素，诸如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和

934，聚乙烯氧化物及其混合物。脂肪化合物包括但不限于各种蜡，诸如棕榈蜡和甘油三硬脂酸酯以及蜡类物质，包括氢化蓖麻油或氢化植物油或其混合物。

在某些优选的实施方案中，塑料材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物，包括但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酸酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酸酐)和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物。

在某些优选的实施方案中，丙烯酸聚合物由一种或多种季铵基甲基丙烯酸酯共聚物(ammonio methacrylate copolymers)组成。季铵基甲基丙烯酸酯共聚物在本领域中是众所周知的，其在NF XVII中被描述为具有少量季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。

在一个优选的实施方案中，丙烯酸聚合物是丙烯酸树脂漆，诸如可从Rohm Pharma以EUDRAGIT

的商品名商购的丙烯酸树脂漆。在进一步的优选实施方案中，丙烯酸聚合物包括可从Rohm Pharma公司分别以商品名

RL30D和

RS30D商购的两种丙烯酸树脂漆的混合物。

RL30D和

RS30D是具有少量季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，在

RL30D中铵基与其余中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比为1:20，在

RS30D中铵基与其余中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比为1:40。平均分子量为约150000。

S-100和

L-100也是优选的。代码名称RL(高渗透性)和RS(低渗透性)指的是这些试剂的渗透性质。

RL/RS混合物不溶于水和消化液。然而，形成的包含所述混合物的多颗粒体系在水溶液和消化液中是可膨胀的和可渗透的。

上述聚合物，诸如

RL/RS可按任何期望比例混合，以最终获得具有期望溶出曲线的持续释放制剂。例如，可由100％的

RL、50％的

RL和50％的EUDRAGIT

RS以及10％的

RL和90％的

RS获得期望的持续释放多颗粒体系。本领域技术人员将认识到，也可以使用其他丙烯酸聚合物，诸如，例如

L。

供选择地，可使用渗透系统或通过将半渗透性包衣施加于剂型来制备延长释放制剂。在后一种情况下，可通过将低渗透性包衣材料和高渗透性包衣材料按适当比例组合来实现期望的药物释放曲线。

上述具有不同药物释放机制的装置可组合在包括单个或多个单位的最终剂型中。多个单位的实例包括但不限于含有片剂、珠或颗粒剂的多层片剂和胶囊。立即释放部分可借助于以下添加到延长释放系统中：使用包衣或压制方法将立即释放层施加在延长释放核的顶部上，或者将立即释放层施加在多单位系统，诸如含有延长释放珠和立即释放珠的胶囊中。

含有亲水聚合物的延长释放片剂是通过本领域内公知的技术，诸如直接压制、湿法造粒或干法造粒制备。它们的制剂通常掺入聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。通常的稀释剂包括惰性粉状物质，诸如淀粉，粉状纤维素，特别是结晶和微晶纤维素，糖诸如果糖、甘露醇和蔗糖，谷物粉和类似可食用粉末。典型的稀释剂包括例如各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐诸如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是有用的。典型的片剂粘结剂包括诸如淀粉，明胶和糖，诸如乳糖、果糖和葡萄糖的物质。包括阿拉伯树胶的天然和合成胶、藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮也可以使用。聚乙二醇、亲水聚合物、乙基纤维素和蜡也可用作粘合剂。在片剂制剂中，润滑剂是必要的，以防止片剂和冲头在模具中粘连。润滑剂可选自滑的固体，诸如滑石粉、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。

含有蜡材料的延长释放片剂一般使用本领域已知的方法，诸如直接共混法、固体化法和水分散法制备。在固体化法中，将药物与蜡材料混合，并进行喷雾固体化或者固体化并筛选和加工。

(ii)延迟释放剂型

延迟释放制剂可通过用聚合物膜对固体剂型包衣产生，所述聚合物膜不溶于胃的酸性环境，而可溶于小肠的中性环境。

例如，可通过用选定的包衣材料对药物或含药物的组合物包衣来制备延迟释放剂量单位。含药物的组合物可以是例如用于掺入胶囊的片剂、在“包衣芯”剂型中用作内芯的片剂或用于掺入片剂或胶囊的多个含药物的珠、颗粒或颗粒剂。优选的包衣材料包括可生物溶蚀的、可逐渐水解的、可逐渐水溶的和/或可酶降解的聚合物，也可以是常规“肠道”聚合物。正如本领域技术人员将意识到的，肠道聚合物在下消化道的较高pH值环境中变得可溶，或在剂型通过消化道时缓慢溶蚀，而可酶降解的聚合物被存在于下消化道，特别是结肠中的细菌酶所降解。适合用于实现延迟释放的包衣材料包括但不限于纤维素聚合物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、乙基纤维素、纤维素乙酸酯、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、纤维素乙酸酯偏苯三酸酯和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯以及其他甲基丙烯酸树脂形成的，所述其他甲基丙烯酸树脂可以以商品名

(Rohm Pharma；Westerstadt，德国)，包括

L30D-55和L100-55(在5.5及更高的pH下可溶)、

L-100(在6.0及更高的pH下可溶)、

S(在7.0及更高的pH下可溶，因为酯化程度较高)，以及

NE、RL和RS(具有不同程度的渗透性和可膨胀性的水溶性聚合物)商购获得；乙烯基聚合物和共聚物，诸如聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；可酶降解的聚合物，诸如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以应用使用不同聚合物的多层包衣。

可由本领域技术人员通过评估用不同量的各种包衣材料制备的片剂、珠和颗粒剂的单独释放曲线容易地确定特定包衣材料的优选包衣重量。正是材料、方法和应用形式的组合产生期望的释放特性，可以仅由临床研究确定是哪一种。

包衣组合物可包含常规添加剂，诸如增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂、助滑剂等。增塑剂的存在通常是为了降低包衣的脆性，相对于聚合物的干重，增塑剂将一般占约10重量％至50重量％。典型增塑剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、三乙酸甘油酯(triacetin)、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化单甘酯。优选使用稳定剂来稳定分散体中的颗粒。典型的稳定剂是非离子型乳化剂，诸如山梨聚糖酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。推荐助滑剂用以减少成膜和干燥过程中的粘连效应，助滑剂一般将占包衣溶液中聚合物重量的约25重量％至100重量％。一种有效的助滑剂是滑石粉。也可以使用其他助滑剂，诸如硬脂酸镁和甘油单硬脂酸酯。颜料，诸如二氧化钛也可以使用。少量的消泡剂，诸如硅酮(例如二甲基硅油)也可添加到包衣组合物中。

正如本领域技术人员将意识到的以及如相关教科书和文献中所描述的，几种方法可用于制备提供各种药物释放曲线的含药物的片剂、珠、颗粒剂或颗粒。这样的方法包括但不限于以下：用适当的包衣材料，一般但不一定掺入高分子材料，将药物或含药物的组合物包衣，增加药物粒度，将药物置于基质中，并将药物与适当的络合剂形成络合物。

延迟释放剂量单位可使用常规技术用延迟释放聚合物包衣来包衣，例如使用常规包衣锅、无气喷涂技术、流化床包衣设备(有或没有Wurster插件)。有关用于制备片剂和延迟释放剂型的材料、设备和方法的详细信息，参见Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets，Lieberman等人编辑(New York:Marcel Dekker,Inc.,1989)，以及Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,6.sup.th Ed.(Media,PA:Williams&Wilkins,1995)。

用于制备延长释放片剂的优选方法是通过压制含药物的共混物，例如使用直接共混、湿法造粒或干法造粒方法制备的颗粒剂的共混物。延长释放片剂也可从含有合适水溶性润滑剂的湿材料开始进行模制而非压制。然而，片剂优选使用压制法而非模制法制造。用于形成延长释放含药物的共混物的优选方法是将药物颗粒与一种或多种赋形剂，诸如稀释剂(或填充剂)、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助滑剂和着色剂直接混合。作为直接共混的替代方法，可通过使用湿法造粒或干法造粒方法制备含药物的共混物。含有活性剂的珠也可通过几种常规技术中的任一种来制备，一般从流体分散体开始。例如，用于制备含药物的珠的典型方法涉及将活性剂分散或溶解在含有药用赋形剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、滑石粉、金属硬脂酸盐、二氧化硅、增塑剂等的包衣悬浮液或溶液中。混合物被用来对珠芯，诸如糖球(或所谓的“non-pareil”)包衣，所述珠芯，诸如糖球的大小为约60至20目。

用于制备药物珠的供选择的方法是通过将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂，诸如微晶纤维素、乳糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、滑石粉、硬脂酸镁、崩解剂等共混，挤出共混物，将挤出物滚圆，干燥并任选地包衣以形成立即释放珠。

III.使用方法

提供了在有其需要的受试者中治疗SARS-CoV-2感染的方法。受试者可以是哺乳动物，例如人。受试者优选是人受试者。给予组合物以减少与SARS-CoV-2感染相关的一种或多种症状。在优选的实施方案中，以抑制SARS-CoV-2解旋酶的有效量给予组合物。

在一个实施方案中，所给予的组合物是如本文所公开的一种或多种铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的制剂、一种或多种铋(III)化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种含硫醇的小分子的制剂，其中一种或多种含硫醇的小分子为在低pH，例如pH 1.2下稳定铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的有效量。

在其他实施方案中，治疗包括给予受试者本文所公开的一种或多种铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的制剂和含硫醇的小分子的制剂，同时给予或依次给予。在该实施方案中，所给予的含硫醇的小分子在低pH例如pH 1.2下有效地稳定铋(III)化合物或其药学上可接受的盐。以铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的3或10摩尔当量使用经给予在低pH，例如pH 1.2下有效地稳定铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的含硫醇的小分子。

优选的含硫醇的小分子是NAC。

在一些实施方案中，受试者已经或将暴露于病毒。在优选的实施方案中，受试者已经暴露于病毒或正在经历活性病毒感染，其由一种或多种与COVID 19相关的症状确认。症状包括但不限于发热、鼻窦和/或肺充血、流鼻涕或鼻塞、咳嗽、打喷嚏、喉咙痛、身体疼痛、疲劳、气短、胸闷、呼气时喘息、寒战、肌肉疼痛、头痛、腹泻、疲倦、恶心、呕吐及其组合，并且使用已知的用于测试受试者被SARS-CoV-2感染的方法，受试者可以或可以不被诊断为具有SARS-CoV-2感染。目前COVID-19分子诊断的黄金标准是基于通过实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)的SARS-CoV-2RNA检测的。

组合物也可预防性地给予，以例如减少或防止未来暴露于病毒的影响和可能与之相关的感染。因此，在一些实施方案中，受试者尚未暴露于病毒和/或还未经历活性病毒感染。在一些实施方案中，受试者是健康受试者。然而，在一个特别优选的实施方案中，给予组合物以改善受试者的一种或多种COVID 19症状。

所公开的方法将通过以下非限制性实施例来理解。

在一个实施方案中，给予受试者减少一种或多种COVID 19症状的有效量的含有铋(III)化合物的组合物。在一个优选的实施方案中，组合物含有基于柠檬酸铋(III)的药物(铋(III)与柠檬酸的复合物)或铋(III)卟啉。

例如，可给予受试者含有有效量的单独的或与含硫醇的小分子，诸如NAC组合的铋化合物的组合物，铋化合物包括但不限于次柠檬酸铋，例如胶体次柠檬酸铋(CBS)

或

雷尼替丁柠檬酸铋(RBC：

在其他实施方案中，可给予受试者包含铋(III)卟啉化合物，例如Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)的组合物

Bi(TPyP)：(TPyP：四(4-吡啶基)卟啉)

可用一种或多种所公开的化合物治疗受试者，治疗方案有效地减少一种或多种COVID 19症状，优选地，治疗方案有效地抑制SARS-CoV-2解旋酶。

与在对照受试者中给予含铋化合物，不给予一种或多种含硫醇的小分子相比，以有效增加铋的血药浓度、延长T_最大并增加AUC_0→12h的量给予含硫醇的小分子。

所公开的方法将通过以下非限制性实施例理解。

实施例

材料和方法

化学品、病毒和细胞系

胶体柠檬酸铋(De-Nol/CBS)和雷尼替丁柠檬酸铋(Pylorid)由丽珠医药集团(Livzon Pharmaceutical Group)友情提供。当前研究中使用的RBC具有雷尼替丁：Bi(iii)：柠檬酸＝1：1：1的组成，分子式为C₁₉H₂₇N₄O₁₀SBi²³。Bi(TPP)、Bi(TPyP)和Bi(NTA)如前所述地制备³⁶。醋硫葡金购自MedChemExpress(MCE)。CBS和NAC的组合是在实验前通过物理混合CBS和适当摩尔当量的NAC，然后用0.05M NaOH调节pH值在5-6范围内新制备的。次水杨酸铋(BSS)和次没食子酸铋(BGS)从Alfa Aesar获得。Bi(NTA)₃如前所述地制备⁽¹⁾。硫酸卡那霉素和Luria-Bertani(LB)肉汤粉购自Affymetrix。所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich公司，除非另有说明，并且直接使用，而不进一步纯化。

