CN108014102A - 埃博拉假病毒的小分子抑制剂 - Google Patents

埃博拉假病毒的小分子抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN108014102A
CN108014102A CN201610958957.6A CN201610958957A CN108014102A CN 108014102 A CN108014102 A CN 108014102A CN 201610958957 A CN201610958957 A CN 201610958957A CN 108014102 A CN108014102 A CN 108014102A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudovirus
cell
ebola
dppa
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610958957.6A
Other languages
English (en)
Inventor
邹罡
蓝柯
王卓
王一卓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Original Assignee
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur of Shanghai of CAS filed Critical Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority to CN201610958957.6A priority Critical patent/CN108014102A/zh
Publication of CN108014102A publication Critical patent/CN108014102A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了埃博拉假病毒的小分子抑制剂，具体地本发明提供了一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂，所述抑制剂选自：dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。实验结果表明，所述抑制剂能够有效的抑制埃博拉病毒进入细胞。

Description

埃博拉假病毒的小分子抑制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及埃博拉假病毒的小分子抑制剂。
背景技术
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的烈性传染病，于1976年在非洲中部扎伊尔和苏丹首次暴发流行。埃博拉病毒属于丝状病毒科(Filoviridae)丝状病毒属(Filovirus)，其形态包括杆状、丝状、及“L”形，毒粒长度平均l000nm，直径70～90nm，目前已鉴定出的埃博拉病毒包括5个种，扎伊尔型(Zaire ebolavirus)、苏丹型(Sudan ebolavirus)、莱斯顿型(Reston ebolavirus)、塔伊森林型(Tai Forest ebolavirus)和本迪布焦型(Bundibugyo ebolavirus)，其中扎伊尔型埃博拉病毒引起的疾病最严重。除莱斯顿亚型病毒对人类不致病，其余4亚型病毒都对人有致死性，埃博拉病毒病能够导致高达90％的致死率，自2014年西非爆发埃博拉病毒病以来，全世界范围内已经发现28616例病例，其中死亡病例11310例(http://apps.who.int/ebola/en/ebola-situation-reports)。
埃博拉病毒病的初期症状为发热、寒颤、精神萎靡和肌肉疼痛，随着病程发展会出现系统性、胃肠道、呼吸系统、血管和神经系统症状，如：虚脱，厌食、恶心、腹痛、腹泻，胸痛、气短、咳嗽，结膜充血、水肿，头痛、意识模糊等。部分患者会出现出血症状，包括：出血点、瘀斑、粘膜出血、内脏出血等。埃博拉病毒基因组是不分节段的负链RNA，长度约为19kb，含7个开放阅读框，在病毒基因组中的基因排列顺序为:3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’，每种产物均由各自单独的mRNA所编码。埃博拉病毒病目前仍然是非常严峻的全球性公共卫生问题，但迄今为止尚无批准上市的疫苗和药物，研发抗病毒药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂及其应用。
本发明的第一方面，提供了选自下组的化合物：dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素，或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于抑制病毒。
在另一优选例中，所述病毒为埃博拉病毒；和/或水疱性口炎病毒。
在另一优选例中，所述药学上可接受的盐为柠檬酸盐。
在另一优选例中，所述试剂或药物用于抑制埃博拉病毒。
在另一优选例中，所述试剂或药物还用于抑制水疱性口炎病毒感染细胞。
在另一优选例中，所述试剂或药物还用于抑制埃博拉病毒进入细胞。
本发明的第二方面，提供了一种病毒抑制剂，所述抑制剂中包含选自下组的一种或多种组分：
dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。
在另一优选例中，所述病毒为埃博拉病毒和/或水疱性口炎病毒。
在另一优选例中，所述病毒抑制剂为埃博拉病毒抑制剂。
在另一优选例中，所述病毒为埃博拉病毒，所述抑制剂包括dPPA。
在另一优选例中，所述埃博拉病毒抑制剂还包括选自下组的一种或多种化合物：卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。
本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗目的的抑制埃博拉病毒进入细胞的方法，所述方法包括步骤：
向所述细胞的培养液中添加选自下组的一种或多种组分：
dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。
在另一优选例中，所述细胞为Vero细胞。
在另一优选例中，所述方法中添加的各组分的浓度为约0.1μM～150μM。
在另一优选例中，向所述细胞的培养液中添加dPPA；优选地添加浓度为0.1μM－30μM，更优选地添加浓度为0.5μM－10μM。
在另一优选例中，所述向所述细胞的培养液中添加卡马拉素；优选地添加浓度为0.5μM－30μM，更优选地添加浓度为1μM－10μM。
在另一优选例中，所述向所述细胞的培养液中添加高良姜黄素；优选地添加浓度为10μM－30μM，更优选地添加浓度为15μM－20μM。
在另一优选例中，所述向所述细胞的培养液中添加表没食子儿茶素；优选地添加浓度为5μM－30μM，更优选地添加浓度为10μM－20μM。
在另一优选例中，所述向所述细胞的培养液中添加白皮杉醇；优选地添加浓度为15μM－40μM，更优选地添加浓度为20μM－30μM。
在另一优选例中，所述向所述细胞的培养液中添加白杨素；优选地添加浓度为5μM－30μM，更优选地添加浓度为10μM－20μM。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了dPPA抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的dPPA，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试dPPA对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的dPPA，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试dPPA对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的dPPA，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试dPPA对水疱性口炎假病毒的抑制效果。
