CN116350643A - 2’岩藻糖基乳糖在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用 - Google Patents

2’岩藻糖基乳糖在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用 Download PDF

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CN116350643A CN202210788351.8A CN202210788351A CN116350643A CN 116350643 A CN116350643 A CN 116350643A CN 202210788351 A CN202210788351 A CN 202210788351A CN 116350643 A CN116350643 A CN 116350643A
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Abstract

本发明公开了2’岩藻糖基乳糖在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用，属于医用配制品领域。本发明提供了2’岩藻糖基乳糖或其衍生物或其药学上可接受的盐或以2’岩藻糖基乳糖或其衍生物或其药学上可接受的盐为活性成分的物质在如下任一中的应用：抑制柯萨奇病毒、治疗由于柯萨奇病毒感染所致疾病和改善由于柯萨奇病毒感染所致症状。本发明基于柯萨奇病毒药物筛选模型从母乳成分中筛选出了具有抗柯萨奇病毒的活性成分2’岩藻糖基乳糖。本发明对于柯萨奇病毒预防和感染柯萨奇病毒后疾病的治疗具有重要临床应用价值。

Description

2’岩藻糖基乳糖在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于医用配制品领域，具体涉及2’岩藻糖基乳糖在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用。
背景技术
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)属于人肠道病毒B族(Human Enterovirus B，HEV-B)。HEV-B具有广泛的临床急性疾病的表现，并且HEV-B被认为是造成无菌性脑膜炎的主要原因。此外，有证据表明，儿童糖尿病的发病机制可能也与HEV-B特别是CV-A9、CV-B1、CV-B3和CV-B5有关。柯萨奇病毒可分为A(CV-A)和B(CV-B)两组，其中柯萨奇病毒A9型(CV-A9)是在柯萨奇A组病毒(CV-A)中唯一一种属于HEV-B的病毒，被认为是病毒性脑炎的重要病原体之一。
虽然肠道病毒属含有许多重要的人类病原体，但目前还没有获得许可的治疗或预防肠道病毒感染的药物。病毒全生命周期的每个阶段都可作为潜在药物的作用靶点，但是考虑到药物的有效性及安全性，进入全球市场的药物少之又少。此外，针对肠道病毒的疫苗还没有普及，并且肠道病毒种类繁多，存在多种突变体，未来疫苗的设计面临巨大挑战，考虑到小RNA病毒易突变的性质针对所有肠道病毒设计疫苗难度较大，而当前已经应用于临床的疫苗只有针对脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)和肠道病毒A组71型(EV-A71)这两类肠道病毒。因此，研究针对肠道病毒的有效抗病毒药物意义重大。
目前尚未有2’岩藻糖基乳糖抑制柯萨奇病毒的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何抑制柯萨奇病毒。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物的应用，所述应用可为以下(a)和/或(b)和/或(c)：
(a)2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物在制备预防柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染的药物中的应用；
(b)2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物在制备治疗柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染的药物中的应用；
(c)2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用。
其中，所述抑制柯萨奇病毒可为在机体水平或细胞水平抑制柯萨奇病毒。
所述抑制柯萨奇病毒可为抑制柯萨奇病毒吸附和进入宿主细胞。
所述由于柯萨奇病毒感染所致疾病可为疱疹性咽峡炎，急性出血性结膜炎、手足口病、胸膜痛，心肌炎，心包炎和肝炎等。所述由于柯萨奇病毒感染所致症状可为发热、打喷嚏、咳嗽、出疹等。
所述抑制柯萨奇病毒是在柯萨奇病毒进入宿主或宿主细胞前过程(即入胞前)发挥作用。所以2’岩藻糖基乳糖适于制备用于预防由于柯萨奇病毒感染所致疾病的产品。