本研究中使用的细胞系是根据它们对相应冠状病毒复制的敏感性而选择的。

SARS-CoV-2(HKU-001a毒株)(GenBank登录号：MT230904)和B.1.1.7变异株(GISAID登录号：EPI_ISL_1273444)是从香港的一名实验室证实的COVID-19患者的鼻咽抽吸物样本中分离的³⁷。

人结肠上皮细胞(Caco2)和非洲绿猴肾(VeroE6)细胞以及人肺上皮细胞(Calu-3)均购自ATCC(未经进一步认证，经PlasmoTest(InvivoGen)确认无支原体污染)，并维持在补充有10％的胎牛血清(FBS，Gibco，Paisley，英国)、1％的青霉素-链霉素(Gibco BRL，GrandIsland，NY，美国)和1％的非必需氨基酸(Gibco BRL，Gibco，Grand Island，NY，USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养基中。

猴Vero E6细胞(ATCC，CRL-1586)在补充有10％FBS、50U mL^-1青霉素和50μg mL^-1链霉素的DMEM中培养。人胚胎肺成纤维细胞(HELF)是内部开发的。细胞保持在37℃下、5％CO₂和90％的相对湿度的气氛中。

SARS-CoV-2假病毒颗粒(用SARS-CoV-2刺突蛋白假型化的复制缺陷型小鼠白血病病毒(MLV))购自eEnzyme(货号SCV2-PsV-001)。MERS-CoV毒株(HCoV-EMC/2012)是来自RonFouchier博士的赠品⁽³⁾。hCoV-229E毒株来自先前的收集^(4,5)。如前所述³⁸，所有使用活病毒的实验都是在香港大学玛丽医院(Queen Mary Hospital)中使用3级生物安全级别设施进行的。

细胞活力试验

如前所述，进行

发光试验(Promega公司，Madison，WI，美国)以检测选定化合物的细胞毒性³⁹。简言之，将VeroE6细胞(每孔4×10⁴个细胞)和Caco2细胞(每孔4×10⁴个细胞)与不同浓度的单一化合物在96孔板中孵育48小时，然后加入底物，10分钟后测量亮度。Ridaura和Au(PEt3)Cl溶解在DMSO中，DMSO在培养基中的最终百分比保持在1％。药物化合物的50％细胞毒性浓度(CC₅₀)值通过Sigma plot(SPSS)在Excel插件ED50V10中计算。

动物

所有的实验都得到了香港大学的教学与研究活体动物使用委员会(Committee onthe Use of Live Animals in Teaching and Research，CULATR)的批准，并按照CULATR批准的指南进行。

对于小鼠实验，体重为18-22克的6至8周龄雌性BALB/c小鼠购自Charles RiverLaboratories,Inc.。所有的动物过程都得到了香港大学的CULATR的批准(参考代码：CULATR 5079-19)。对于大鼠相关实验，体重为200-220克的Sprague Dawley大鼠由香港中文大学的实验动物服务中心(the Laboratory Animal Services Center)提供。动物实验是在香港中文大学动物伦理委员会(Animal Ethics Committee)的批准下进行的(参考代码：19/074/GRF-5-C&(19-589)，DH/SHS/8/2/1Pt.22中)。所有的动物在开始相应的实验前都被随机地关在生物安全级别房舍里，并自由取食标准颗粒饲料和水。

对于仓鼠实验，体重为70-100克的6至10周龄雄性和雌性叙利亚仓鼠通过香港大学比较医学研究中心(the HKU Centre for Comparative Medicine Research)从香港中文大学实验动物服务中心(the Chinese University of Hong Kong Laboratory AnimalService Centre)获得。仓鼠被饲养在2级生物安全等级的房舍中，并且如前所述自由取食标准颗粒饲料和水^(2,7)。所有的实验方案都得到了香港大学的CULATR的批准，并按照3级生物安全等级动物设施的标准操作程序进行(参考代码：CULATR5370-20)。

通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)分析铋

使用ICP-MS来监测所有被研究受试者的铋水平。本研究中使用了配备有玻璃同心雾化器的基于四极杆的电感耦合等离子体质谱仪(ICPMS)(Agilent 7700x，AgilentTechnologies，CA)。样品被稀释到适当的浓度，使用微型同心雾化器将其喷成气溶胶，直接引入ICP进行时间分辨ICP-MS测量。当测量的信号超过标准曲线的线性范围时，样品被进一步稀释。根据在1％硝酸中的标准曲线或各个器官和血液的空白对照溶液，计算被研究物质中的铋含量(Bi²⁰⁹)。每次测量中监测仅一种同位素。

列出主要参数如下：射频功率(1300千瓦)；喷雾室(Scott喷雾室)；雾化器(MicroMist雾化器)；镜头：(Ni)；雾化器气体流量(0.8mL min^-1)；采集模式：(TRA时间分辨分析)；停留时间：100ms；反应气体(无气体)；温度(2℃)。铋标准溶液通过稀释多元素校准标准(Fluka Analytical，90243)制备。测量过程中使用内标(10μg L^-1；AgilentTechnologies，5188-6525)。

化学稳定性

应用模拟胃液、磷酸盐缓冲盐水和碳酸氢钠缓冲液来模拟pH 1.2、7.4和9.2的环境。模拟胃液是通过将NaCl(0.2克)和胃蛋白酶(0.32克)溶解在约70mL的去离子水中制备的。然后用10M HCl将pH调整到1.2。最后用去离子水将体积调整到100mL。磷酸盐缓冲盐水由2.7mM氯化钾、1.8mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠和10mM磷酸氢二钠制成。用HCl将pH调整到7.4。通过将NaHCO₃溶到去离子水中并将pH调整到9.2制备150mM的碳酸氢钠溶液。

为了监测铋-NAC在不同pH下的稳定性，通过将适量的NAC加入10mM CBS溶液中，制备1：1、1：3和1：10比例的铋-NAC混合物。将每种铋-NAC(500μL)与pH缓冲液(500μL)混合并孵育24小时。将混合物离心，将每种上清液等分到不同管中作为样品，随后对其进行ICP-MS以测量上清液中的剩余铋含量。

铋-硫醇混合物是通过将NAC滴定到铋药物溶液中制备的。通过将适量的NAC分别加入CBS(10mM)和RBC(10mM)的溶液中制备比例为1：3的Bi-NAC混合物。BSG和BSS与NAC的混合物是通过分别将适量的BSG和BSS粉末以1：10的摩尔比溶解在NAC(100mM)中得到的。通过分别将适量的还原型谷胱甘肽(GSH)和青霉胺(PCM)加入CBS(10mM)溶液中制备比例为1：3的Bi-硫醇混合物。CBS和卡托普利(CPL)的混合物以1：10的比例制成。对于硫代水杨酸(TSA)，首先将其与10％的DMSO和30％的PEG溶于去离子水中，与CBS溶液按1：1的比例混合。然后将铋-硫醇混合物(2mL)加至上述pH缓冲液(2mL)。拍摄照片作为记录，并在图S1中显示。

平行人工膜渗透性试验(PAMPA)

使用PAMPA来测定在不存在或存在NAC的情况下铋的渗透。通过在PBS(pH 1.2)中加入CBS(2.5mM)、CBS(2.5mM)+1NAC(2.5mM)、CBS(2.5mM)+3NAC(7.5mM)、CBS(2.5mM)+10NAC(25mM)、CBS(2.5mM)+20NAC(50mM)制备供体(顶端)溶液。将约5μL在十二烷中的鸡蛋卵磷脂(1％重量/体积)加在供体板中的每个孔的人工膜上，用于膜的活化。随后，在受体板(BioAssay System，美国)的每个孔中加入400μL的受体溶液，并由在每个孔中有200μL等份的供体溶液的供体板覆盖。将体系在室温下孵育16小时，然后通过ICP-MS测量起始溶液和孵育后的供体溶液中每种被研究物质的铋浓度。试验以一式三份进行。

体外Caco-2渗透性试验

根据如前述描述的方法，通过使用Caco-2渗透性试验评估CBS在不存在或存在NAC的情况下的体外渗透性⁽⁸⁾。

简言之，通过用0.05％的胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL，Gibco，Grand Island，NY，美国)进行胰蛋白酶化来传代培养汇合度为80-90％的Caco-2细胞，并以每孔1-2×10⁵个细胞的密度铺在包被胶原蛋白(I型胶原蛋白大鼠尾溶液，ST.Louis，MO，美国)的六孔板Transwell小室(24mm内径，0.4μm孔径，4.67cm²，聚碳酸酯过滤器，Corning Costar Co.NY，美国)上，并在转运实验前培养21天。根据制造商的说明，用STX2电极组通过上皮细胞电压计(EVOM2，World Precision Instruments Inc.，Berlin，德国)监测每个孔的跨上皮细胞电阻(TEER)值，以确保单层的完整性。本研究中使用TEER高于600Ωcm²的细胞单层。

对于转运研究，在转运缓冲液[含有酚红的Hank's平衡盐溶液(pH 7.4，HBSS，Grand Island，NY，美国)]中制备CBS(150μM)和CBS(150μM)+10NAC(1.5mM)，并在供体(顶端)室中分别载入1.5mL等份，然后在受体(基底外侧)室中加入2.5mL转运缓冲液。以不同的时间间隔(10、20、30、40、50、60分钟)从受体室抽出0.1mL等份的样品，并立即在受体室内补充等体积的空白转运缓冲液。试验以一式三份进行。将从转运研究中收集的样品用1％的HNO₃稀释到适当的浓度，然后进行从供体侧转运到受体侧的铋含量的ICP-MS测量。在转运研究结束时，用PBS清洗6次后还收集了单层上的Caco-2细胞，在光学显微镜下用血细胞计数仪对细胞数量计数。得到的细胞团用69％的HNO₃酸化，并适当稀释，用于测量细胞中的铋累积。来自不同处理组的CBS的表观渗透系数(P_app，cm/s)通过以下公式计算(9)：

其中，dQ/dt(μmol/s)是时间t时的累积浓度，C(μM)是供体室中测试药物的初始浓度，A(cm²)是单层的表面积。

离体外翻肠囊模型

根据修改后的方法^(10,11)使用离体外翻肠囊模型。为了制备外翻的肠囊，在大鼠被处死后即刻迅速从其分离小肠，然后用0.9％的生理盐水清洗几次。在充氧介质[Krebs–Henseleit溶液(pH 7.4、1.25mM NaHCO₃、pH 7.4、5.9mM NaCl、23.5μM KCl、60μM MgSO₄、62.5μM CaCl₂、60μM KH₂PO₄、550μM葡萄糖)]中从肠中分割出十二指肠(约4cm)，轻轻外翻，清洗，套到玻璃棒上，并用编织丝固定。在一端夹住十二指肠，并填充1mL等份的新鲜充氧介质，随后用第二个夹子密封，得到使用编织丝缝合的长约3cm的外翻肠囊。

在37℃下，在分别补充有CBS(200μM)、CBS(200μM)+1NAC(200μM)、CBS(200μM)+3NAC(600μM)、CBS(200μM)+10NAC(2mM)的充氧介质中透析外翻肠囊(每组n＝3)。以不同的时间间隔(15、30、45、60分钟)从肠囊中抽取50μL等份的样品，并立即在肠囊中补充等体积的充氧介质。在取出最后的样品后测量每个肠段的长度和宽度。如上所述，通过ICP-MS测量转运到肠囊内的铋含量。

