CN117379432B - 化合物或其药用盐在制备治疗和预防猪伪狂犬病毒所致疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于畜牧业技术领域，公开了化合物或其药用盐在制备治疗和预防猪伪狂犬病毒所致疾病药物中的应用，所述化合物为CGP60474，所述CGP60474为结构式是式I的化合物。本发明通过对CGP60474在PK‑15细胞中对伪狂犬病毒病毒的抑制效果的研究，发现了CGP60474可作为伪狂犬病毒病毒感染的防治候选药物，对感染伪狂犬病毒病毒的治疗具有应用价值。
Description
技术领域
本发明属于畜牧业技术领域，涉及化合物或其药用盐在制备治疗和预防猪伪狂犬病毒所致疾病药物中的应用。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染引起的包括多种家畜和多种哺乳动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者，在养殖过程中，伪狂犬病毒感染可引起怀孕母猪流产、死胎，公猪不育，仔猪神经紊乱、快速死亡和育肥猪呼吸道疾病、生长缓慢等。2011年，变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，给该病的防控增加了新的难题。目前，针对猪伪狂犬病尚没有有效的药物和治疗方法，疫苗预防和猪群净化是防控猪伪狂犬病的主要方法。随着抗病毒研究的发展，筛选和研制抗伪狂犬病毒的药物成为了可能，筛选用于治疗猪伪狂犬病的药物成为兽用防治药物技术领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备预防和/或治疗伪狂犬病毒病毒所致疾病或伪狂犬病毒病毒感染的药物，和/或如何制备伪狂犬病毒病毒抑制剂。
为了解决以上技术问题，第一个目的是提供化合物或其药用盐在制备预防和/或治疗伪狂犬病毒所致疾病的药物或伪狂犬病毒感染的药物中的应用；所述化合物为CGP60474，所述CGP60474为3-[[4-[2-[(3-氯苯基)氨基]-4-嘧啶基]-2-吡啶基]氨基]-1-丙醇（CB号：CB02514596，CAS号：164658-13-3，英文名称 CGP60474），是结构式是式I的化合物：
式I。
上述应用中，所述伪狂犬病毒病毒所致疾病可为伪狂犬病毒病毒引起的感染性疾病或其并发症。例如猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的，发生在猪身上的一种疾病。患病仔猪出生后第2天开始突然发病，表现高热、沉郁、昏睡、呕吐、拉稀、尖叫、共济失调、转圈，倒地后四肢盲目的划动；部分病猪有咳嗽、流鼻液、打喷嚏等表现，个别病猪表现有中枢神经紊乱症状，如强直、阵发性痉挛、后肢运动失调等，死亡率常低于育肥猪。育肥猪感染较少出现神经症状，呈一过性的类似于感冒样的症状，并伴有脑脊髓炎。
上述应用中，所述药物的施用对象为哺乳动物，具体为非人哺乳动物，更具体为猪。
本发明的第二个目的是提供化合物或其药用盐在制备伪狂犬病毒抑制剂中的应用，所述化合物为CGP60474，所述CGP60474为结构式是式I的化合物。
上述应用中，所述药物的施用对象为哺乳动物，具体为非人哺乳动物，更具体为猪。
本发明的第三个目的是提供化合物或其药用盐在制备抑制伪狂犬病毒增殖的药物中的应用，所述化合物为CGP60474，所述CGP60474为结构式是式I的化合物。
上述应用中，所述药物的施用对象为哺乳动物，具体为非人哺乳动物，更具体为猪。
本发明的第四个目的是提供化合物或其药用盐在制备抑制伪狂犬病毒产生细胞病变效应的药物中的应用，所述化合物为CGP60474，所述CGP60474为结构式是式I的化合物。
上述应用中，所述细胞为哺乳动物细胞，具体的可为非人哺乳动物细胞，更具体可为猪细胞，例如猪肾细胞PK-15。
本发明还提供伪狂犬病毒病毒抑制剂，所述伪狂犬病毒病毒抑制剂的活性成分含有CGP60474，所述CGP60474为结构式是式I的化合物。
所述伪狂犬病毒病毒抑制剂可只为CGP60474，也可还含有载体或赋形剂。
这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料（如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等）、难溶性载体材料（如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等）、肠溶性载体材料（如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等）。其中具体的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
本发明通过对CGP60474在PK-15细胞中对伪狂犬病毒病毒的抑制效果的研究，发现了CGP60474可作为伪狂犬病毒病毒感染的防治候选药物。本发明对感染伪狂犬病毒病毒的治疗具有应用价值。