进一步地，上述的应用中，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A组。
进一步地，上述的应用中，所述柯萨奇病毒A组为柯萨奇病毒A9型。
进一步地，上述的应用中，所述柯萨奇病毒A9型全基因编码的蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.2。
进一步地，上述的应用中，所述柯萨奇病毒A9型的全基因组核苷酸序列是SEQ IDNo.1。
在本发明的一个实施例中，所述柯萨奇病毒A9型为柯萨奇病毒A9型毒株BUCT01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20091。
进一步地，上述的应用中，所述药物或柯萨奇病毒抑制剂通过抑制柯萨奇病毒吸附宿主细胞实现预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染。
进一步地，上述的应用中，所述药物或柯萨奇病毒抑制剂可通过抑制柯萨奇病毒进入宿主细胞实现预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染。
进一步地，上述的应用中，所述药物或柯萨奇病毒抑制剂抑制柯萨奇病毒的增殖。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供柯萨奇病毒抑制剂，其包括上述的2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物。
所述2’岩藻糖基乳糖的结构式如图10所示。
进一步地，上述柯萨奇病毒抑制剂中，还包括载体材料。
所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
在本发明中，所述2’岩藻糖基乳糖属于人乳低聚糖，是母乳中含量最高的低聚糖。
本发明基于柯萨奇病毒药物筛选模型从抗病毒药物中筛选出了具有抗柯萨奇病毒的活性药物2’岩藻糖基乳糖。本发明对于感染柯萨奇病毒后疾病的治疗以及预防柯萨奇病毒具有重要临床应用价值。
保藏说明
菌种名称：柯萨奇病毒；
拉丁名：Coxsackievirus；
菌株编号：CV-A9 isolate BUCT01；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏机构简称：CGMCC；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2020年10月28日；
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20091；
附图说明
图1示出了加入不同浓度各类母乳成分之后，感染复数为0.001的柯萨奇病毒CV-A9在RD细胞中的相对mRNA表达水平。
图2示出了终浓度为10mg/ml或者5mg/ml的2’岩藻糖基乳糖(即图10所示化合物)对感染复数为0.001的柯萨奇病毒CV-A9的病毒复制抑制率。
图3示出了2’岩藻糖基乳糖(即图10所示化合物)的EC50、CC50和SI。
图4示出了2’岩藻糖基乳糖(即图10所示化合物)的加药时间实验结果。
图5示出了10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖(即图10所示化合物)对感染复数为5的柯萨奇病毒CV-A9的病毒的吸附脱壳抑制效果。
图6示出了10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖(即图10所示化合物)在不同时间点加入对感染复数为5的柯萨奇病毒CV-A9的病毒抑制效果。
图7示出了不加病毒培养48小时后，不加药时的RD细胞形态。
图8示出了感染复数为0.001的CV-A9毒株BUCT01感染48小时后，不加药时的RD细胞形态。
图9示出了为加入终浓度为10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖(即图10所示化合物)和感染复数为0.001的CV-A9毒株BUCT01感染48小时后的RD细胞形态图。
图10示出了2’岩藻糖基乳糖的结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
2’岩藻糖基乳糖的CAS编号为41263-94-9，为Glycome公司产品。所述2’岩藻糖基乳糖的结构式如图10所示。
柯萨奇病毒A9型毒株BUCT01(又称CV-A9毒株BUCT01)：从患手足口病的幼儿粪便中分离并培养所得，经高通量测序鉴定，确认其为一株柯萨奇病毒A9型，全基因组序列分析结果显示其与2013年中国分离出的一株柯萨奇病毒(GenBank accession number：KP289434)的核苷酸同源性最高为91.38％，与2013年中国分离出来的一株柯萨奇病毒A9型(GenBank accession number：KP290111)氨基酸同源性最高为97.91％。CV-A9毒株BUCT01的全基因组核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(GenBank accession No.MW192795.1，UpdateDate 24-JAN-2022)，全基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。CV-A9毒株BUCT01已经于2020年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.20091；参椐的生物材料为BUCT01；分类命名：柯萨奇病毒，其拉丁学名为柯萨奇病毒(Coxsackievirus)。