体内药代动力学研究

为了评估NAC对血铋含量的影响，Balb/c小鼠组(每组n＝3)分别口服给予CBS(150mg/kg)、CBS(150mg/kg)+3NAC(180mg/kg)、CBS(150mg/kg)+10NAC(610mg/kg)、CBS(150mg/kg)+20NAC(1220mg/kg)。小鼠在用药后0.5小时和1小时被处死，将每只小鼠的约600μL血液收集于肝素化离心管中。血液用HNO₃酸化，并进行ICP-MS用于铋含量测量。收集来自未经治疗的小鼠的血液，并用作对照以消除基质效应。为了测量在小鼠肺中的铋累积，Balb/c小鼠组(每组3只)分别口服给予CBS(150mg/kg)+10NAC(610mg/kg)1天，连续2天，连续3天。用0.9％生理盐水灌注心脏后，解剖肺组织，用69％HNO₃酸化，用于通过使用ICP-MS测量铋含量。

为了测量从上述小鼠研究中确定的最佳NAC与CBS组合的详细药代动力学曲线，大鼠在实验前一天接受了插管小手术，在左颈静脉中插入聚乙烯管(内径0.4mm×外径0.8mm，Harvard Apparatus，美国)，然后过夜恢复并禁食。两组大鼠(每组5只)口服给予1mL等份的CBS(150mg/kg)或CBS(150mg/kg)+10NAC(610mg/kg)。在给药后的0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、12、24小时，各个组经由颈静脉插管将约200μL大鼠血液采集至肝素化离心管。给药后12小时允许大鼠自由取食。所有的大鼠在用药后24小时被处死，然后用200mL生理盐水进行心脏灌注以收集主要器官，包括脾脏、肝脏、肺、肾脏和大脑，用于进一步分析。对于组织的消化，使用了源自美国环保局3050B(USEPA，1996)的修改方案。简言之，将约0.2～0.3克的各个大鼠器官样品放入15mL的聚丙烯管中，用1mL 69％的HNO₃在65℃下消化16小时，同时100μL的大鼠血液用等体积的69％的HNO₃在65℃下消化16小时。冷却到室温后，将样品稀释至1％硝酸至最终体积为3mL，用于进一步使用。为了消除基质效应，还从未治疗的大鼠收集血液和器官，并在相同的条件下消化，用作空白对照。通过将铋的多元素校准标准品分别稀释到各个器官和血液空白对照中制备了标准溶液。然后通过ICP-MS测量每个器官或血液样品中的铋含量，并根据各个空白对照的标准曲线进行计算。通过采用Phoenix WinNonlin6.4版(Pharsight Corporation，Mountain View，CA，美国)进行的非房室分析测定包括峰值浓度(C_最大)、浓度时间曲线下面积(AUC)和达到C_最大的时间(T_最大)的药代动力学参数。

肾毒性测试

小鼠组(每组4只)分别连续4天口服给予作为溶媒的水、CBS(500mg/kg)和CBS(500mg/kg)+3NAC(580mg/kg)。在最后一次用药后的1、7、14、28天处死小鼠，根据制造商的说明收集小鼠血清用于血尿素氮测试(ThermoFisher，美国)和肌酐测试(CaymanChemical，MI，美国)。从未治疗的小鼠中分离出的血清作为对照。

噬斑减少试验

如前述描述地且略作修改⁴⁰，进行噬斑减少试验以绘制单一化合物的50％抗病毒有效剂量(EC₅₀)。简言之，在进行试验的前一天，将VeroE6细胞以每孔4×10⁵个细胞接种在12孔组织培养板中。孵育24小时后，在存在或不存在药物化合物的情况下，将50个噬斑形成单位(PFU)的SARS-CoV-2加到细胞单层，并在37℃下、在5％CO₂中进一步孵育板1小时，然后通过抽吸培养基和用DMEM清洗一次除去未结合的病毒颗粒。然后用含有1％低熔点琼脂糖(Cambrex Corporation，New Jersey，美国)的Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)和适当浓度的单一化合物覆盖单层，倒置并如上述再孵育72小时。然后用10％的甲醛(BDH，Merck，Darmstadt，德国)将孔固定过夜。移除琼脂糖塞后，用0.7％的水晶紫(BDH，Merck)对单层进行染色，并对噬斑进行计数。测定每种药物化合物浓度相对于对照(即不添加化合物)孔的噬斑抑制百分比。EC₅₀是在Excel插件ED50V10中使用Sigma plot(SPSS)计算的。选择性指数计算为CC₅₀与EC₅₀的比率。

如先前描述地且稍作修改^(2,15)，在使用NAC的研究中，进行噬斑减少试验以估算半数最大有效浓度(EC₅₀)。简言之，在进行试验的前一天，将VeroE6细胞以4×10⁵个细胞/孔接种在12孔的组织培养板上。孵育24小时后，在加入或不加入不同浓度的CBS、NAC或CBS+3NAC的情况下，将50个噬斑形成单位(PFU)的SARS-CoV-2加到细胞单层。在37℃和5％的CO₂下，将板进一步孵育1小时，然后通过抽吸培养基并用DMEM清洗一次来除去未结合的病毒颗粒。然后用含有1％在DMEM中的低熔点琼脂糖(Cambrex Corporation，New Jersey，美国)和适当浓度的曲古抑菌素A的培养基覆盖单层，倒置并如上述再孵育72小时。然后用10％的甲醛(BDH，Merck，Darmstadt，德国)将孔固定过夜。除去琼脂糖塞后，用0.7％的水晶紫(BDH，Merck)对单层进行染色，并对噬斑计数。测定每种浓度的药物化合物相对于对照(即没有添加化合物)孔的噬斑抑制百分比。EC₅₀是在Excel插件ED50V10中使用Sigma plot(SPSS)计算的。噬斑减少测试实验以一式三份进行，并重复两次用于确认。

病毒载量减少试验

如前所述并作修改⁴¹，对VeroE6和Caco2细胞进行病毒载量减少试验。在感染后(hpi)48小时收获来自感染细胞(0.1MOI)的上清液样品，用于病毒复制的qRT-PCR分析。简言之，用400μL的AVL缓冲液裂解100μL的病毒上清液，然后用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提取总RNA。如先前所述¹⁵，将实时一步qRT-PCR用于使用QuantiNovaProbe RT-PCR试剂盒(Qiagen)和LightCycler 480Real-Time PCR系统(Roche)对SARS-CoV-2病毒载量的定量。每20μL反应混合物包含10μL的2×QuantiNova Probe RT-PCRMaster Mix、1.2μL的无RNase水、0.2μL的QuantiNova Probe RT-Mix、各1.6μL的10μM正向引物和反向引物、0.4μL的10μM探针和5μL作为模板的提取的RNA。反应在45℃下孵育10分钟进行逆转录，在95℃下变性5分钟，然后进行95℃下5秒和55℃下30秒的45个循环。在退火步骤后在每个循环中进行信号检测和测量。引物和探针序列是针对先前描述的SARS-Cov-2的RNA依赖性RNA聚合酶/解旋酶(RdRP/Hel)基因区的⁴²。

在其他研究中，用不同浓度的CBS或CBS+3NAC处理SARS-CoV-2感染(MOI＝0.01)的Vero E6细胞。如先前描述地并做修改^(13,14)，在感染后(hpi)48小时收集细胞培养上清液用于病毒RNA提取和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。引物和探针序列是针对SARS-CoV-2的RNA依赖性RNA聚合酶/解旋酶(RdRP/Hel)基因区的：正向引物：5'-CGCATACAGTCTTRCAGGCT-3'(SEQ ID NO:6)；反向引物：5'-GTGTGATGTTGAWATGACATGGTC-3'(SEQ ID NO:7)；特异性探针：5'-FAMTTAAGATGTGGTGCTTGCATACGTAGAC-IABkFQ-3'(SEQ IDNO:8)。病毒载量降低实验以一式三份进行，重复两次用于确认。

时间加药进程试验

进行了时间加药进程试验以研究化合物对SARS-CoV-2生命周期的哪个阶段进行干扰。简言之，将VeroE6细胞接种在24孔板中(2×10⁵个细胞/孔)。用SARS-CoV-2(MOI＝2)感染细胞，然后孵育1小时。然后去除病毒接种物，用PBS清洗细胞两次。在感染后1小时(即进入后)，将适当浓度的选定药物加到被感染的细胞，然后在37℃、5％CO₂下孵育至感染后9小时(即一个病毒生命周期)。对于“感染后-2至0小时”的时间点(即预孵育)，在SARS-CoV-2接种前2小时加入药物，并在0小时去除药物，随后如上所述进行病毒接种。对于“感染后0-1小时”时间点(即共同感染)，在感染后0小时与病毒接种一起加入药物，然后在感染后1小时去除药物，在新鲜培养基中孵育至感染后9小时。感染的整个过程中维持的药物作为阳性对照，而DMSO则作为阴性对照包括在四个处理中的每一个中。在感染后9小时，收集每个时间点实验的细胞培养上清液，用于如上所述的使用qRT-PCR测量病毒产量。

对于使用CBS+3NAC的实验，将Vero E6细胞接种在96孔板中(每孔4×10⁴个细胞)。以1.5的MOI用SARS-CoV-2HKU-001a感染细胞，然后再孵育1小时。然后去除病毒接种物，用PBS清洗细胞两次。在接种后1小时(即进入后)，将浓度为1000μM的CBS+3NAC在指示时间点加到感染细胞，然后在37℃、5％CO₂下孵育至接种后10小时(即一个完整的病毒生命周期)。接种后10小时固定细胞，用于使用靶向SARS-CoV-2NP的免疫荧光试验对感染细胞的百分比量化。

蛋白纯化

基因克隆和蛋白纯化是按照先前描述的方法进行的^(17,18)。将编码SARS-CoV-2木瓜蛋白酶样蛋白酶(PL^pro)(ORF1ab多聚蛋白残基1564-1882)、主要蛋白酶(M^pro)(ORF1ab多聚蛋白残基3264-3569)的基因被分别克隆到表达载体pETH中，将编码SARS-CoV-2解旋酶(Hel)(ORF1ab多聚蛋白残基16237-18039)的基因克隆到表达载体pET28-a(+)中。重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达，并根据制造商的说明使用加载Ni²⁺的HiTrap螯合系统(GEHealthcare)纯化。使用HiLoad 16/600Superdex 200制备级柱(GE Life Sciences)通过凝胶过滤进一步纯化产物。每种蛋白的纯度通过12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行评估。Apo-SARS-CoV-2PL^pro(20μM)通过在Zn²⁺螯合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA，2mM TCEP，20％甘油)中的透析制备，并通过超滤(Amicon)除去多余的EDTA。每种蛋白的浓度都是通过使用二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒(Sigma-Aldrich)来测定的。

免疫荧光显微镜检查

用SARS-CoV-2(MOI＝0.1)感染Vero E6细胞，并分别暴露于作为溶媒的水、CBS(1000μM)、NAC(1000μM)和CBS(1000μM)+3NAC(3000μM)的处理达24小时。用针对SARS-CoV-2-N核衣壳蛋白(NP)的内部兔抗血清检测SARS-CoV-2感染的细胞中抗原的表达。细胞核用来自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，美国)的4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸染色剂标记。Alexa Fluor二抗获自Thermo Fisher Scientific。用来自Thermo FisherScientific的Diamond Prolong Antifade封固剂进行封固。

所选化合物在叙利亚金黄仓鼠模型中的抗SARS-CoV-2评估

年龄为6-10周龄的雄性和雌性叙利亚仓鼠被饲养在生物安全级别的房舍中，并如先前的描述，自由取食标准颗粒饲料和水¹⁹。所有的实验方案都得到了香港大学动物伦理委员会(CULATR)的批准，并按照3级生物安全级别动物设施的标准操作程序(参考代码：CULATR 5370-20)进行。

实验中，在腹膜内氯胺酮(200mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉下，每只仓鼠鼻内接种在100μL PBS中的10⁴PFU的SARS-CoV-2。病毒攻击后6小时，向仓鼠腹膜内给予Pylorid(150mg/kg/day)或瑞德西韦(25mg/kg/day)或PBS(未治疗的对照)，持续连续四天。

每天两次监测动物的临床疾病体征。它们的体重和存活在感染后被监测了14天。每组中的五只动物在感染后4天时被处死，用于病毒学和组织病理学分析。收集肺和鼻甲的组织样本。分别通过TCID₅₀和qRT-PCR方法检测组织匀浆中的病毒产量。仓鼠肺的细胞因子和趋化因子谱是通过使用基于探针的一步式qRT-PCR(Qiagen)的2^-ΔΔCT方法检测的。每种基因检测的探针和引物序列列于表3中。