图2显示了不同时间点加药实验证明dPPA能够阻止埃博拉假病毒进入细胞。将浓度为10μM的dPPA和含有0.25％DMSO的培养基按照吸附前、感染中和吸附后三种不同处理方式加入假病毒和细胞中，培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，以评估dPPA在病毒进入细胞不同阶段中的作用。
图3显示了卡马拉素抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的卡马拉素，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试卡马拉素对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的卡马拉素，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试卡马拉素对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的卡马拉素，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试卡马拉素对水疱性口炎假病毒的抑制效果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂，所述抑制剂选自：dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。实验结果表明，所述抑制剂能够有效的抑制埃博拉病毒进入细胞。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
活性成分
本发明提供了一种埃博拉病毒的小分子抑制剂，其衍生物及其类似物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
在本发明的一个优选地实施方式中，作为活性成分的根据本发明的小分子抑制剂具有选自下组的结构：
A.dPPA；B.卡马拉素(Rottlerin)；C.高良姜黄素(Galangin)；D.表没食子儿茶素(Epigallocatechin)；E.白皮杉醇(Piceatannol)；F.白杨素(Chrysin)。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
药物组合物和施用方法
由于本发明人发现本发明所涉及的化合物(如dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、白杨素)具有优异的抑制埃博拉病毒进入细胞的作用，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由埃博拉病毒感染所导致的疾病。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有约1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有约10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为约1～2000mg，优选约20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示了dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、白杨素对埃博拉病毒感染的抑制作用；
(2)首次揭示了dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、白杨素能够抑制病毒进入细胞。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料和方法
细胞、病毒和化合物
Vero(非洲绿猴肾)细胞(购自ATCC)在含有1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin,P/S)和10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基中。扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒(假病毒制备可参考文献Tsai C,Caillet C,Hu H,Zhou F,Ding H,Zhang G,Zhou B,Wang S,Lu S,Buchy P,Deubel V,Vogel FR,ZhouP.Measurement of neutralizing antibody responses against H5N1clades inimmunized mice and ferrets using pseudotypes expressing influenzahemagglutinin and neuraminidase.Vaccine.2009.27(48):6777-90.)用于高通量药物的筛选及评估。从EnzoLife Sciences,Inc.购买了天然化合物库。化合物dPPA(12-Deoxyphorbol 13-phenylacetate 20-acetate，DOPPA)购自Sigma-Aldrich，并溶解于含有0.25％DMSO、2％肽牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中进行抗病毒实验。
高通量筛选药物库
向96孔白板(Corning Costar)的每孔中加入50μl含有10000个Vero细胞的DMEM，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，每孔分别加入5μl终浓度为10μM的被测化合物(化合物中的DMSO终浓度为0.25％)，对照组中加入5μl 0.25％的DMSO。然后加入45μl的扎伊尔型埃博拉假病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养72小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μl Bright-Glo(Promega)试剂，在室温下震荡混匀后，使用VeritasMicroplate Luminometer(Turner BioSystem)酶标仪进行检测。将相对感染率小于50％的化合物进行在水疱性口炎假病毒和细胞上的第二轮筛选，相对感染率大于85％且不表现出细胞毒性的化合物将进行验证实验。
化合物的验证实验和细胞毒性实验
本发明涉及的6中化合物中，表没食子儿茶素溶于培养基中，其他5种化合物溶解于DMSO中备用。为了测试化合物对假病毒的抑制效果，进行了剂量依赖实验，方法类似于以上所述的高通量筛选药物库实验。在细胞中加入稀释到不同浓度的各化合物和假病毒，对照组中，分别使用5μl培养基或DMSO代替化合物。细胞毒性实验中，在细胞中加入5μL稀释到不同浓度的化合物，并使用含有2％FBS和1％P/S的DMEM培养基代替假病毒。
数据分析
把原始数据输入到Excel表格中计算信背比(S/B)，信噪比(S/N)，Z因子以及假病毒相对感染率和细胞存活率。计算公式如下：S/B＝μv/μc，μv表示病毒对照组信号的平均值，μc表示细胞对照组信号的平均值，S/N＝(μv–μc)/(σv–σc),σv表示病毒对照组信号的标准差，σc表示细胞对照组信号的标准差，Z＝1-((3σc+3σv)/|μv–μc|),Z因子在0.5与1之间表示实验方法能够有效的区分对照组之间的差异。化合物处理后假病毒的相对感染率＝(μcpd–μc)/(μv–μc)×100％，μcpd表示待测化合物的平均信号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率＝μcpd/μc×100％。半数最大效应浓度(EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度(CC50)是指引起50％细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组荧光强度降低50％。EC50和CC50是用Prism软件计算的，每个化合物的选择性指数(SI)＝CC50/EC50。