下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)，***表示具有极显著性差异(P＜0.001)
实施例1、细胞培养和病毒培养
人横纹肌肉瘤细胞系(RD细胞)是从美国模式培养物集存库(ATCC，CCL-136)中获得的，在37℃、5％CO2的条件下，在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco Invitrogen)的DMEM培养基(Gibco)中培养。
将柯萨奇病毒A类9型毒株BUCT01在RD细胞中繁殖，用RD细胞(ATCC CCL-136)做噬斑实验测定病毒滴度。所有感染实验均在生物安全2级(BLS-2)实验室进行。
实施例2、实时荧光定量PCR
本发明中，实时荧光定量PCR所用引物如表1所示，SYBR-Green法扩增程序如表2所示，反应体系如表3所示。
表1、研究中使用的引物序列
Figure BDA0003732517790000051
表2、染料法qPCR扩增程序
Figure BDA0003732517790000061
表3、染料法反应体系
Figure BDA0003732517790000062
本发明中采用GraphPad-Prism 8.3.0软件进行数据分析。
实施例2、从16种母乳成分中筛选具有抗柯萨奇病毒活性的单体成分
2.1、16种母乳成分配制
依据母乳中的主要成分分别配制骨桥蛋白溶液、乳脂球膜溶液、乳清蛋白溶液和乳铁蛋白溶液共计4种蛋白溶液；配制2’岩藻糖基乳糖溶液、3’唾液乳糖溶液、乳糖-N-新四糖溶液、乳糖-N-四糖溶液、3’岩藻糖基乳糖溶液、6’唾液乳糖溶液、低聚半乳糖溶液和低聚果糖溶液共计8种糖类化合物溶液；配制维生素B1溶液、维生素B2溶液、维生素D2溶液和维生素D3溶液共计4种维生素类化合物溶液。
其中，骨桥蛋白溶液的初始浓度为5mg/ml，其溶质为骨桥蛋白(Arla)，溶剂为PBS；
乳脂球膜溶液的初始浓度为5mg/ml，其溶质为乳脂球膜(Glanbia)，溶剂为PBS；
乳清蛋白溶液的初始浓度为5mg/ml，其溶质为乳清蛋白(Fonterra)，溶剂为PBS；
乳铁蛋白溶液的初始浓度为5mg/ml，其溶质为乳铁蛋白(Warrnambool)，溶剂为PBS；
2’岩藻糖基乳糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为2’岩藻糖基乳糖(Glycome)，溶剂为PBS；
3’唾液乳糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为3’唾液乳糖(Glycome)，溶剂为PBS；
乳糖-N-新四糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为乳糖-N-新四糖(Glycome)，溶剂为PBS；
乳糖-N-四糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为乳糖-N-四糖(Glycome)，溶剂为PBS；
3’-岩藻糖基乳糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为3’-岩藻糖基乳糖(Glycome)，溶剂为PBS；
6’唾液乳糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为6’唾液乳糖(Glycome)，溶剂为PBS；
低聚半乳糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为低聚半乳糖(Quantum High-tech)，溶剂为PBS；
低聚果糖溶液的初始浓度为10mg/ml，其溶质为低聚果糖(Meiji)，溶剂为PBS；
维生素B2的初始浓度为100ug/ml，其溶质为维生素B2(健合集团提供)，溶剂为PBS；
维生素B1的初始浓度为1mg/ml，其溶质为维生素B1(健合集团提供)，溶剂为PBS；
维生素D2的初始浓度为1mg/ml，其溶质为维生素D2(健合集团提供)，溶剂为PBS；
维生素D3的初始浓度为1mg/ml，其溶质为维生素D3(健合集团提供)，溶剂为PBS；
其中，PBS从Cytiv购买，其货号为SH30256.01。
2.2、利用柯萨奇病毒A类9型毒株BUCT01从16种母乳成分中筛选潜在的抗柯萨奇病毒药物