表3.探针和引物序列

*基于SYBR Green的检测，不使用探针

根据已建立的方案³⁸，通过H&E染色和免疫荧光染色对受感染动物的组织病理进行检查。

为区分肺部病理，通过对细支气管、肺泡和血管的损伤严重程度进行分级对肺部组织进行半定量的组织学评分，累积总分如下。细支气管：0，结构正常；1，轻度细支气管周围浸润；2，细支气管周围浸润加上皮细胞死亡；3，2分和细支气管壁内浸润和上皮细胞脱落。肺泡：0，结构正常；1，肺泡壁增厚和充血；2，局灶性肺泡腔浸润或渗出；3，弥漫性肺泡腔浸润或渗出或出血。血管：0，结构正常；1，轻度血管周围水肿或浸润；2，血管壁浸润；3，严重内皮浸润。

为了NAC研究，在腹膜内氯胺酮(200mg/kg体重)和赛拉嗪(10mg/kg体重)麻醉下，每只仓鼠鼻内接种在100μL PBS中的10⁵p.f.u.的SARS-CoV-2(SARS-CoV-2HKU-001a)。从感染后(dpi)-3天到感染后1天，每天一次向仓鼠分别口服给予作为溶媒的水、CBS、NAC和CBS+3NAC，持续连续四天。每天两次监测动物的临床疾病体征。每组的8只动物在感染后2天被安乐死，用于病毒学和组织病理学分析。肺组织样品被分离出来。通过qRT-PCR方法检测组织匀浆中的病毒产量。仓鼠肺的细胞因子和趋化因子谱通过使用基于探针的一步式qRT-PCR(Qiagen)的2^-ΔΔCT方法检测。根据已建立的方案⁽¹⁶⁾，通过H&E和免疫荧光染色对受感染动物的组织病理学进行检查。

基因克隆和SARS-CoV-2解旋酶质粒的构建

SARS-CoV-2解旋酶(即nsp13)是病毒多聚蛋白ORF1ab的裂解产物(非结构蛋白)之一。nsp13的编码序列在严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2的Wuhan-Hu-1分离株的完整基因组(NCBI GenBank登录号：NC_045512.2)的16237至18039范围内。既没有起始密码子也没有终止密码子。在Veriti^TM 96孔热循环仪(Applied Biosystems)中通过

高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)，使用nCoV-nsp-13-F(BamHI)：CGGGATCCATGGCTGTTGGGGCTTGTGTTCTT(SEQ ID NO:1)和nCoV-nsp-13-R(XhoI)：CCGCTCGAGTCATTGTAAAGTTGCCACATTCCTAC(SEQ ID NO:2)的引物对从病毒cDNA扩增出全长nsp13的DNA片段。使用随机六聚体引物，通过转录子第一链cDNA合成试剂盒(Roche)由病毒RNA合成cDNA。热循环条件：98℃持续30秒(初始变性)，然后进行30个扩增循环(98℃30秒，62℃10秒和72℃2分钟)。PCR产物通过BamHI和XhoI消化，然后用T4 DNA连接酶插入质粒pET28-a(+)中，生成pET28-nsp13，这产生His₆-和T7-标记的解旋酶。在测序验证之前，将连接产物转化到大肠杆菌(E.coli)DH10B。然后将验证的质粒pET28-nsp13转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

SARS-CoV-2解旋酶的过表达和纯化

将携带pET28-nsp13的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃下在补充50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养过夜。然后在1L LB培养基中以1：100的稀释因子扩增培养物，直到OD₆₀₀达到0.6。在以200rpm搅拌下用200mM的IPTG在25℃下诱导解旋酶的过表达16小时。过表达后，通过以5000g在4℃下离心10分钟收集细菌团，并用结合缓冲液A[20mM Tris-HCl，pH6.8，500mM NaCl，20mM咪唑]清洗一次。将细菌团重悬在补充有0.1％Triton X-100和cOmplete^TM蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail)(Roche)的缓冲液A中，通过超声处理裂解。细菌裂解液在4℃下以13000g离心30分钟。将上清液装到缓冲液A-平衡的5mL Ni(II)带电荷的

螯合柱(GE Life Sciences)上，然后将其用缓冲液A清洗。重组蛋白用线性梯度的洗脱缓冲液B[含有250mM咪唑的缓冲液A]洗脱。使用SDS-PAGE检查收集到的洗脱液馏分，将最纯净的馏分汇集在一起，进行His₆-标签的凝血酶消化。消化的蛋白溶液被装到5mL的

螯合HP柱上，以去除His₆-标签和未消化的蛋白。使用

16/600

200制备级柱(GE Life Sciences)和凝胶过滤缓冲液C[20mM Tris-HCl、pH 6.8、250mM NaCl]，通过凝胶过滤进一步纯化产物。使用

FPLC系统(GE LifeSciences)进行蛋白纯化。

ATP酶试验

ATP酶试验是使用ATP酶试验试剂盒(ab234055，Abcam，Cambridge，MA，美国)基于改进的如前所述的方法¹⁶通过测量磷酸盐的释放进行的。在48μL的体积中，一般将2nM的蛋白与不同浓度的Pylorid在ATP酶反应缓冲液[20mM Tris-HCl、pH 7.4、5mM MgCl₂、2mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)]中在25℃下孵育5分钟，随后加入1μL的100mM ATP和1μL的2mg ml^-1多聚尿苷酸(poly(U))以启动反应。向每个孔加入约15μL反应显影剂，并显色15分钟。随后使用

iD3多模式酶标仪在650nm处对混合物进行吸光度测量。相对ATP酶活性是样品在Pylorid存在下的活性与对照样品的活性之间的比率，因此以百分比表示。试验以一式三份进行，并在不同的天数重复。

基于FRET的DNA双链解旋试验

基于FRET的试验是基于改进的先前描述的方法¹⁶进行的。合成DNA低聚物并通过HPLC纯化：FL-Cy3寡(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAGCACCGCTGCGGCTGCACC(Cy3)-3')(SEQID NO:3)、RL-BHQ寡(5'-(BHQ2)GGTGCAGCCGCAGCGGTGCTCG-3')(SEQ ID NO:4)和RL寡(5'-GGTGCAGCCGCAGCGGTGCTCG-3')(SEQ ID NO:5)和RL寡(5′-GGTGCAGCCGCAGCGGTGCTCG-3′)(Metabion GmbH，德国)⁽¹⁸⁾。在退火缓冲液[20mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl]中，两种寡聚物以FL-Cy3：RL-BHQ为1：1.5的比例混合，最终浓度分别为10μM和15μM，并通过在热循环仪(S1000^TM热循环仪，Bio-Rad)中加热到90℃持续2分钟退火，然后以约1℃/分钟的速度缓慢冷却到25℃。FRET试验是通过在96孔黑色聚苯乙烯微孔板(

)中在25℃下将10nM的蛋白与不同浓度的Pylorid在48.5μL的解旋酶反应混合物[20mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，150mM NaCl，0.1mg/mL BSA、5mM MgCl₂、5mM TCEP、5％甘油]中孵育进行的，然后加入0.5μL 100mM ATP和1.5uL寡核苷酸混合物，以使FL-Cy3：RL-BHQ寡核苷酸和RL寡核苷酸的最终浓度分别为5nM和10nM。反应孵育2分钟，然后使用

iD3多模式酶标仪测量荧光的变化(λ_ex＝550nm,λ_em＝620nm)，以确定DNA双链解旋的程度。相对DNA解旋活性是样品在Pylorid存在下的活性与对照样品的活性之间的比率，因此以百分比表示。试验以一式三份进行，并在不同的天重复。

对于使用NAC的实验，在96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Corning)中在室温下将SARS-CoV-2Hel(10nM)与不同浓度的CBS和CBS+3NAC在反应缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4，10mM NaCl，0.1mg mL^-1牛血清白蛋白(BSA)，5mM MgCl₂，0.5mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)，5％甘油)中孵育，然后加入0.5μL 100mM ATP和1.5μL寡核苷酸混合物，以使得FL-Cy3：RL-BHQ寡核苷酸和RL寡核苷酸的最终浓度分别为5nM和10nM。检测荧光(λ_ex＝550nm,λ_em＝620nm)以确定DNA双链的解旋。相对dsDNA解旋活性是样品在铋药物存在下的活性与对照的活性之间的比率，因此以百分比表示。试验以一式三份进行。

对于使用NAC的实验中的ATP酶活性抑制，通过使用先前描述的方法⁽¹⁸⁾以ATP酶检测试剂盒(ab234055，Abcam)测量磷酸盐的释放进行比色检测。一般，在室温下将SARS-CoV-2Hel(2nM)与不同浓度的CBS和CBS+3NAC在反应缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 6.8、10mMNaCl、5mM MgCl₂、0.5mM TCEP、5％甘油)中孵育30分钟，然后加入ATP(2mM)和多聚尿苷酸(0.4mg mL^-1)以启动反应。在50μL的反应体系中加入15μL的反应显影剂，显色15分钟。在650nm处测量吸光度以确定ATP酶活性。相对ATP酶活性是样品在铋药物存在下的活性与对照的活性之间的比率，因此以百分比表示。试验以一式三份进行。

对于PL^pro活性抑制试验，基于先前描述的方法，用多肽底物Arg-Leu-Arg-Gly-Gly↓-AMC(RLRGG↓-AMC，Bachem Bioscience)(SEQ ID NO:30)进行基于FRET的试验⁽¹⁹⁾。在室温下将SARS-CoV-2PL^pro(50nM)分别与不同浓度的CBS和CBS+3NAC在反应缓冲液(50mM HEPES、pH 7.4、10mM NaCl、0.1mg/ml BSA、5％甘油、0.5mM TCEP)中孵育90分钟，然后加入RLRGG↓-AMC(2μM)以启动反应。再孵育30分钟后，测量荧光(λ_ex＝335nm,λ_em＝460nm)以确定PL^pro的活性。相对PL^pro活性是样品在铋药物存在下的活性与对照的活性之间的比率，因此以百分比表示。试验以一式三份进行。

对于M^pro活性抑制试验，基于先前描述的方法，用多肽底物Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(SEQ ID NO:29)(Edans)-NH₂(GL Biochem)进行基于FRET的检测^(17,20)。在室温下将SARS-CoV-2M^pro(0.5μM)分别与不同浓度的CBS和CBS+3NAC在反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，20 1mM NaCl，0.1mg/ml BSA，5％甘油，0.5mM TCEP)中孵育30分钟，然后加入Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(SEQ ID NO:29)(20μM)以启动反应。再孵育30分钟后，测量荧光(λ_ex＝335nm,λ_em＝460nm)以确定M^pro活性。相对M^pro活性是样品在铋药物存在下的活性与对照的活性之间的比率，因此以百分比表示。试验以一式三份进行。

Bi³⁺与蛋白的反应动力学

Bi³⁺与PL^pro和M^pro的反应动力学是通过紫外-可见分光光度法进行的。简言之，首先在96孔透过紫外线的微孔板(

)中的反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，10mMNaCl，5％甘油，0.2mM TCEP)中制备蛋白(PL^pro：20μM和M^pro：30μM)，然后与30摩尔当量的CBS在室温下孵育。使用SpectraMax iD3多模式酶标仪在340nm、25℃下记录吸光度20小时，以监测动力学模式中的平衡状态。使用Prism 8.0(GraphPad Software Inc.)软件通过基于单相指数函数的非线性平方拟合分析动力学数据。

Michaelis-Menten动力学

对于使用pylorid的实验中的ATP酶试验，将SARS-CoV-2解旋酶(0.5nM)与pylorid(0、0.01、0.05、0.1和0.5μM)在总体积为50μL的ATP酶反应混合物中在25℃下分别孵育30分钟。向每个等份的反应混合物加入30μL的反应显影剂，然后加入ATP作为底物，使得最终浓度为0.2、0.5、1、2、4、6、8mM。在相同条件下，在不存在抑制剂的情况下进行对照实验。通过将数据拟合到双倒数Lineweaver-Burk图中，得到未被抑制的反应和被抑制的反应两者的V_最大、K_m和Ki的值。对于DNA解旋试验，将SARS-CoV-2解旋酶(10nM)与Pylorid(0、0.1、0.2和0.5μM)在25℃下在解旋酶反应混合物中孵育5分钟。将FL-Cy3:RL-BHQ寡核苷酸和RL寡核苷酸加入酶中，以使最终底物浓度为2.5、5、7.5、10、15和20nM。在相同条件下，在不存在抑制剂的情况下进行对照实验。通过将数据拟合到双倒数Lineweaver-Burk图中，得到未被抑制的反应和被抑制的反应两者的V_最大、K_m和Ki的值。