实施例1dPPA对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制作用
dPPA能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒，其EC50为0.13μM。且在最高测试浓度下(25μM)不表现出细胞毒性。dPPA不能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，仅在最高测试浓度下表现出轻微的抑制作用。
图1.dPPA抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的dPPA，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试dPPA对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的dPPA，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试dPPA对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的dPPA，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试dPPA对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明dPPA不能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，但能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒感染，且不产生细胞毒性作用。
dPPA阻止埃博拉假病毒进入细胞。当扎伊尔型埃博拉假病毒吸附在细胞膜之前或在假病毒感染细胞过程中，以及在假病毒吸附细胞后，dPPA均能对病毒产生抑制作用。
图2.不同时间点加药实验证明dPPA能够阻止埃博拉假病毒进入细胞。将浓度为10μM的dPPA和含有0.25％DMSO的培养基按照吸附前、感染中和吸附后三种不同处理方式加入假病毒和细胞中，培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，以评估dPPA在病毒进入细胞不同阶段中的作用。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果表明dPPA能够在扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞的全过程中发挥作用。
实施例2卡马拉素(Rottlerin)对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制作用
卡马拉素(Rottlerin)抑制扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞，EC50为0.96μM，同时也能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，其EC50为1.62μM。在低于1.85μM的浓度下不表现出细胞毒性。
图3.卡马拉素抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的卡马拉素，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试卡马拉素对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的卡马拉素，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试卡马拉素对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的卡马拉素，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试卡马拉素对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明卡马拉素对水疱性口炎假病毒和扎伊尔型埃博拉假病毒感染细胞均有一定的抑制作用，在低于1.85μM的浓度下不表现出细胞毒性。
实施例3高良姜黄素(Galangin)对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制作用
高良姜黄素(Galangin)抑制扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞，EC50为10.05μM，同时也能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，其EC50为10.07μM。在最高测试浓度下(25μM)不表现出细胞毒性。
图4.高良姜黄素抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的高良姜黄素，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试高良姜黄素对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的高良姜黄素，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试高良姜黄素对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的高良姜黄素，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试高良姜黄素对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明高良姜黄素对水疱性口炎假病毒和扎伊尔型埃博拉假病毒感染细胞均有一定的抑制作用，且在最高被试浓度下不表现出细胞毒性。
实施例4表没食子儿茶素(Epigallocatechin)对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制作用
表没食子儿茶素(Epigallocatechin)抑制扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞，EC50为8.3μM，同时也能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，其EC50为11.47μM。在最高测试浓度下(25μM)不表现出细胞毒性。
图5.表没食子儿茶素抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的表没食子儿茶素，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试表没食子儿茶素对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的表没食子儿茶素，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试表没食子儿茶素对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的表没食子儿茶素，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试表没食子儿茶素对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明表没食子儿茶素对水疱性口炎假病毒和扎伊尔型埃博拉假病毒感染细胞均有一定的抑制作用，且在最高被试浓度下不表现出细胞毒性。
实施例5白皮杉醇(Piceatannol)对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制作用