附图说明
图1为实施例1中CGP60474抑制PRV UL13基因转录的结果；所示数据表示为平均值±标准差（Mean ± SD），****表示P≤0.0001 （Student’sttest）。
图2为实施例2中CGP60474抑制PRV基因组复制的结果；所示数据表示为平均值±标准差（Mean ± SD），***表示P≤0.001, ****表示P≤0.0001 （Student’sttest）。
图3为实施例3中CGP60474抑制PRV gE蛋白表达的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1 分子生物学试剂
CGP60474（HY-11009）为MCE产品，其是式I的化合物：
式I。
DMSO（D2650）为Sigma产品。
SYBR qPCR Master Mix（Q341-02）为诺维赞产品。
PRV gE单克隆抗体记载于非专利文献“Pseudorabies Virus Regulates theExtracellular Translocation of Annexin A2 To Promote Its Proliferation. JVirol, 2023, doi: 10.1128/jvi.01545-22.”，由河南农业科学院动物免疫学重点实验室惠赠。
Actin（81115-1-RR）为Proteintech产品。
2细胞株与病毒株
下述实施例中的PK-15细胞为猪肾细胞PK-15（ATCC®CCL-33）为ATCC产品。
下述实施例中的伪狂犬病毒HeNZZ株（PRV-HeNZZ）为GenBank: OQ744680.1（18-JUN-2023）中的Suid alphaherpesvirus 1 isolate PRV-HeNZZ，由河南农业大学国家动物免疫学国际联合中心惠赠。
3 溶液和培养基
下述实施例中所用的溶液和培养基的配制方法如下：
含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基的配制方法为（以500 mL为例）：将50 mL的FBS和5 mL 青链霉素双抗（5000 U/mL）加入到450 mL DMEM培养基中，充分混匀。
FBS（A3160901）、青链霉素（5000U/mL）(15070063)和DMEM培养基（11995065）均为Gibco公司产品。
实施例1：CGP60474在PK-15细胞中抑制伪狂犬病毒病毒复制
本实施例研究CGP60474在猪肾细胞PK-15细胞中对伪狂犬病毒病毒复制的影响。
用DMSO（二甲基亚砜）溶解CGP60474得到CGP60474的浓度为1mM 的原溶液。实验时用DMSO梯度稀释该原溶液，得到各个浓度的CGP60474溶液，将各个浓度的CGP60474溶液分别加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，分别得到含10μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为10μM，DMSO含量为1ml/L，作为CGP60474（10μM）组的培养基）、含1μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为1μM，DMSO含量为1ml/L，作为CGP60474（1μM）组的培养基）和含0.1μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为0.1μM，DMSO含量为1ml/L，作为CGP60474（0.1μM）组的培养基）。
以相应浓度的DMSO为对照，具体为在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中加入DMSO，得到对照培养基（DMSO含量为1ml/L）。
同时设置CGP60474（10μM）组、CGP60474（1μM）组、CGP60474（0.1μM）组和对照组（DMSO）进行平行实验。
CGP60474（10μM）组：PK-15细胞以1.5×105个细胞/孔铺于12板中，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基于37℃、5% CO2的培养箱中过夜培养。将培养基替换为含10μMCGP60474的培养基于37℃、5% CO2的培养箱中培养PK-15细胞3 h，设置3个重复。
将伪狂犬病毒HeNZZ株（PRV-HeNZZ）分别MOI=1感染PK-15细胞，于感染后24 h收取RNA样品，反转录为cDNA，利用组成性表达的GAPDH基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。荧光定量PCR检测病毒UL13基因的表达情况。其中，PCR检测I型IFN基因的上下游引物序列分别为：
UL13-F：5’-ATGGCTGCTGGAGGA-3’（SEQ ID No.1）；