对于PL^pro试验，反应混合物是通过将SARS-CoV-2PL^pro(20nM)与CBS+3NAC(0、0.1、0.5、1和2mM)在总体积为100μL的反应缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，10mM NaCl，0.1mg/mlBSA，5％甘油，0.5mM TCEP)中在室温下孵育4小时制备的。在每个等份的反应混合物中，加入底物RLRGG↓-AMC以获得0.5、1、2、5、10、20μM的最终浓度。在相同条件下，在不存在抑制剂的情况下进行对照实验。

对于M^pro试验，反应混合物是通过将SARS-CoV-2PL^pro(0.5μM)与CBS+3NAC(0、2、10、20μM)在总体积为100μL的反应缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 7.4、10mM NaCl、0.1mg/ml BSA、5％甘油、0.5mM TCEP)中在室温下孵育4小时制备的。在每个等份的反应混合物中加入底物Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E，以获得10、25、50、75、100、150、200μM的最终浓度。在相同条件下，在不存在抑制剂的情况下进行对照实验。通过将数据拟合到双倒数Lineweaver-Burk图中，得到未被抑制的反应和被抑制的反应两者的V_最大、K_m和Ki的值。

锌补充试验

首先通过在锌(II)螯合缓冲液[20mM Tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl、0.5mMEDTA、2mM TCEP]中透析制备Apo-SARS-CoV-2解旋酶(10μM)。然后通过在4℃下用在甘油透析缓冲液[50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM NaCl、5mM TCEP、20％甘油]中的过量的硝酸铋(III)透析载脂蛋白(apo-protein)过夜，然后去除未结合的Bi(III)并通过ICP-MS验证结合的Bi(III)制备结合铋的SARS-CoV-2解旋酶。将得到的蛋白与浓度高达相对SARS-CoV-2为50摩尔当量的ZnSO₄混合，在室温下孵育2小时，然后如上所述进行ATP酶试验和DNA解旋试验。

紫外-可见光谱

紫外可见光谱滴定是使用1厘米的石英比色皿在25℃下以360nm/min的速率在Varian Cary 50分光光度计上进行的。将等份的2mM Bi³⁺(为Bi(NTA)₃)储备溶液逐步滴定到在滴定缓冲液[50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM NaCl、2mM TCEP]中的apo-SARS-CoV-2解旋酶(10μM)中；将等份的2mM Bi³⁺(为Bi(NTA)₃)储备溶液逐步滴定到在滴定缓冲液(20mMTris-HCl、pH 7.4，10mM NaCl，1mM TCEP)中的蛋白(apo-SARS-CoV-2PL^pro：10μM，apo-SARS-CoV-2：M^pro 20μM)中。在每次添加之间的适当时间间隔，在一些实验中为每次添加后10分钟，记录250-600nm范围的紫外-可见光谱。铋(III)与蛋白的结合是通过在约340nm处的吸收增加监测的。用Ryan-Weber非线性方程拟合紫外滴定曲线，并估算K_d。

锌置换分析

在4℃下将SARS-CoV-2解旋酶(3μM)与10μM ZnSO₄在透析缓冲液[20mM Tris-HCl、pH 7.4、150mM NaCl、5mM TCEP]中孵育过夜，通过在无锌透析缓冲液中透析除去未结合的Zn(II)离子，以确保Zn(II)被完全载入蛋白中。然后通过在4℃下透析过夜并轻轻振摇将得到的蛋白与不同浓度的Pylorid孵育。随后，将样品在透析缓冲液中透析以去除未结合的金属离子，然后在60℃下用浓HNO₃酸化2小时。将样品稀释到可检测的浓度范围，并以¹¹⁵In作为²⁰⁹Bi、⁶⁶Zn的内标进行ICP-MS分析(Agilent 7700x，Agilent Technologies，CA，美国)。蛋白浓度通过标准的二喹啉甲酸(BCA)试验(Thermal Fisher Scientific，美国)进行定量。

锌释放试验。

铋药物暴露后Zn²⁺从SARS-CoV-2PL^pro的释放是通过先前描述的方法用锌特异性荧光团FluoZinTM-3(Invitrogen/Life Technologies)进行的⁽²¹⁾。简言之，将SARS-CoV-2PL^pro(20μM)与0、2、5、20摩尔当量的Bi³⁺(为CBS)在室温下孵育180分钟，然后在室温下加入FluoZin-3(1μM)，总反应体积为100μL(50mM Tris-HCl，pH7.4)。检测荧光(λ_ex＝494nm,λ_em＝530nm)，并使用在相同条件下由Zn(SO₄)₂制备的标准曲线转换为Zn²⁺浓度。记录与FluoZinTM-3混合后相应浓度的CBS的信号，用于背景减除。试验以一式三份进行，将结果绘制为[Zn²⁺]/[PL^pro]相对[Bi³⁺]/[PL^pro]的图。

Ellman试验

根据先前描述的方法⁽²²⁾，用DTNB[5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]以分光光度法测定游离半胱氨酸的量。简言之，将SARS-CoV-2M^pro(15μM)与0、2、5、20摩尔当量的Bi³⁺(为CBS)在室温下在96孔微孔板中的50μL反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4，10mM NaCl)中孵育60分钟。将等体积的DTNB(2mM)加入反应混合物中，总反应体积为100μL。孵育90分钟后，检测表明5-硫代苯甲酸根阴离子的释放的412nm的吸收，并使用在相同的条件下用还原谷胱甘肽(GSH)制备的标准曲线转换成硫醇浓度。试验以一式三份进行，结果绘制成[游离半胱氨酸]/[M^pro]相对[Bi³⁺]/[M^pro]的图。

统计学分析

所有的统计学分析都是使用Prism 8.0(GraphPad Software Inc.)软件对三次独立的实验进行的，如果另有说明则在更多的实验中进行。

结果

所选金属化合物在体外表现出针对SARS-CoV-2的强效活性

金属化合物在历史上被用作抗微生物剂；然而，它们的抗病毒活性还没有被广泛地探索。在该研究中，选择了六种金属化合物，包括两种基于柠檬酸铋的药物，即胶体次柠檬酸铋(CBS，De-Nol)和雷尼替丁柠檬酸铋(Pylorid，Jindele)、两种铋(III)卟啉，即Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)和Bi(TPyP)(TPyP：四(4-吡啶基)卟啉)、一种基于Au(I)的药物醋硫葡金(Ridaura)以及其细胞活性形式氯(三乙基膦)金(I)(Au(PEt₃)Cl)用于在体外针对SARS-CoV-2的初步筛选。这些化合物在猴肾VeroE6细胞中的50％细胞毒性浓度(CC₅₀)被测定为：De-Nol为3254±21μM，Pylorid为2243±43μM，Bi(TPP)和Bi(TPyP)两者均为>400μM，Ridaura为14.2±1.3μM，Au(PEt₃)Cl为13.5±1.8μM(表1)。

数据表1|所选化合物的细胞毒性和抗病毒活性。所选化合物的CC₅₀和EC₅₀的总结

^&N.D：未测定。

#表示研究中使用的最大可溶浓度。

^*药物浓度的测量基于金属含量。

接下来，由于与基于Au(I)的药物相比，四种铋(III)化合物的细胞毒性低，这充满希望，因此优先将它们用于进一步评估它们在人结肠直肠Caco2细胞中的CC₅₀值，结果分别得到范围从400到3740μM的类似CC₅₀值(表1)。为了评估它们的抗病毒效力，在低微摩尔水平上测定了铋(III)化合物的半数最大有效剂量(EC₅₀)，De-Nol为4.6±0.4μM，Pylorid为2.3±0.5μM，Bi(TPP)为3.9±1.2μM，Bi(TPyP)为7.5±0.9μM。值得注意地，在感染后(hpi)1小时加入所有四种铋(III)化合物以剂量依赖的方式减少了VeroE6细胞和Caco2细胞两者中的病毒RNA载量(图1A-Q)。在无毒浓度下，De-Nol和Pylorid比Bi(TPP)和Bi(TPyP)表现出更强效的抗SARS-CoV-2活性，这通过VeroE6细胞裂解液中最大约2log相对1log的病毒载量减少(图1A-1D)；Caco2细胞裂解液中约3log相对约2log的减少(图1E-1H)；VeroE6细胞培养上清液中约4log相对约3log的减少(图1I-1L)；以及Caco2细胞培养上清液中约4log相对约3log的减少(图1M-1P)得到证明。铋(III)药物/化合物极大地抑制了SARS-CoV-2，如通过与DMSO处理组相比药物处理的细胞中病毒核蛋白的显著减少的表达所证明的(数据未显示，图2A)。总之，数据证明，铋(III)药物/化合物在体外有力地抑制SARS-CoV-2的复制。

为了研究SARS-CoV-2复制周期的哪些步骤被选定的药物化合物中断，通过在不同的时间点用每种化合物处理病毒感染的细胞，然后在感染后9小时测量病毒滴度，当在细胞培养上清液中可检测到第一轮子代病毒时，进行了时间加药进程试验(图2B和2C)。耐人寻味地，在细胞预处理或病毒共感染期间加入Bi(TPyP)显著抑制病毒复制，而在病毒进入后维持Bi(TPyP)时，则没有发现可检测的效果，表明Bi(TPyP)可能干扰SARS-CoV-2附着至细胞表面。在预孵育阶段过程中加入时，Pylorid不影响病毒复制，而在病毒吸附和进入后阶段过程中加入时，Pylorid降低病毒载量约2log，表明Pylorid是在病毒进入/内化或病毒进入后的早期事件过程中起作用的多靶点药物。为了验证这点，RBC和Bi(TPyP)对病毒进入的中断由假型病毒感染试验证实，显示通过RBC和Bi(TPyP)分别降低了病毒进入百分比约45％和53％(图2D)。显然，De-Nol和Bi(TPP)两者都在进入后阶段发挥作用。总之，用基于铋(III)的药物处理后的SARS-CoV-2脆弱性得以证明。

使用Pylorid的治疗性处理缓解SARS-CoV-2疾病

鉴于Pylorid针对SARS-CoV-2的选择性指数特别高(975)以及Pylorid的两种组分之一的雷尼替丁单独对病毒抑制的独有作用(图2E)，优先将Pylorid用于体内抗病毒评估。Pylorid是用于治疗幽门螺杆菌感染和胃溃疡的临床上使用药物，其在人使用方面的安全性情况是有充分记载的¹⁷。先前的药代动力学研究揭示，通过胃内给药，Pylorid具有相对快速的吸收(t_最大(铋)约0.5小时，t_最大(雷尼替丁)约2.5小时)和小的肾脏清除率(CL_r(铋)约40mL/min)，药代动力学行为在剂量范围内呈线性¹⁸。最近的研究建立了体内模型以模拟金黄叙利亚仓鼠中COVID-19的临床和病理表现，金黄叙利亚仓鼠是一种用来研究疾病发病机制、传播性和抗病毒评估的优良工具¹⁹。在一项初步研究中，腹膜内注射150mg/kg/天的Pylorid没有表现出对动物的显著毒性。包括瑞德西韦作为阳性对照药物，并且基于其在SARS-CoV感染小鼠中的有效剂量以25mg/kg/天用药²⁰。在该研究中，用10⁴PFU SARS-CoV-2鼻内攻击仓鼠，然后从感染后6小时开始每天连续四次用药。可预期地，DMSO治疗的对照仓鼠从感染后(d.p.i.)2天开始出现嗜睡、翘毛、驼背姿势和呼吸急促的临床体征，而用RBC或瑞德西韦治疗的仓鼠没有出现任何临床体征。在攻击后4天，进行研究以检查药物是否通过减少上呼吸道(鼻甲)和下呼吸道(肺)中的病毒载量而赋予针对SARS-CoV-2攻击的保护。明显地，Pylorid降低了鼻甲(p<0.05)和肺组织(p<0.01)两者中的病毒RNA载量，分别为约1log和1.5log(图3A)。一致地，瑞德西韦组和Pylorid组两者都证实了对呼吸道中的活SARS-CoV-2颗粒的抑制(图3B)。