白皮杉醇(Piceatannol)抑制扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞，EC50为23.33μM，同时也能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，其EC50为31.42μM。在浓度低于50μM时不表现出细胞毒性。
图6.白皮杉醇抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的白皮杉醇，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试白皮杉醇对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的白皮杉醇，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试白皮杉醇对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的白皮杉醇，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试白皮杉醇对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明白皮杉醇对水疱性口炎假病毒和扎伊尔型埃博拉假病毒感染细胞均有一定的抑制作用，且在浓度低于50μM时不表现出细胞毒性。
实施例6白杨素(Chrysin)对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制作用
白杨素(Chrysin)抑制扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞，EC50为9.18μM，同时也能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，其EC50为14.54μM。且在最高被试浓度下不表现出细胞毒性。
图7.白杨素抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。A.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的白皮杉醇，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试白皮杉醇对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。B.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的白皮杉醇，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试白皮杉醇对细胞的毒性。C.Vero细胞中加入2倍倍比稀释的白皮杉醇，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试白皮杉醇对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明白皮杉醇对水疱性口炎假病毒和扎伊尔型埃博拉假病毒感染细胞均有一定的抑制作用，且在最高被试浓度下不表现出细胞毒性。
讨论:
本发明人通过利用扎伊尔型埃博拉假病毒对天然化合物库进行了高通量筛选，最终鉴定出一种扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制剂—dPPA。dPPA(12-Deoxyphorbol 13-phenylacetate 20-acetate DOPPA)，可以选择性地激活PKCβ，模仿由IFN介导的信号通路，但其具有比IFN更显著的活性。PKCβ参与调节细胞凋亡和B细胞激活，dPPA在激活该信号通路中具有重要作用。
本发明人发现dPPA能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒，因此本发明提供了一种能抑制埃博拉假病毒进入细胞的小分子天然化合物—dPPA。
通过细胞存活实验，本发明人发现dPPA在任何被测浓度下对细胞均没有毒性作用。仅在最高浓度下(25μM)，dPPA能够轻微抑制水疱性口炎假病毒感染细胞。不同时间点加药实验证明，dPPA在埃博拉假病毒进入细胞的整个过程中均能够发挥作用，即能够抑制病毒吸附细胞表面以及内化、膜融合过程。
在对天然化合物库筛选过程中，本发明人还发现其他5种对埃博拉假病毒进入细胞具有抑制作用的化合物，分别为卡马拉素(Rottlerin)、高良姜黄素(Galangin)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin)、白皮杉醇(Piceatannol)和白杨素(Chrysin)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.选自下组的化合物：dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素，或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于抑制病毒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒为埃博拉病毒；和/或水疱性口炎病毒。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂或药物用于抑制埃博拉病毒。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂或药物还用于抑制水疱性口炎病毒感染细胞。
5.一种病毒抑制剂，其特征在于，所述抑制剂中包含选自下组的一种或多种组分：
dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。
6.如权利要求5所述的病毒抑制剂，其特征在于，所述病毒为埃博拉病毒和/或水疱性口炎病毒。
7.如权利要求5所述的病毒抑制剂，其特征在于，所述病毒抑制剂为埃博拉病毒抑制剂。
8.如权利要求7所述的病毒抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括dPPA；优选地，所述埃博拉病毒抑制剂还包括选自下组的一种或多种化合物：卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。
9.一种体外非治疗目的的抑制埃博拉病毒进入细胞的方法，所述方法包括步骤：
向所述细胞的培养液中添加选自下组的一种或多种组分：
dPPA、卡马拉素、高良姜黄素、表没食子儿茶素、白皮杉醇、和白杨素。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，向所述细胞的培养液中添加dPPA；优选地添加浓度为约0.1μM－30μM，更优选地添加浓度为约0.5μM－10μM。
CN201610958957.6A 2016-11-03 2016-11-03 埃博拉假病毒的小分子抑制剂 Pending CN108014102A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610958957.6A CN108014102A (zh) 2016-11-03 2016-11-03 埃博拉假病毒的小分子抑制剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610958957.6A CN108014102A (zh) 2016-11-03 2016-11-03 埃博拉假病毒的小分子抑制剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108014102A true CN108014102A (zh) 2018-05-11

Family

