CN106265614B

CN106265614B - 一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂

Info

Publication number: CN106265614B
Application number: CN201510282426.5A
Authority: CN
Inventors: 邹罡; 艾德铭; 王一卓
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2035-05-28
Also published as: CN106265614A

Abstract

本发明提供了一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂，具体地，本发明公开了奥昔拉定、肽可霉素等小分子化合物能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。通过细胞存活实验发现这些化合物对细胞没有毒性作用。

Description

一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂。

背景技术

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的烈性传染病，于1976年在非洲中部扎伊尔和苏丹首次暴发流行。埃博拉病毒属于丝状病毒科(Filoviridae)丝状病毒属 (Filovirus)，其形态包括杆状、丝状、及“L”形，毒粒长度平均l000nm，直径 70～90nm，目前已鉴定出的埃博拉病毒包括5个种，扎伊尔型(Zaire ebolavirus)、苏丹型(Sudan ebolavirus)、莱斯顿型(Reston ebolavirus)、塔伊森林型(Tai Forest ebolavirus)和本迪布焦型(Bundibugyo ebolavirus)，其中扎伊尔型埃博拉病毒引起的疾病最严重。除莱斯顿亚型病毒对人类不致病，其余4亚型病毒都对人有致死性，埃博拉病毒病能够导致高达90％的致死率，自2014 年西非爆发埃博拉病毒病以来，全世界范围内已经发现25500例病例，其中死亡病例10587例(http://apps.who.int/ebola/en/ebola-situation-reports)。埃博拉病毒病的初期症状为发热、寒颤、精神萎靡和肌肉疼痛，随着病程发展会出现系统性、胃肠道、呼吸系统、血管和神经系统症状，如：虚脱，厌食、恶心、恶心、腹痛、腹泻，胸痛、气短、咳嗽，结膜充血、水肿，头痛、意识模糊等。部分患者会出现出血症状，包括：出血点、瘀斑、粘膜出血、内脏出血等。埃博拉病毒基因组是不分节段的负链RNA，长度约为19kb，含7个开放阅读框，在病毒基因组中的基因排列顺序为:3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’，每种产物均由各自单独的mRNA所编码。埃博拉病毒病目前仍然是非常严峻的全球性公共卫生问题，但迄今为止尚无批准上市的疫苗和药物，研发抗病毒药物迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种埃博拉假病毒的小分子抑制剂及其应用。

本发明公开了抑制埃博拉假病毒的小分子化合物—肽可霉素(Teicoplanin) 和奥昔拉定柠檬酸盐(Oxeladin citrate)，它们作用于病毒进入细胞阶段。

本发明的第一方面，提供了奥昔拉定或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于抑制埃博拉病毒吸附细胞。

在另一优选例中，所述试剂或药物中还具有肽可霉素、或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述药学上可接受的盐为柠檬酸盐。

在另一优选例中，所述试剂或药物还用于抑制水疱性口炎病毒感染细胞。

在另一优选例中，所述试剂或药物还用于抑制埃博拉病毒进入细胞。

本发明的第二方面，提供了一种组合物，所述组合物中含有组分A，所述组分A为奥昔拉定或其药学上可接受的盐；和

组分B，所述组分B为肽可霉素、或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述组合物用于抑制埃博拉病毒吸附细胞，和/或用于抑制埃博拉病毒感染。

在另一优选例中，所述组分A和组分B的重量比为1～3：5～1。

在另一优选例中，所述组合物中还包含选自下组的一种或多种组分：

Tamoxifen(他莫昔芬)、Clemastine(氯马斯丁)、Toremiphene(托瑞米芬)、Paroxetine(帕罗西汀)、Amiodarone(胺碘酮)、Clomiphene(克罗米酚)、Securinine(一叶萩碱)、Glafenine(格拉非宁)、Pimethixene maleate salt(匹美噻吨马来酸盐)、Artemisinin(青蒿素)、Indoprofen (吲哚洛芬)、Iodoquinol(双碘喹啉)、和Levonordefrin(左旋异肾上腺素)。