促炎症细胞因子和趋化因子的分泌增加与受折磨的COVID-19患者的严重程度有关²¹。为了确定Pylorid的治疗效果是否缓解了病毒诱导的细胞因子风暴，测定了白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平，它们是严重的COVID-19病例的预后标志物，也是有代表性的促炎症细胞因子和趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、C-C基序趋化因子配体22(CCL22)和C-C趋化因子受体4型(CCR4)²²。耐人寻味地，在接受Pylorid治疗的仓鼠组中，IFN-γ(p<0.05)、IL-10(p<0.001)和CCR4(p<0.05)的mRNA表达明显减少，而与溶媒(DMSO)组相比，瑞德西韦组的这些mRNA表达普遍较低，但统计学上不显著(IL-6除外)(图3c)。

为了提供对疾病的明确监测，在感染后4天对苏木精和伊红(H&E)染色的肺组织进行了组织学检查，在RBC治疗后观察到肺部损伤的显著改善(数据未显示)。在DMSO对照组中，发现动物肺部有大面积的实变和大量的肺泡腔单核细胞浸润和渗出，以及中度严重程度的细支气管上皮细胞死亡。另外，在肺血管中观察到内皮细胞和血管壁单核细胞浸润。瑞德西韦治疗组的肺组织表现出改善的形态但有轻度的细支气管壁浸润和血管壁浸润(图3E)。然而，在RBC治疗后，仅检测到轻微的肺泡壁增厚和轻微的细支气管周围浸润，没有可见的血管炎症变化(数据未显示)。免疫荧光染色表明在用瑞德西韦和RBC治疗后肺泡组织中的N蛋白表达减少，主要在仓鼠肺部的局灶性细支气管上皮细胞中表达(数据未显示，图3F)。总之，数据因此通过在体内中断SARS-CoV-2的复制周期和病毒相关的肺炎证明RBC的有效性。Pylorid是SARS-CoV-2解旋酶的强效不可逆抑制剂。

先前的研究说明，铋(III)药物通过“猎枪”机制发挥作用，即通过与关键蛋白，特别是与含锌蛋白的结合靶向多个生物途径^23,24。鉴于锌经常作为锌指或锌结合域被包含到冠状病毒的几个重要的非结构性蛋白，例如PLpro半胱氨酸蛋白酶²⁵、RNA依赖性RNA聚合酶⁹和解旋酶²⁶中，假设是铋(III)可能在功能上使这些酶失去活性，因此禁止SARS-CoV-2病毒复制。作为原理证明，SARS-CoV-2解旋酶被选为可行的靶点之一，以研究铋(III)化合物是否能使该酶失活。

解旋酶是马达蛋白，其作用为在ssNA易位和dsNA分离过程中将NTP转换为NDP和无机磷酸盐(Pi)并沿着5′到3′的极性解旋具有5′-ss尾部的dsRNA和dsDNA两者^27,28。为了探索Pylorid对SARS-CoV-2解旋酶的潜在作用，首先对包含N端锌结合结构域(ZBD)和C端解旋酶结构域(HEL)的全长蛋白进行过表达和纯化(图3D)。研究首先通过典型的磷酸盐释放试验²⁹考察了铋(III)化合物是否抑制SARS-CoV-2解旋酶的ATP酶活性，其中由于ATP水解而释放的磷酸盐呈现为在添加或不添加铋(III)化合物情况下ATP酶活性的相对百分比。如图4A-4D所示，随着铋(III)浓度的增加，ATP酶活性显著下降，最终活性被抑制，超过90％。De-Nol、Pylorid、BiTPP和Bi(TPyP)的半数最大抑制浓度(IC₅₀)值经计算分别为1.88±0.12、0.69±0.12、2.39±0.02和4.68±1.39μM(表2)，表明Pylorid和相关铋(III)化合物对SARS-CoV-2解旋酶的ATP酶活性的有效抑制。

表2|所选化合物对SARS-CoV-2解旋酶的抑制效力。所选化合物对SARS-CoV-2解旋酶的ATP酶和DNA解旋活性的IC₅₀总结

^*药物的测量基于金属含量

接下来的另外的研究通过已建立的基于荧光共振能量转移(FRET)的试验研究了四种铋化合物对SARS-CoV-2解旋酶的双链解旋活性的影响¹⁶。DNA双链体底物是通过使在3'端有Cy3荧光团和在5'端有BHQ-2淬灭剂的低聚物退火而制备的。在荧光滴定之前，蛋白和DNA双链体在不同浓度的铋化合物存在下平衡。在不存在铋(III)化合物的情况下，由于Cy3链经由解旋酶从DNA-双链体上解旋，DNA-双链体的信号强度急剧增加。相比之下，在铋(III)化合物浓度增加的情况下，荧光的增加就不太明显了，表明以剂量依赖的方式对双链解旋的抑制(图4E-4H)。类似地，化合物针对该酶的双链解旋活性的IC₅₀值被测量为：De-Nol为1.24±0.02μM，Pylorid为0.74±0.13μM，Bi(TPP)为3.69±0.26μM，Bi(TPyP)为2.64±0.16μM(表2)。值得注意地，这样的抑制是不可逆的，因为向与铋结合的SARS-CoV-2解旋酶补充多达50摩尔当量的锌(II)仅导致约6％的ATP酶活性和约13％的双链解旋活性得到恢复，表明锌(II)与铋(III)竞争SARS-CoV-2解旋酶的能力有限(图4I-4J)。从酶动力学角度来看，增加Pylorid的浓度几乎没有改变约42.05±2.78mM/s的最大速度(V_最大)值，而表观Michaelis-Menten常数(K_m)从5.51增加到12.74mM，表明对SARS-CoV-2解旋酶的ATP酶活性的竞争抑制(图4K-4L)。Pylorid针对解旋酶ATP酶活性的抑制常数(K_i)估算为0.97±0.11μM。类似地，Pylorid表现出对解旋酶双链解旋活性的竞争性抑制模式，约20.53±1.56nM/min的V_最大值不变，K_m值从42.21nM增加到91.77nM，K_i值估算为0.39±0.07μM。综合数据表明，Pylorid用作SARS-CoV-2解旋酶的强效不可逆抑制剂。

Pylorid与SARS-CoV-2解旋酶结合并从ZBD中释放锌离子

结构分析揭示，SARS冠状病毒解旋酶包含三种典型的锌指，包括锌指1(Cys5、Cys8、Cys26、Cys29)、锌指2(Cys16、Cys19、His33、His39)和锌指3(Cys50、Cys55、Cys72、His75)³⁰。鉴于铋(III)的高亲硫性，随后的研究因此通过紫外-可见光谱法研究铋(III)是否与锌指位点中的锌(II)竞争。为了排除Pylorid中雷尼替丁的干扰，制备了无色的铋化合物Bi(NTA)，然后将其滴定至SARS-CoV-2解旋酶的载脂蛋白形式。将铋(III)加到apo-SARS-CoV-2解旋酶中导致在约340nm处的吸收带的出现和增加，这是Bi-S配体向金属电荷转移(LMCT)条带的特征。如图5A所示，340nm处的吸收强度增加，然后在[Bi(III)]/[SARS-CoV-2解旋酶]的摩尔比为3时达到平稳，具有如通过用Ryan-Weber非线性方程拟合数据所确定的1.38±0.05μM的解离常数(K_d)。结果表明，每个SARS-CoV-2解旋酶有三个铋(III)离子结合，锌指位点的半胱氨酸残基参与结合。

接下来，通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)询问铋(III)与SARS-CoV-2解旋酶的结合是否导致锌(II)的释放的问题。利用平衡透析，研究表明约3.46摩尔当量的锌(II)与SARS-CoV-2解旋酶结合。Pylorid与SARS-CoV-2解旋酶的滴定导致Zn(II)离子的化学计量下降，伴随铋(III)与SARS-CoV-2解旋酶的化学计量上升，最终约2.90摩尔当量的Zn(II)被替代，而约2.73摩尔当量的铋(III)与该酶结合(图5B)。数据证实Pylorid对SARS-CoV-2解旋酶的抑制归因于SARS-CoV-2解旋酶中的Zn(II)被Bi(III)离子替代。

讨论

金属化合物在历史上已经被用作抗微生物剂；然而，它们对于抗病毒治疗的效用却很少被探索。本研究确认，Pylorid，一种耐受性好且有效的抗幽门螺杆菌感染和抗溃疡药物³¹，被确定为在体外和体内都有强效的抗SARS-CoV-2活性。它在已建立的仓鼠模型中对COVID-19的效力与瑞德西韦相当或甚至优于瑞德西韦，瑞德西韦已被美国批准紧急用于COVID-19治疗，尽管其长期副作用仍未确定。Pylorid的充分表征的安全性可以有利于其立即用于COVID-19患者的临床试验。一般认为胃肠道是SARS-CoV-2³²的潜在传播途径和靶器官，而Pylorid在消化道的环境下保持其已知良好的药理活性。对Pylorid在结肠(colinic)(Caco2)细胞上的检查表明其抑制SARS-CoV-2复制的强效活性(图1A-1P)，这可以支持使用Pylorid来限制病毒诱导的胃肠道表现和COVID-19的潜在粪口传播。

越来越多的证据，包括最近在一项随机试验中的发现表明靶向SARS-CoV-2病毒生命周期中的多个步骤的联合治疗的优势。由倍泰龙、洛匹那韦/利托那韦和利巴韦林组成的三联疗法比使用洛匹那韦/利托那韦的单药疗法实现显著更快的病毒清除和临床改善³³。COVID-19感染的多系统表现是由病毒诱导的细胞损伤和具有炎症活动失调的免疫病变的组合引起的。失调的细胞因子风暴与受损的循环系统联合导致了影响肺、心脏、肾脏、神经、肌肉、胃肠道和大脑的暴发性多器官功能障碍³⁴。该研究已证明Pylorid对SARS-CoV-2的多靶点抑制的可能性(图2C)。该研究表明，RBC以SARS-CoV-2复制周期的进入和进入后步骤两者为靶点(图2C和2D)。选择解旋酶作为说明性实例以证明RBC与病毒酶的体外相互作用，即通过释放活性锌(ii)不可逆地破坏酶的功能并可能在SARS-CoV-2感染的细胞中形成无功能的金属药物结合的酶(图4A-4L和5A-5B)。利用Vero E6细胞进行EC₅₀测量；这些细胞不表达TMPRSS2，它是SARS-CoV-244的一个主要进入决定因素。显然，RBC已经在Calu-3细胞(TMPRSS2+)中实现了比在Vero E6细胞(TMPRSS2-)中的抑制效率更高的抑制效率，表明RBC干扰TMPRSS2引发的病毒进入(P<0.01，图2F)。鉴于病毒酶中的诸如锌指的关键基序高度保守，Pylorid可用作针对冠状病毒的广谱抑制剂¹⁶。Pylorid的高选择性指数和被认可的安全性突出该药物在进一步临床验证后被迅速采用用于治疗COVID-19疾病的潜力。

用于广谱抗冠状病毒治疗的铋药物与含硫醇药物的联合口服给药

RBC和其他相关(多种)铋药物，例如胶体次柠檬酸铋(CBS)和水杨酸铋(BSS)是口服给予的抗溃疡药物，其在胃液(pH 1-3)中沉淀，以在溃疡凹坑上形成保护覆盖层，防止胃液分泌的侵蚀⁽⁸⁾。这可能导致全身吸收和肺部浓度的降低，肺部是冠状病毒(CoV)感染的主要部位。进行了另外的研究以在酸性条件下稳定铋药物，使得铋的吸收及其抗SAR-CoV-2的功效得以保持或增强。研究试图评估含硫醇的小分子是否可防止铋药物在酸性条件下的水解并改善铋药物的全身吸收和因此改善疗效。

选择了三种含硫醇药物(N-乙酰基半胱氨酸(NAC))、CPL和PCM)，以证明含硫醇化合物对铋药物的疗效的影响。最初的研究验证了NAC是否能在模拟胃液(pH 1.2)、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)和碳酸氢钠缓冲液(pH 9.2)中稳定铋(III)药物，即CBS。CBS与不同摩尔当量(mol eq.)的NAC的组合使用在以下表示为CBS+nNAC。如图6A所示，CBS在pH1.2时立即沉淀，1小时后在上清液中发现小于10％的铋。相比之下，NAC以剂量依赖的方式阻止CBS的沉淀，在3或10摩尔当量的NAC存在下，上清液中保留约100％的铋。另外，即使在pH 9.2下，NAC也类似地防止CBS的水解。而且，在低pH下，NAC稳定其他铋药物，包括RBC、水杨酸铋(BSS)和次没食子酸铋(BSG)，并且一系列其他含硫醇药物，包括谷胱甘肽(GSH)、青霉胺(PCM)、卡托普利(CPL)和硫代水杨酸(TSA)也能防止CBS在酸性条件下的水解(数据未显示)。