96孔细胞板中接种上2.5×104个RD细胞，培养24小时后用CV-A9毒株BUCT01感染RD细胞使每孔中CV-A9毒株BUCT01的MOI为0.001，同时向每孔中分别加入2.1配制的16种溶液各50ul，以添加等体积的DMEM培养基为对照组，继续培养24小时后通过显微镜镜下观察细胞病变，并分别提取培养孔中的细胞中的RNA，用qRT-PCR测定细胞中的病毒复制情况以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。在没有明显细胞毒性的情况下，与对照组相比，对病毒复制抑制率达90％以上视为潜在抗柯萨奇病毒药物。
16种母乳成分溶液对细胞中的CV-A9毒株BUCT01的基因相对表达量的结果如图1所示，图1结果表明：对CV-A9毒株BUCT01抑制率为90％上的有乳脂球膜，乳铁蛋白以及2’岩藻糖乳糖。
2’岩藻糖基乳糖对细胞中CV-A9毒株BUCT01的抑制率结果如图2所示，图2的结果表明10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖和5mg/ml的2’岩藻糖基乳糖对CV-A9毒株BUCT01的抑制率分别99.97％和99.19％。
其中，病毒抑制率根据Ct值计算，用I表示。
抑制率的计算公式为：
A＝2^(CtGAPDH-CtCV-A9)；
I加药处理组(％)＝1-(A加药处理组/A对照组)×100％。
不加病毒培养48小时后，不加药物时的RD细胞形态如图7所示，图7结果表明细胞生长良好，形态完整；感染复数为0.001的CV-A9毒株BUCT01感染48小时后，不加药物时的RD细胞形态如图8所示，图8结果表明CV-A9感染后后细胞密度稀疏，出现大量细胞死亡；加入终浓度10mg/ml(毫克每毫升)的2’岩藻糖基乳糖和感染复数为0.001的CV-A9毒株BUCT01培养48小时后的RD细胞形态如图9所示，图9结果表明细胞生长良好，形态完整，并没有出现病变。
实施例3、抗病毒药物EC50及CC50测定
96孔细胞板中种上2.5×104个RD细胞，24小时后用CV-A9毒株BUCT01感染RD细胞使每个板孔中CV-A9毒株BUCT01的MOI为0.001，同时向其中加入2’岩藻糖基乳糖，使2’岩藻糖基乳糖的浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.5625mg/ml、0.78125mg/ml和0.390625mg/ml，在第2天时通过显微镜镜下观察细胞病变，对没有明显细胞病变的培养孔提取细胞中的RNA，用实施例2的实时荧光定量PCR测定细胞中的病毒复制情况以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。实验重复三次，每次重复每个浓度3个孔。
EC50是指能够有效抑制50％细胞感染病毒的药物浓度，数值越小说明对病毒的抑制效果越好。
CC50是使得50％的细胞发生病变时的药物浓度，数值越高说明对细胞的毒性越低。
SI：选择性指数，为CC50与EC50的比值，数值越大说明成药的可能性越高。
2’岩藻糖基乳糖对CV-A9毒株BUCT01的EC50及CC50测定结果如图3所示，图3中左纵坐标表示2’-岩藻糖基乳糖对CV-A9毒株BUCT01的抑制率，右纵坐标表示2’岩藻糖基乳糖对人横纹肌肉瘤细胞的毒性，横坐标表示2’岩藻糖基乳糖浓度log10(mg/ml)。图3结果表明2’岩藻糖基乳糖对CV-A9毒株BUCT01的EC50＝0.9716mg/ml、CC50＞20mg/ml。2’岩藻糖基乳糖在20-5mg/ml浓度有显著抗病毒感染的效果(抑制率为99.9％-99.1％)，且细胞毒性值没有显著升高。提示2’岩藻糖基乳糖是强力抗CV-A9感染细胞抑制剂。
实施例4、加药时间实验
24孔细胞板中接种上2.5×105个RD细胞，24小时后用CV-A9毒株BUCT01感染RD细胞，使每个板孔中CV-A9毒株BUCT01的MOI为0.001，分别在全感染周期(加病毒时和加病毒孵育2h后)、入胞前(加入病毒时)、入胞后(加病毒孵育2h后)向其中加入浓度为10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖，继续培养24小时后通过显微镜镜下观察细胞病变，并提取培养孔中细胞中的RNA，用qRT-PCR测定细胞和上清中的病毒复制情况以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。阳性对照组添加等体积的DMEM培养基。
结果如图4所示。图4中柱形图从左至右分别是全感染周期、入胞前、入胞后添加10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖后病毒的mRNA相对表达水平，图4可以看出全感染周期和入胞前病毒的mRNA相对表达水平低于入胞后和阳性对照，结果表明：2’岩藻糖基乳糖主要在病毒入胞阶段起作用。
实施例5、吸附内化实验
吸附实验：12孔细胞板中种上0.1×106个RD细胞，24小时后用CV-A9毒株BUCT01与终浓度10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖混合加入RD细胞中，使CV-A9毒株BUCT01的MOI为5，4℃培养2h。随后提取培养孔中细胞RNA，用qRT-PCR测定细胞中的病毒含量以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。