本发明的第三方面，提供了一种埃博拉病毒抑制剂，所述抑制剂中包含选自下组的一种或多种组分：

Teicoplanin(肽可霉素)、Tamoxifen(他莫昔芬)、Clemastine(氯马斯丁)、Toremiphene(托瑞米芬)、Paroxetine(帕罗西汀)、Amiodarone(胺碘酮)、Clomiphene(克罗米酚)、Securinine(一叶萩碱)、Glafenine(格拉非宁)、Oxeladin citrate(奥昔拉定柠檬酸盐)、Pimethixene maleate salt (匹美噻吨马来酸盐)、Artemisinin(青蒿素)、Indoprofen(吲哚洛芬)、 Iodoquinol(双碘喹啉)、和Levonordefrin(左旋异肾上腺素)。

本发明的第四方面，提供了肽可霉素、或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于抑制埃博拉病毒吸附细胞。

在另一优选例中，其中所述试剂或药物还用于抑制埃博拉病毒感染细胞。

在另一优选例中，其中所述试剂或药物还用于预防或治疗埃博拉病毒感染。

在另一优选例中，其中所述埃博拉病毒为扎伊尔型埃博拉假病毒。

在另一优选例中，其中所述肽可霉素不抑制埃博拉病毒的复制。

本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗目的的抑制埃博拉病毒吸附细胞的方法，所述方法包括步骤：

向所述细胞的培养液中添加选自下组的一种或多种组分：

在另一优选例中，所述方法中添加的各组分的浓度为10μM～150μM。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了肽可霉素能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒对细胞的感染；其中图1A显示了肽可霉素对扎伊尔型埃博拉假病毒的感染具有显著的抑制效果；图1B显示了在极高剂量下肽可霉素对细胞也不存在细胞毒性；图1C显示了肽可霉素不能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞。

图2显示了万古霉素不能抑制扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒；其中，图2A显示了万古霉素对扎伊尔型埃博拉假病毒感染的不具有抑制效果；图2B显示了万古霉素对水疱性口炎假病毒感染不具有抑制效果；图2C 显示了万古霉素的细胞毒性。

图3显示了肽可霉素对肠道病毒71型不具有抑制作用。图3A显示了肽可霉素对EV71病毒不具有抑制作用，图3B显示了肽可霉素对RD细胞不具有毒性。

图4显示了肽可霉素能抑制扎伊尔型埃博拉假病毒进入细胞过程中的吸附阶段，但在病毒吸附在细胞上以后再加入化合物没有效果。

图5显示了肽可霉素不能抑制扎伊尔型埃博拉病毒复制。

图6显示了奥昔拉定柠檬酸盐抑制扎伊尔型埃博拉假病毒的活性。图6A 显示了奥昔拉定柠檬酸盐对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。图6B显示了奥昔拉定柠檬酸盐对细胞的毒性。图6C显示了奥昔拉定柠檬酸盐对水疱性口炎假病毒的抑制效果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，鉴定出一类扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制剂(奥昔拉定柠檬酸盐、肽可霉素等)。在此基础上完成了本发明。

而且，本发明人在研究过程中，对万古霉素族糖肽类抗生素的抗病毒活性进行了研究，发现万古霉素不能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒，但是却意外地发现属于万古霉素族糖肽类抗生素的肽可霉素能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。通过细胞存活实验发现肽可霉素对细胞没有毒性作用，对肠道病毒71型(EV-A71)不具有抑制作用。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

活性成分

如本文所用，术语“奥昔拉定”包括奥昔拉定、其衍生物及其类似物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

在本发明的一个优选地实施方式中，奥昔拉定柠檬酸盐的结构式如下：

如本文所用，术语“肽可霉素”包括肽可霉素、其糖苷配基衍生物及其类似物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

肽可霉素首次发现于1978年，为游动放线菌产生,是一种可以用于治疗革兰氏阳性菌感染的糖肽类抗生素,有文献报道肽可内素也能够预防和治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌感染。

在本发明的一个优选地实施方式中，肽可霉素的结构式如下：

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

药物组合物和施用方法

由于本发明人发现本发明所涉及的化合物“奥昔拉定及其衍生物”和“肽可霉素及其衍生物”具有优异的抑制埃博拉病毒进入细胞的作用，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由埃博拉病毒感染所导致的疾病。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g) 润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示了奥昔拉定和/或肽可霉素对埃博拉病毒感染的抑制作用；