在十二烷(1％重量/体积)中在鸡蛋卵磷脂存在的情况下，使用改进的平行人工膜渗透性试验(PAMPA)估算通过模拟胃肠屏障的铋渗透性。在PBS(等pH 1.2)中达到平衡状态后，在10摩尔当量的NAC存在下，CBS、RBC和BSS的累积渗透的铋分别从16.95、15.24和18.80ng/cm²增加到24.91、19.77和24.13ng/cm²(图6B)。这表明CBS以及相关铋药物的化学稳定性和渗透性可通过联合使用含硫醇药物进行潜在地调节。

进一步的研究表征了人肠道上皮癌细胞系(Caco-2)⁽¹⁷⁾和改进的离体外翻肠囊模型(在生理pH 7.4下)⁽¹⁸⁾在存在或不存在NAC的情况下经由胃肠道段的铋吸收。从Caco-2的渗透性试验(图6C)来看，在10摩尔当量的NAC存在下，铋的肠道渗透在60分钟内适度升高，并且铋的细胞累积从0.33％增加到0.40％(图6D)。在10摩尔当量的NAC存在下，CBS的人肠道上皮细胞渗透性(Papp)从1.66×10^-7cm/s显著增加到2.17×10^-7cm/s(图6E)。在外翻囊模型中，由NAC改善的铋的肠道吸收进一步说明，当CBS分别与1、3和10摩尔当量的NAC联合使用时，在60分钟内累积渗透的铋从14.68ng/cm²显著提高到30.21、64.98和98.61ng/cm²(图6F)。总之，数据说明，通过与NAC共同给药，铋药物的口服吸收可以得到潜在的改善。

为了研究铋药物作为口服抗病毒剂的潜力，评估了在不存在和存在NAC的情况下CBS的药代动力学性质。不连同或连同不同量的NAC一起给予Balb/c小鼠CBS，发现当150mg/kg CBS分别与3摩尔当量(180mg/kg)和10摩尔当量(610mg/kg)NAC共同口服给药时，暴露0.5小时后，血铋浓度从225.75显著增加到372.04和447.29μg/L，暴露1小时后从87.27显著增加到332.76和1459.58μg/L(图6G)。绘制了在单次口服给予CBS(150mg/kg)及其与10摩尔当量的NAC(610mg/kg)的组合后大鼠的平均血铋浓度相对时间的曲线。如图6H所示，CBS组和CBS+10NAC组都显示出双峰曲线。对于CBS组，血铋水平从约0.5小时时的第一个峰值277.69μg/L下降，正如先前的人类研究⁽²⁰⁾中可见的，在4小时达到447.06μg/L的C_最大，0-12小时的曲线下面积(AUC0→12h)值为1316h·μg/L。值得注意的是，NAC的作用是使铋的血药浓度峰值增加到655.78μg/L，并出现延长的T_最大(表4)，导致AUC0→12h显著升高到2750h·μg/L。

表4 CBS和CBS+10NAC口服给药后的药代动力学参数(n＝5)。

^*本研究中使用的药物剂量：CBS(150mg/kg)，NAC(610mg/kg)。

^#铋含量的测量基于金属含量。

另外，如24小时时铋在不同器官的生物分布图所揭示的，NAC显著改善了在肺(CBS：552.15纳克/组织相对CBS+10NAC：1056.62纳克/组织)和肾(CBS：6839.76纳克/组织相对CBS+10NAC：18788.60纳克/组织)中的铋累积，适度促进了在其他器官，即脾和肝中的铋吸收，对大脑中的铋吸收的影响微乎其微(图6I)。综上所述，体外数据和体内药代动力学数据两者一致表明，CBS与NAC的共同给药导致在血液和不同器官中的铋吸收情况都明显改善，这显著改善了铋药物用于对抗SARS-CoV-2感染的口服可用性。

为了避免超量NAC对抗病毒评价的潜在影响⁽²²⁾，铋药物(CBS和BSS)与3摩尔当量的含硫醇药物(NAC、CPL和PCM)共同给予，用于以下基于细胞和基于动物的研究。CBS+3NAC处理使Vero E6细胞培养上清液中的SARS-CoV-2产量减少高达>3-log10(图7A)，而在相同的条件下，单独的NAC在甚至高达2000μM下表现出可忽略的抗SARS-CoV-2活性(图7L)。根据噬斑减少试验，CBS+3NAC的EC₅₀估计为5.8μM，与CBS的EC₅₀(EC₅₀＝4.6μM)相当⁽¹⁾，表明CBS与NAC的联合使用并没有损害CBS的抗病毒效力。明显地，针对SARS-CoV-2(B.1.1.7)^(4,23)和MERS-CoV感染的Vero E6细胞培养上清液，CBS+3NAC处理分别将病毒产量明显降低了约2log10和约4log10，而在hCoV-229E感染的人胚胎肺成纤维细胞(HELF)的细胞培养上清液中的病毒产量则降低了高达>1.5log10。结果表明，CBS+3NAC可提供针对流行性和季节性冠状病毒的广谱抗病毒选择。

CBS+3NAC针对SARS-CoV-2的酶抑制活性显示在表5中。

表5.CBS+3NAC针对SARS-CoV-2的酶抑制活性

^*铋含量的测量基于金属含量。

^#N.D.：未测定

铋药物(CBS和CBS)与含硫醇化合物(NAC、CPL或PCM)的组合以剂量依赖方式抑制了Vero E6细胞中的SARS-CoV-2(图11)。细胞培养上清液中的病毒载量是通过使用反转录的qPCR(RT-qPCR)定量的。

使用免疫荧光染色，通过与未处理组(64.5％)、CBS处理组(37.25％)或NAC处理组(59.75％)的病毒NP抗原相比，CBS+3NAC处理组中的明显降低的病毒NP抗原(11.75％)，进一步描述了CBS+3NAC的优异的抗病毒效果(数据未显示，图7E)。CBS+3NAC的作用方式是通过在单一病毒复制周期中的时间加药进程试验来探索的。使用CBS+3NAC处理有力地阻止了SARS-CoV-2的感染，如通过当CBS+3NAC在共同孵育和进入后阶段过程中加入时分别为3.54-log10和1.73-log10的病毒载量下降所表明的；同时观察到CBS+3NAC几乎不干扰病毒的附着(即孵育前，图7F)。考虑到NAC单独对病毒复制的影响微不足道，表明CBS+3NAC干扰包括SARS-CoV-2内化和/或进入后事件的多个步骤。

鉴于CBS和NAC的组合在体外的良好口服药代动力学特性和预期的抗病毒效力，随后的研究在充分确立的金色叙利亚仓鼠模型中评估了它的体内疗效⁽²⁴⁾。初步研究表明，当连续3天给予小鼠CBS+3NAC时，肺部中的铋含量可很好的累积(图7M)。为了达到最佳的抗病毒性能，在感染模型中给予多剂量的铋药物。在SARS-CoV-2鼻内攻击前的第-2天、第-1天和第6小时、感染后第0天和第1天，分别向仓鼠组口服给予等份的CBS+3NAC水溶液、CBS水溶液、NAC水溶液和水(作为溶媒对照)(图7G)。然后在感染后(dpi)2天测定各组的肺部病毒载量，此时病毒载量逐步增加，具有显著的组织病理学变化。与溶媒组相比，CBS+3NAC组的肺部SARS-CoV-2RNA拷贝数减少了15.87倍，它们之间具有显著差异(P<0.0001，Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验)(图7H)。溶媒组、CBS组和NAC组之间没有观察到统计学上的显著差异。另外，确定肺部IL-6基因的表达以反映病毒感染后潜在的呼吸衰竭和不良临床结果。如图7I所示，与溶媒组的IL-6水平相比，CBS+3NAC治疗导致IL-6水平显著下降14.4倍，而CBS治疗也使得IL-6水平下降，但在统计上没有显著变化。免疫荧光染色试验证实了CBS+3NAC的体内抗SARS-CoV-2效力，如通过用CBS+3NAC治疗后仓鼠肺部的肺泡组织中SARS-CoV-2-NP的表达减少7.49倍所证明的(数据未显示，图7J)。

一致地，在实验期结束时，溶媒组的感染仓鼠出现了嗜睡、翘毛、驼背姿势和呼吸急促的体征，而这些不良的临床体征和症状在CBS+3NAC治疗组得到了显著改善，在CBS治疗组得到了轻微缓解。通过对仓鼠肺部组织进行苏木精和伊红(H&E)染色的组织学检查，进一步检查了肺部损伤的严重程度。接受溶媒的感染仓鼠在血管内皮以及细支气管周区域出现了大面积实变、细胞浸润(数据未显示)。相比之下，这些严重的病理变化在CBS+3NAC治疗的仓鼠中得到了极大的预防(数据未显示)，如通过估算的肺部组织学得分分别从8.67分减少到5.33分和2.66分所揭示的(图7K)，表明CBS+3NAC的口服治疗缓和了进展为严重疾病的风险并加速了恢复。NAC也部分缓解了肺部病变，可能是由于其疏通慢性支气管肺部疾病的厚粘液的能力^(15,25)。重要的是，由于NAC的抗氧化活性，它可以扩大CBS+3NAC在病毒期或炎症期的治疗时间窗口⁽¹⁵⁾。

另外，在相同的治疗条件下，向未感染的Balb/c小鼠给予基于体表面积的转换剂量的CBS+3NAC，发现血尿素氮(BUN)和肌酐水平仅有轻微升高但可逆的变化，而没有观察到其他发病体征(图9A-9C)。总之，研究表明，与含硫醇药物，即NAC共同给药，铋药物，即CBS可以有希望地被转化为可口服使用的抗病毒剂，并因此有力地减少体内SARS-CoV-2的病毒RNA和致病性。

先前的研究表明，铋药物可以可行地靶向微生物中蛋白的Zn2+-半胱氨酸复合物，诸如SARS-CoV-2/SARS-CoV解旋酶(Hel，Nsp13)的结构性锌指结构域^(1,26)、NDM-1的催化锌活性位点⁽²⁷⁾和锌结合伴侣蛋白GroES^(28,29)以及半胱氨酸蛋白酶，诸如半胱天冬酶3和半胱天冬酶9⁽³⁰⁾。CBS+3NAC与CBS对SARS-CoV-2Hel双链解旋活性的抑制作用相当，由CBS的IC₅₀为1.24μM，CBS+3NAC的IC₅₀为1.88μM证实；CBS+3NAC与CBS对ATP酶活性的抑制作用相当，由CBS的IC₅₀为1.88μM，CBS+3NAC的IC₅₀为2.3μM证实(图8A和8B)。随后的研究调查了CBS+3NAC对SARS-CoV-2基因组编码的两种独特的保守半胱氨酸蛋白酶—在指状子域中拥有保守结构性Zn2+的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PL^pro，Nsp3内的结构域)和糜蛋白酶样主要蛋白酶(Mpro，Nsp5)的潜在抑制作用，这两种蛋白酶都必须负责两个大的复制酶多聚蛋白(ORF1a和1ab)的蛋白水解切割，用于病毒基因组的复制⁽³¹⁾以及其他一些生物活动。通过使用基于荧光共振能量转移(FRET)的切割试验，分别用RLRGG↓-AMC和Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2的肽底物评估SARS-CoV-2PL^pro和SARS-CoV-2M^pro的活性。如图8C、8D和图10A-B所示，CBS+3NAC和CBS以剂量依赖性方式抑制SARS-CoV-2PL^pro，IC₅₀分别为1.00μM和1.02μM，抑制SARS-CoV-2M^pro，IC₅₀分别为21.10μM和22.25μM，而NAC在相当的浓度下表现出可忽略的抑制作用(表6)，表明抑制作用源于铋离子。增加CBS+3NAC的浓度揭示最大速度(V_最大)值不变，为12.48±0.53nM/s，而观察到表观Michaelis-Menten常数(Km)从176.4增加到320.0nM，表明CBS+3NAC对SARS-CoV-2Mpro活性的典型竞争性抑制，抑制常数(Ki)为6.20±0.40μM；而CBS+3NAC对SARS-CoV-2PL^pro表现出混合抑制，可能是由于Bi3+与其(多个)变构位点以及与其活性位点半胱氨酸的结合(图8E和8F)。