ID=62083984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610958957.6A Pending CN108014102A (zh) 2016-11-03 2016-11-03 埃博拉假病毒的小分子抑制剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108014102A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109966284A (zh) * 2019-04-22 2019-07-05 上海长征医院 粗糠柴苦素在制备抗真菌药物增敏剂中的用途
CN112014557A (zh) * 2019-05-28 2020-12-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107019703A (zh) * 2016-02-02 2017-08-08 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 LSECtin在作为治疗和/或预防埃博拉病毒的靶点中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107019703A (zh) * 2016-02-02 2017-08-08 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 LSECtin在作为治疗和/或预防埃博拉病毒的靶点中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHE C. COLPITTS等: "A Small Molecule Inhibits Virion Attachment to Heparan Sulfate- or Sialic Acid-Containing Glycans", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
NIRUPAMA MULHERKAR等: "The Ebola virus glycoprotein mediates entry via a non-classical dynamin-dependent macropinocytic pathway", 《VIROLOGY》 *
ROBERTO BUCCIONE等: "Regulation of Constitutive Exocytic Transport by Membrane Receptors", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
STEPHEN HSU: "Compounds Derived from Epigallocatechin-3-Gallate (EGCG) as a Novel Approach to the Prevention of Viral Infections", 《INFLAMMATION & ALLERGY - DRUG TARGETS》 *
TAICHI SUGAWARA等: "PKCδ and ε regulate the morphological integrity of the ER–Golgi intermediate compartment (ERGIC) but not the anterograde and retrograde transports via the Golgi apparatus", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
曹瑞源等: "抗埃博拉病毒小分子抑制剂的研究进展", 《国际药学研究杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109966284A (zh) * 2019-04-22 2019-07-05 上海长征医院 粗糠柴苦素在制备抗真菌药物增敏剂中的用途
CN109966284B (zh) * 2019-04-22 2021-08-13 上海长征医院 粗糠柴苦素在制备抗真菌药物增敏剂中的用途
CN112014557A (zh) * 2019-05-28 2020-12-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点
WO2020237909A1 (zh) * 2019-05-28 2020-12-03 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可用于埃博拉病毒病治疗的靶点

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102265798B1 (ko) 코로나 바이러스에 연관된 감염의 치료를 위한 항바이러스 조성물
JP7019727B2 (ja) インフルエンザの治療方法
Hu et al. Antiviral efficacy of nanoparticulate vacuolar ATPase inhibitors against influenza virus infection
WO2018081449A1 (en) Methods for treating respiratory syncytial virus infection
RU2505306C2 (ru) Композиция для профилактики и лечения вирусных инфекций
CN108014102A (zh) 埃博拉假病毒的小分子抑制剂
CN106265614B (zh) 一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂
CA2465062C (en) Preventive and/or therapeutic agent for viral infection
WO2016110173A1 (zh) 一种流感病毒神经氨酸酶的新型抑制剂及其用途
WO2021215938A1 (en) Anti-viral methods and compositions
US20210299077A1 (en) Liposomal reduced glutathione (lrg) in combination with ivermectin for the treatment of covid-19
EP3960173A1 (en) Enterovirus inhibitor
CN108853075A (zh) 埃博拉病毒的小分子抑制剂
RU2397764C2 (ru) Новое применение для альфа-симпатомиметиков, имеющих 2-имидазолиновую структуру
CN107648249B (zh) 去半乳糖替告皂甙在制备防治流感病毒感染的药物中的应用
AU2017210921B2 (en) Composition and combined medication method for treating enterovirus infection
WO2022123513A1 (en) Composition and method for managing coronavirus infection
Valdés-Torres et al. Honokiol and alfa-Mangostin inhibit Mayaro virus replication by stimulating the type I interferon pathway
WO2022232337A2 (en) Composition and method for treating covid-19
JP2011523660A (ja) 新規ジアリールヘパトノイド系化合物及びその用途
TW201219048A (en) A novel standardized composition, method of manufacture and use in the resolution of RNA virus infection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180511