(2)首次揭示了奥昔拉定和/或肽可霉素能够抑制病毒进入宿主细胞。

(3)首次揭示了肽可霉素通过抑制埃博拉病毒吸附细胞而不是抑制病毒的复制来抑制埃博拉病毒的感染，病毒进入细胞是病毒感染的第一步，如果化合物抑制病毒进入细胞那么病毒无法完成感染周期。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

细胞、病毒和化合物

RD(人横纹肌瘤)细胞(购自美国菌种保藏中心,ATCC)，Vero(非洲绿猴肾) (购自ATCC)细胞在含有1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin,P/S)和 10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养基中；BSR T7/5(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞的克隆株，可以购自中国科学院上海生命科学研究院)细胞在含有2％MEM Amino AcidSolution，1％L-Glutamine(200 mM)和10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的GMEM培养基中，每隔一代加入G418选择素，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒用于高通量药物的筛选及评估。EV71FY573株(GenBank登录号HM064456)用于评估肽可霉素对肠道病毒71型的抗病毒作用。EV71 G082株用于病毒空斑减少实验。呼吸道合胞病毒(RSV，ATCC VR-26)用于评估肽可霉素对RSV的抗病毒作用研究。我们从MicroSource Discovery Systems Inc (Gaylordsville，美国)购买了美国药物库(1040个化合物)和国际药物库(240 个化合物)。化合物肽可霉素和万古霉素购自Selleck，并溶解于含有2％肽牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中，奥昔拉定柠檬酸盐购自Sigma并溶于DMSO中进行抗病毒实验。

高通量筛选药物库

向96孔白板(Corning Costar)的每孔中加入50μl含有10000个Vero 细胞的DMEM，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h后，每孔分别加入5μl 终浓度为10μM的被测化合物(化合物中的DMSO终浓度为0.25％)，对照组中加入5μl 0.25％的DMSO。然后加入45μl的扎伊尔型埃博拉假病毒稀释液，每孔的终体积为100μl，培养72小时后，取出，于室温下平衡30分钟。而后每孔加入50μl Bright-Glo(Promega)试剂，在室温下震荡混匀后，使用 VeritasMicroplate Luminometer(Turner BioSystem)酶标仪进行检测。将相对感染率小于50％的化合物进行在水疱性口炎假病毒和细胞上的第二轮筛选，相对感染率大于85％且不表现出细胞毒性的化合物将进行验证实验。

表1中为通过高通量筛选FDA批准的化合物库鉴定出的15种扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制剂。

本发明提供了选自表1中化合物的用途，用于制备抑制埃博拉病毒的试剂或药物。

表1

^*:pEBOV代表埃博拉假病毒，pVSV代表VSV假病毒，SI(selectivity index)代表选择系数，pVSV/pEBOV＝ pVSV EC₅₀/pEBOV EC₅₀，N.D表示未检测。

化合物的验证实验和细胞毒性实验

从Selleck购买肽可霉素和万古霉素，溶于培养基中，终浓度为50mM，从Sigma购买的奥昔拉定柠檬酸盐溶于DMSO中，终浓度为40mM。为了测试化合物对假病毒的抑制效果，本发明人进行了剂量依赖实验，方法类似于以上所述的高通量筛选药物库实验。在细胞中加入稀释到不同浓度的肽可霉素、万古霉素或奥昔拉定柠檬酸盐和假病毒，对照组中，分别使用5μl培养基或DMSO 代替化合物。细胞毒性实验中，使用含有2％FBS和1％P/S的DMEM培养基代替假病毒。

病毒效价减少实验

在12孔板(Corning Costar)中接种Vero细胞，3×10⁵个/孔，37℃培养过夜，24小时后加入MOI＝0.1的EV71病毒液和3倍倍比稀释的肽可霉素，在37℃培养42h或48h后，收集上清液，冻存，然后测定病毒滴度。

肠道病毒71型效价的测定

测EV71的效价，向12孔板的每孔中加入1ml含3×10⁵个Vero细胞的DMEM，培养24h。病毒进行10倍倍比稀释，即将25μl病毒液与225μl的含2％FBS 和1％P/S的DMEM混匀。吸出12孔板中的培养基，每孔加入200μl病毒液。放置在37℃，5％CO₂的培养箱中感染1h，每隔15分钟轻轻摇动。然后吸出病毒液，加入1ml含0.8％甲基纤维素(AquacideⅡ，Calbiochem)和2％FBS的 DMEM，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养6天，置于3.7％的福尔马林中固定1h 后，用1％的结晶紫染色。