表6.CBS+3NAC的细胞毒性和抗病毒活性

^*铋含量的测量基于金属含量。

监测到Bi³⁺与SARS-CoV-2PL^pro和SARS-CoV-2M^pro的半胱氨酸残基的结合，如通过将20摩尔当量的Bi³⁺滴定到各种蛋白时在约340纳米处出现的特征性Bi-S配体向金属的电荷转移(LMCT)条带所证明的(图8G和8H)，其中t1/2(PL^pro)为62.07分钟且t1/2(M^pro)为3.38分钟。随着Bi³⁺的逐渐增加，在340纳米处的吸收增加，然后在[Bi3+]/[SARS-CoV-2PL^pro]的摩尔比为约3和[Bi3+]/[SARS-CoV-2M^pro]的摩尔比为约1时趋于平稳，估算的解离常数(Kd)分别为1.13μM和0.60μM(图3I、8I和3J、8J)。Bi³⁺的结合导致约0.78当量的Zn²⁺从SARS-CoV-2PL^pro中释放，这部分有助于其活性的抑制。另外，通过Ellman试验，发现SARS-CoV-2M^pro中的游离半胱氨酸的量在与Bi3+结合后减少了约1当量。与先前的数据相吻合(图7F)，这些结果意味着铋药物，即CBS+3NAC，通过结合关键的半胱氨酸蛋白酶，即PL^pro、M^pro和Hel和在功能上使它们失活，阻断了进入后阶段期间的多个生物事件，最终导致禁止冠状病毒的复制。

总之，这些研究说明包括金属药物CBS和含硫醇药物，诸如NAC的联合疗法可以通过靶向多种关键的病毒酶而用作口服给药的广谱抗冠状病毒方案。

参考文献

1 Zhou,et al.Nature 579,270-273,doi:10.1038/s41586-020-2012-7(2020).

2 Stadler,et al.SARS-Nat Rev Microbiol 1,209-218(2003).

3 Wrapp,.et al.Science 367,1260-1263,doi:10.1126/science.abb2507(2020).

4 Lan,et al.Nature,doi:10.1038/s41586-020-2180-5(2020).

5 Shang,et al.SNature,doi:10.1038/s41586-020-2179-y(2020).

6 Sheahan,et al.Sci Transl Med,doi:10.1126/scitranslmed.abb5883(2020).

7 Zhang,et al.Science,doi:10.1126/science.abb3405(2020).

8 Jin,et al.Nature,doi:10.1038/s41586-020-2223-y(2020).

9 Gao,et al.Science,doi:10.1126/science.abb7498(2020).

10 Sanders,et al JAMA,doi:10.1001/jama.2020.6019(2020).

11 Serafin,et al.Int J Antimicrob Agents,105969,doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.105969(2020).

12 Munster,et al.bioRxiv,2020.2003.2021.001628,doi:10.1101/2020.03.21.001628(2020).

13 https://www.nih.gov/news-events/news-releases/nih-clinical-trial-shows-remde sivir-accelerates-recovery-advanced-covid-19

14 Wang,et al.Lancet 395,1569-1578,doi:10.1016/S0140-6736(20)31022-9(2020).

15 Chan,et al.Lancet 395,514-523,doi:10.1016/S0140-6736(20)30154-9(2020).

16 Yang,et al.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.46,6464-6468,doi:10.1002/anie.200701021(2007).

17 Pipkin,et al.Pharmacoepidemiol.Drug Saf.5,399-407,doi:10.1002/(sici)1099-1557(199611)5:6<399::Aid-pds243>3.0.Co；2-4(1996).

18 KOCH,et al.Br.J.Clin.Pharmacol.42,201-205,doi:10.1046/j.1365-2125.1996.03929.x(1996).

19 Chan,et al.Clin.Infect.Dis.,doi:10.1093/cid/ciaa325(2020).

20 Wang,et al.Cell Res 30,269-271,doi:10.1038/s41422-020-0282-0(2020).21 Tay,et al Nat.Rev.Immunol.,doi:10.1038/s41577-020-0311-8(2020).

22 Huang,et al.Lancet 395,497-506,doi:10.1016/S0140-6736(20)30183-5(2020).

23 Wang,et al.Nat Commun 9,439,doi:10.1038/s41467-018-02828-6(2018).

24 Cun,et al P Natl Acad Sci USA 107,4943-4948,doi:10.1073/pnas.0913970107(2010).

25 Baez-Santos,et al Antivir Res 115,21-38,doi:10.1016/j.antiviral.2014.12.015(2015).

26 Jia,et al.Nucleic Acids Res 47,6538-6550,doi:10.1093/nar/gkz409(2019).27 Patel,et al.J.Biol.Chem.281,18265-18268,doi:10.1074/jbc.R600008200(2006).

28 Keum,et al Biochem Pharmacol 84,1351-1358,doi:10.1016/j.bcp.2012.08.012(2012).

29 Tanner,et al.J.Biol.Chem.278,39578-39582,doi:10.1074/jbc.C300328200(2003).

30 Jia,et al.Nucleic Acids Res.47,6538-6550,doi:10.1093/nar/gkz409(2019).

31 Bardhan,et al Gut 41,181-186,doi:10.1136/gut.41.2.181(1997).

32 Lin,L.et al.Gastrointestinal symptoms of 95 cases with SARS-CoV-2infection.Gut 69,997-1001,doi:10.1136/gutjnl-2020-321013(2020).

33 Hung,et al.Lancet,doi:10.1016/S0140-6736(20)31042-4(2020).

34 Roberts,M.et al.Covid-19:a complex multisystem clinicalsyndrome.at https://blogs.bmj.com/bmj/2020/05/01/covid-19-a-complex-multisystem-clinical-syndrome/(2020).

35 Li,et al Curr.Opin.Chem.Biol.16,74-83,(2012).

36 Wang,et al.B iScience 23,101054,doi:https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.101054(2020).

37 Chu,et al.Lancet Microbe 1,e14-e23,doi:https://doi.org/10.1016/S2666-5247(20)30004-5(2020).

38 Yuan,et al..Nat.Commun.10,120,doi:10.1038/s41467-018-08015-x(2019).

39 Yuan,et al.J.Antimicrob.Chemother.71,2489-2497,doi:10.1093/jac/dkw194(2016).

40 Chan,et al.T Antiviral Res.160,38-47,doi:https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.10.007(2018).

41 Yuan,et al.Antimicrob.Agents Chemother.59,4082-4093,doi:10.1128/aac.00306-15(2015).

42 Chan,et al.J.Clin.Microb.58,e00310-00320,doi:10.1128/jcm.00310-20(2020).

1.Yuan,et al.Nat.Microb.5,1439–1448((2020).

2.World Health Organization.Coronavirus Disease(COVID-19)SituationReports.https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports.,(2020).

3.Graham,Science 368,945-946(2020).

4.Emerging SARS-CoV-2 variants.Centers for Disease Control andPrevention.https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/more/science-and-research/scientific-brief-emerging-variants.html#_ftn1.(2021).

5.Zumla,et al.Nat.Rev.Drug Discov.15,327-347(2016).

6.Beigel,et al.N.Engl.J.Med.383,994(2020).

7.Goldman,et al.N.Engl.J.Med.383,1827-1837(2020).

8.Sun,Curr.Opin.Chem.Biol.16,74-83(2012).

9.D.C.Wolf,C.H.Wolf,D.T.Rubin,Temporal improvement of a COVID-19-positive Crohn's disease patient treated with bismuth subsalicylate.Am.J.Gastroenterol.115,1298(2020).

10.Wang,et al.Acc.Chem.Res.52,216-227(2019).

11.Sadler,et al.Chem.Eur.J.2,701-708(1996).

12.Prescott,et al.Br.Med.J.2,1097-1100(1979).

13.Prescott,et al.Lancet 2,432-434(1977).

14.Smilkstein,et al.N.Engl.J.Med.319,1557-1562(1988).

15.Omara,et al.Toxicology 116,219-226(1997).

16.Shi,et al.Ther.Clin.Risk Manag.16,1047-1055(2020).

17.Ye,et al.J.Med.Chem.63,7695-7720(2020).

18.Alam,et al.J.Pharm.Pharmacol.64,326-336(2011).

19.Leussink,et al.Arch.Toxicol.74,349-355(2000).

20.Hespe,et al..Lancet 332,1258(1988).

21.Riva,et al.Nature 586,113-119(2020).

22.Geiler,et al..Biochem.Pharmacol.79,413-420(2010).

23.Kemp,et al...bioRxiv,2020.2012.2014.422555(2020).

24.Chan,et al..Clin.Infect.Dis.71,2428-2446(2020).

25.Dekhuijzen,Eur.Respir.J.23,629-636(2004).

26.Yang,et al..Angew.Chem.Int.Ed.46,6464-6468(2007).

27.Wang,et al.Nat.Commun.9,439(2018).

28.S.Cun,H.Sun,Azinc-binding site by negative selection inducesmetallodrugsusceptibility in an essential chaperonin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,4943(2010).

29.Cun,et al..J.Biol.Chem.283,15142-15151(2008).

30.Wang,et al.iScience 23,101054(2020).

31.Lei,et al.Antivir.Res.149,58-74(2018).

Claims (23)

1.一种在有其需要的受试者中治疗受试者的SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括以治疗有效量给予所述受试者一种包含在药学上可接受的载体中的有效量的一种或多种含铋(III)化合物、其类似物或其药学上可接受的盐的组合物，以减少SARS-CoV-2感染的一种或多种症状。

2.权利要求1所述的方法，其中所述有效量的一种或多种含铋(III)化合物有效抑制所述受试者中的SARS-CoV-2的解旋酶蛋白。

3.权利要求1所述的方法，其中全身给予所述含铋(III)化合物或其药学上可接受的盐。

4.权利要求1所述的方法，其中口服给予或肠胃外给予所述含铋(III)化合物或其药学上可接受的盐。

5.权利要求1所述的方法，其中以减少病毒复制的有效量给予丙磺舒或其药学上可接受的盐。

6.权利要求1所述的方法，其中以有效量给予所述含铋(III)化合物或其药学上可接受的盐，以减少与所述冠状病毒相关的疾病、障碍或疾患的一种或多种症状。

7.权利要求6所述的方法，其中所述症状包括发热、鼻窦和/或肺充血、流鼻涕或鼻塞、咳嗽、打喷嚏、喉咙痛、身体疼痛、疲劳、气短、胸闷、呼气时喘息、寒战、肌肉疼痛、头痛、腹泻、疲倦、恶心、呕吐及其组合。

8.权利要求1所述的方法，其中所述受试者目前患有SARS-CoV-2感染。

9.权利要求8所述的方法，其中所述受试者患有COVID-19。

10.权利要求1所述的方法，其中所述受试者已暴露于所述SARS-CoV-2，但为无症状的。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含一种或多种选自以下的化合物：

雷尼替丁柠檬酸铋(RBC)：

Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)

和

Bi(TPyP)(TPyP：四(4-吡啶基)卟啉)

12.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含胶体次柠檬酸铋(CBS)。

13.权利要求11所述的方法，其中所述组合物包含雷尼替丁柠檬酸铋。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述组合物为用于口服给药的片剂形式。

15.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述组合物为适合注射的形式。

16.一种剂型，其包含有效量的一种或多种选自以下的化合物：

雷尼替丁柠檬酸铋(RBC)：

Bi(TPP)(TPP：四苯基卟啉盐)

和

Bi(TPyP)(TPyP：四(4-吡啶基)卟啉)

其在单独或与3或10摩尔当量组合给予后在受试者中抑制SARS-CoV-2解旋酶蛋白。

17.权利要求16所述的剂型，其中所述剂型为片剂或胶囊。

18.权利要求16所述的剂型，其中所述剂型为注射剂。

19.权利要求16-18中任一项所述的剂型，其还包含一种或多种含硫醇的小分子化合物。

20.权利要求1-15中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者给予一种或多种含硫醇的小分子化合物，或者其中所述组合物包含一种或多种含硫醇的小分子化合物，其中所述小分子化合物优选为N-乙酰基-半胱氨酸、谷胱甘肽、青霉胺(PCM)、卡托普利(CPL)和硫代水杨酸(TSA)。

21.权利要求20所述的方法，其中，所述小分子化合物为在低pH，例如pH 1.2下稳定所述铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的有效量。

22.权利要求21所述的方法，其中同时给予或依次给予所述一种或多种含硫醇的小分子。

23.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述含硫醇的小分子以所述铋(III)化合物或其药学上可接受的盐的3或10摩尔当量使用。

Images