内化实验：12孔细胞板中种上0.1×106个RD细胞，24小时后用MOI＝5的CV-A9毒株BUCT01感染RD细胞，使CV-A9毒株BUCT01的MOI为5，4℃培养2小时，之后加入终浓度10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖，转移至37℃培养1小时后加入蛋白酶K消化15分钟消化细胞表面未脱壳内化的病毒，之后提取培养孔中细胞RNA，用qRT-PCR测定细胞中的病毒含量以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。阳性对照组添加等体积的DMEM培养基。
结果如图5所示。图5中A为吸附实验的病毒相对mRNA表达水平，图5中B为内化实验的病毒相对mRNA表达水平。图5可以看出吸附和内化实验的病毒相对mRNA表达水平均显著低于阳性对照，结果表明：2’岩藻糖基乳糖在病毒吸附和内化阶段都起抑制作用。
实施例6、探究药物具体作用阶段
24孔细胞板中种上2.5×105个RD细胞，24小时后用CV-A9毒株BUCT01感染RD细胞，使CV-A9毒株BUCT01的MOI为5，分别在不同时间点加入终浓度10mg/ml的2’岩藻糖基乳糖，感染后6小时提取培养孔中细胞RNA，用qRT-PCR测定细胞中的病毒含量以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。
具体加药时间如下：感染前1小时，感染时，感染后30分钟，感染后1小时，感染后2小时，阳性对照组添加等体积的DMEM培养基。
结果如图6所示，图6中从左至右的柱形图分别表示添加2’岩藻糖基乳糖的时间为感染前1小时、感染时、感染后30分钟、感染后1小时和感染后2小时，阳性对照。图6中柱形图显示：添加2’岩藻糖基乳糖的时间为感染前1小时和感染时处理组的病毒mRNA相对表达水平显著低于感染后的实验组和阳性对照。图6结果表明2’岩藻糖基乳糖主要在感染前和感染时起作用，感染前预孵育可以起到预防感染的效果，提示2’岩藻糖基乳糖可以作为有效的预防CV-A9感染的药物。
在本发明中，发明人在RD细胞感染柯萨奇病毒A9型毒株BUCT01后加入2’岩藻糖基乳糖发现有较好的剂量依赖的抗柯萨奇病毒效果和较低的细胞毒性。目前没有针对柯萨奇病毒A类9型或其它类似柯萨奇病毒或其它肠道病毒B族的特异性药物，该发明对之后柯萨奇病毒A类9型或其它类似柯萨奇病毒或其它肠道病毒B族在临床用药具有重要参考意义。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物的应用，其特征在于：所述应用为以下(a)和/或(b)和/或(c)：
(a)2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物在制备预防柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染的药物中的应用；
(b)2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物在制备治疗柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染的药物中的应用；
(c)2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物在制备柯萨奇病毒抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A组。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述柯萨奇病毒A组为柯萨奇病毒A9型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述柯萨奇病毒A9型全基因编码的蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述柯萨奇病毒A9型的全基因组核苷酸序列是SEQ ID No.1。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物或柯萨奇病毒抑制剂通过抑制柯萨奇病毒吸附宿主细胞实现预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物或柯萨奇病毒抑制剂通过抑制柯萨奇病毒进入宿主细胞实现预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病或柯萨奇病毒感染。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物或柯萨奇病毒抑制剂抑制柯萨奇病毒的增殖。
9.柯萨奇病毒抑制剂，其包括权利要求1所述的2’岩藻糖基乳糖或其药学上可接受的盐或含有它们中任一种的组合物。
10.根据权利要求9所述的柯萨奇病毒抑制剂，其特征在于：所述柯萨奇病毒抑制剂还包括载体。
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