评估肽可霉素在病毒进入细胞不同阶段中作用的实验

向96孔板中加入10000个Vero细胞，培养24小时。吸附前实验中，将扎伊尔型埃博拉假病毒和浓度分别为10μM，100μM的肽可霉素以及含有2％ FBS和1％P/S的DMEM孵育1小时，取50μl假病毒感染细胞1小时后移去假病毒液，利用培养基将为结合的假病毒洗掉，加入100μl培养基。感染中实验组，移去细胞中的培养基，向细胞中加入50μl假病毒和浓度分别为10μ M，100μM的肽可霉素的混合液，含有2％FBS和1％P/S的DMEM作为对照，培养1小时后移除假病毒液及化合物，利用培养基洗掉未结合的假病毒，加入100 μl培养基。吸附后实验中，移去细胞中的培养基，加入50μl假病毒液，与 4度孵育1小时，洗去为结合的病毒后加入浓度分别为10μM，100μM的肽可霉素和含有2％FBS和1％P/S的DMEM，与4度孵育1小时，利用培养基洗掉药物，加入100μl培养基。细胞于37度培养三天后，利用Bright-Glo试剂盒检测荧光。

测试化合物对扎伊尔型埃博拉病毒复制的抑制效果

用萤火虫荧光素酶基因替换EBOV基因组构建出扎伊尔型埃博拉病毒 minigenome(小基因组)。在NP，L，VP30和VP35四个辅助质粒cDNA中的ORF 前分别插入Kozak序列。向24孔板的每孔中加入0.5ml含2×10⁵个BSR细胞的GMEM，培养24h。吸去上清，利用脂质体(Lipofectamine 2000)将扎伊尔型埃博拉病毒minigenome和辅助质粒共同转染进入BSR细胞中，并分别加入浓度为10μM，30μM，100μM的肽可霉素，和含有2％FBS和1％P/S的 DMEM作为对照，缺少L质粒的一组为背景。转染24小时后，收集裂解产物，在4℃，700g条件下离心5分钟，吸出上清并加入PBS洗涤，相同条件离心 5分钟后加入250μl的裂解液(Promega)，用封口膜把24孔板封存放到-80℃。经过一次冻融后，取20μl裂解液加到96孔白板中，用Veritas Microplate Luminometer(Turner BioSystems)检测荧光信号。

数据分析

把原始数据输入到Excel表格中计算信背比(S/B)，信噪比(S/N)，Z因子以及假病毒相对感染率和细胞存活率。计算公式如下：S/B＝μ_v/μ_c，μ_v表示病毒对照组信号的平均值，μ_c表示细胞对照组信号的平均值，S/N＝(μ_v–μ_c)/(σ_v–σ_c),σ_v表示病毒对照组信号的标准差，σ_c表示细胞对照组信号的标准差，Z＝1-((3σ_c+3σ_v)/|μ_v–μ_c|),Z因子在0.5与1之间表示实验方法能够有效的区分对照组之间的差异。化合物处理后假病毒的相对感染率＝(μ_cpd–μ_c)/(μ_v–μ_c)×100％，μ_cpd表示待测化合物的平均信号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率＝μ_cpd/μ_c×100％。半数最大效应浓度(EC₅₀)是指能引起50％最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度(CC₅₀)是指引起50％细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组荧光强度降低 50％。EC₅₀和CC₅₀是用Prism软件计算的，每个化合物的选择性指数(SI)＝CC₅₀/EC₅₀。

实施例1

肽可霉素能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒对细胞的感染，其EC₅₀为2.38 μM。且在最高测试浓度下(125μM)不表现出细胞毒性。肽可霉素不能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞。

图1.肽可霉素抑制扎伊尔型埃博拉假病毒对细胞的感染。图1A Vero细胞中加入3倍倍比稀释的肽可霉素，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试肽可霉素对扎伊尔型埃博拉假病毒感染的抑制效果。图1BVero细胞中加入3倍倍比稀释的肽可霉素，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试肽可霉素对细胞的毒性。图1C Vero细胞中加入3倍倍比稀释的肽可霉素，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试肽可霉素对水疱性口炎假病毒感染的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用 Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明肽可霉素不能够抑制水疱性口炎假病毒感染细胞，但能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒感染。

对比例1

万古霉素不能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒。

图2.万古霉素不能抑制扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒。图 2A Vero细胞中加入3倍倍比稀释的万古霉素，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试万古霉素对扎伊尔型埃博拉假病毒感染的抑制效果。图2B Vero细胞中加入3倍倍比稀释的万古霉素，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试万古霉素对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图 2C Vero细胞中加入3倍倍比稀释的万古霉素，加入培养基培养72小时后利用 CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试肽可霉素对细胞的毒性。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用 Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明在测试浓度下万古霉素不引起细胞毒性，且不能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒感染细胞。

实施例2

肽可霉素对肠道病毒71型不具有抑制作用，而且在浓度为125μM时对RD 细胞没有细胞毒性。

图3肽可霉素不抑制肠道病毒71型。图3A用感染复数(Multiple of infections,MOI)为0.1的EV71感染Vero细胞，并且加入浓度分别为10μM，30μM，100μM的肽可霉素，培养42h后收集上清液，用空斑形成实验测定病毒滴度。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。图3B RD细胞中加入3倍倍比稀释的肽可霉素，加入培养基培养96 h后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，检测肽可霉素对细胞的作用。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。

实施例3

肽可霉素阻止扎伊尔型埃博拉假病毒吸附细胞。

图4肽可霉素阻止扎伊尔型埃博拉假病毒吸附细胞。将浓度分别为10μM， 100μM的肽可霉素，和含有2％FBS和1％P/S的DMEM按吸附前、感染中和吸附后三种不同处理方式加入假病毒和细胞中，培养72小时后利用Bright-Glo 试剂盒检测荧光(luciferase)，评估肽可霉素在病毒进入细胞不同阶段中的作用。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表两组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果表明肽可霉素能够阻止扎伊尔型埃博拉假病毒吸附细胞，但不能在假病毒吸附在细胞后起作用。

实施例4

肽可霉素不能抑制扎伊尔型埃博拉病毒复制。

图5肽可霉素不能抑制扎伊尔型埃博拉病毒复制。将扎伊尔型埃博拉病毒minigenome和辅助质粒共同转染到BSR细胞中，并且加入浓度分别为10μM， 30μM，100μM的肽可霉素，含有2％FBS和1％P/S的DMEM(对照)，培养24h 后收集细胞裂解液进行检测。结果表明，肽可霉素的存在对荧光酶的活性无显著影响，说明肽可霉素不能抑制扎伊尔型埃博拉病毒的复制。

实施例5

奥昔拉定柠檬酸盐能够抑制扎伊尔型埃博拉假病毒，其EC50为8.06μM，其对水疱性口炎假病毒的EC50为35.41μM。且在最高测试浓度下(100μM) 不表现出细胞毒性。

图6奥昔拉定柠檬酸盐抑制扎伊尔型埃博拉假病毒。图6A Vero细胞中加入3倍倍比稀释的奥昔拉定柠檬酸盐，加入扎伊尔型埃博拉假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光(luciferase)，测试其对扎伊尔型埃博拉假病毒的抑制效果。图6B Vero细胞中加入3倍倍比稀释的奥昔拉定柠檬酸盐，加入培养基培养72小时后利用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞存活率，测试其对细胞的毒性。图6C Vero细胞中加入3倍倍比稀释的奥昔拉定柠檬酸盐，加入水疱性口炎假病毒培养72小时后利用Bright-Glo试剂盒检测荧光 (luciferase)，测试其对水疱性口炎假病毒的抑制效果。图中的数据来自两个独立的平行实验，误差线代表2组平行实验的标准差。结果使用Graphpad Prism5进行处理。实验结果证明奥昔拉定柠檬酸盐不产生细胞毒性但可以抑制扎伊尔型埃博拉假病毒和水疱性口炎假病毒感染细胞。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

1.Feldmann H,Sanchez A,Geisbert TW.Filoviridae:Marburg and EbolaViruses. Fields Virology.6th ed.:LIPPINCOTT WILLIAMS&WILKINS 2013.

2.Hoenen T,Groseth A,Falzarano D,Feldmann H.Ebola virus:unravellingpathogenesis to combat a deadly disease.Trends Mol Med 2006；12:206-215.

3.Feldmann H,Geisbert TW.Ebola haemorrhagic fever.Lancet 2011；377:849-862.

4.Rougeron V,Feldmann H,Grard G,Becker S,Leroy EM.Ebola and Marburghaemorrhagic fever.J Clin Virol 2015；64:111-119.

5.Parenti F,Beretta G,Berti M,Arioli V.Teichomycins,new antibioticsfrom Actinoplanes teichomyceticus Nov.Sp.I.Description of the producerstrain, fermentation studies and biological properties.J Antibiot(Tokyo)1978；31:276-283.

6.Simon VC,Simon M.Antibacterial activity of teicoplanin andvancomycin in combination with rifampicin,fusidic acid or fosfomycin againststaphylococci on vein catheters.Scand J Infect Dis Suppl 1990；72:14-19.

7.Sipahi OR,Arda B,Yurtseven T,et al.Vancomycin versus teicoplanin inthe therapy of experimental methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)meningitis.Int J Antimicrob Agents 2005；26:412-415.

8.陈林，王其南，蒋玉富，郑行萍，刘鸿渝，李崇智.TEICOPLANIN体外抗菌活性研究.重庆医科大学学报1994；19:173-176.

9.Balzarini J,Pannecouque C,De Clercq E,et al.Antiretroviral activityof semisynthetic derivatives of glycopeptide antibiotics.J Med Chem 2003； 46:2755-2764.

10.Obeid S,Printsevskaya SS,Olsufyeva EN,et al.Inhibition ofhepatitis C virus replication by semi-synthetic derivatives of glycopeptideantibiotics.J Antimicrob Chemother 2011；66:1287-1294.

11.Maieron A,Kerschner H.Teicoplanin therapy leading to a significantdecrease in viral load in a patient with chronic hepatitis C.J AntimicrobChemother 2012；67:2537-2538.

12.Bereczki I,Kicsak M,Dobray L,et al.Semisynthetic teicoplaninderivatives as new influenza virus binding inhibitors:synthesis and antiviralstudies.Bioorg Med Chem Lett 2014；24:3251-3254.

13.Balzarini J,Keyaerts E,Vijgen L,et al.Inhibition of feline(FIPV)and human(SARS)coronavirus by semisynthetic derivatives of glycopeptideantibiotics.Antiviral Res 2006；72:20-33.

14.Buchholz UJ,Finke S,Conzelmann KK.Generation of bovine respiratorysyncytial virus(BRSV)from cDNA:BRSV NS2 is not essential for virusreplication in tissue culture,and the human RSV leader region acts as afunctional BRSV genome promoter.J Virol 1999；73:251-259.

15.Zhang JH,Chung TD,Oldenburg KR.A Simple Statistical Parameter forUse in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.J BiomolScreen 1999；4:67-73.

16.Rumschlag-Booms E,Zhang H,Soejarto DD,Fong HH,et al.Development ofan Antiviral Screening Protocol:One-Stone-Two-Birds.J Antivir Antiretrovir2011； 3:8-10.

Claims

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有组分A，所述组分A为奥昔拉定或其药学上可接受的盐；和

组分B，所述组分B为肽可霉素、或其药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于抑制埃博拉病毒吸附细胞，和/或用于抑制埃博拉病毒感染。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组分A和组分B的重量比为1～3：5～1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包含选自下组的一种或多种组分：

Tamoxifen(他莫昔芬)、Clemastine(氯马斯丁)、Toremiphene(托瑞米芬)、Paroxetine(帕罗西汀)、Amiodarone(胺碘酮)、Clomiphene(克罗米酚)、Securinine(一叶萩碱)、Glafenine(格拉非宁)、Pimethixene maleate salt(匹美噻吨马来酸盐)、Artemisinin(青蒿素)、Indoprofen(吲哚洛芬)、Iodoquinol(双碘喹啉)、和Levonordefrin(左旋异肾上腺素)。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述药学上可接受的盐为柠檬酸盐。

6.一种埃博拉病毒抑制剂，其特征在于，所述抑制剂中包含如权利要求1所述的组合物，其中，所述的组合物还包含选自下组的一种或多种组分：

7.一种体外非治疗目的的抑制埃博拉病毒吸附细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

向所述细胞的培养液中添加如权利要求6所述的埃博拉病毒抑制剂。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法中添加的各组分的浓度为10μM～150μM。