UL13-R：5’-TCAGGCAGCGAGTTC-3’（SEQ ID No.2）。
内参GAPDH基因的上下游引物序列分别为：
pGAPDH-F: 5’- TACACTGAGGACCAGGTTGTG -3’（SEQ ID No.3）；
pGAPDH-R: 5’- TTGACGAAGTGGTCGTTGAG -3’（SEQ ID No.4）。
荧光定量PCR反应体系为2×SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上下游引物各0.2 μL、模板2 μL、超纯水补足体系至10 μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，40个循环。
CGP60474（1μM）组：与CGP60474（10μM）组的区别仅在于将含10μM CGP60474的培养基替换为含1μM CGP60474的培养基，其它操作均相同。
CGP60474（0.1μM）组：与CGP60474（10μM）组的区别仅在于将含10μM CGP60474的培养基替换为含0.1μM CGP60474的培养基，其它操作均相同。
对照组（DMSO）：与CGP60474（10μM）组的区别仅在于将含10μM CGP60474的培养基替换为对照培养基，其它操作均相同。
结果见图1，将对照组（DMSO）感染24 h的UL13基因表达水平视为1，与对照组（DMSO）相比，CGP60474不同剂量处理组均可以显著抑制病毒UL13基因的表达。
实施例2：CGP60474抑制伪狂犬病毒复制
以提取的伪狂犬病毒HeNZZ株（PRV-HeNZZ）DNA为模板，以gD基因引物（gD F和gD R组成） 进行PCR扩增。引物序列如下：
gD F：5’-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’（SEQ ID No.5）；
gD R：5’-GTCCACGCCCCGCCTGAAGCT-3’（SEQ ID No.6）。
PCR反应体系：模板DNA 2 μL；上、下游引物各1 μL；2×PrimeSTAR GC buffer 25μL，2.5 mM dNTP 4 μL；PrimeSTAR 0.25 μL；加超纯水至总体积50 μL。
反应条件：98℃ 预变性3 min；98℃ 变性10 s，58℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，共30个循环；最后72℃ 延伸10 min。
产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR片段长度为217 bp，切胶回收，测定产物DNA浓度，根据DNA浓度和核酸拷贝数计算公式得出核酸拷贝数，dsDNA：(6.02 x 1023次拷贝数/摩尔) × (浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml。将回收产物作为标准品，进行倍比稀释，以稀释后的标准品作为模板，gD 基因上下游引物进行荧光定量PCR扩增。系统自动得出标准曲线y=-3.824x+49.102，R2=0.999，其中y值为CT值，x值为拷贝数lg的指数。
用DMSO（二甲基亚砜）溶解CGP60474得到CGP60474的浓度为1mM 的原溶液。实验时用DMSO稀释该原溶液，得到CGP60474溶液，将该CGP60474溶液加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，得到含1μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为1μM，DMSO含量为1ml/L，作为处理的培养基）。
在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中加入DMSO，得到对照培养基（DMSO含量为1ml/L）。
同时设置实验组和对照组进行平行实验。
1μM CGP60474处理组（实验组）：PK-15细胞以1.5×105个细胞/孔铺于12板中，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基于37℃、5% CO2的培养箱中过夜培养，再换为用含1μMCGP60474的培养基处理PK-15细胞3小时后以伪狂犬病毒HeNZZ株（PRV-HeNZZ）分别MOI=1感染PK-15细胞，于感染后0、12、24、36 h收取细胞样品（每个时间设置3个重复），提取样品总DNA，荧光定量PCR检测伪狂犬病毒的复制情况。将荧光定量PCR检测伪狂犬病毒的CT值带入标准曲线中，计算得到病毒拷贝数。
对照组：与实验组的区别仅在于将含1μM CGP60474的培养基替换为对照培养基，其它操作均相同。
结果见图2，用含1μM CGP60474的培养基处理PK-15细胞3小时后感染PRV12h的实验组的病毒拷贝数比对照组低约103.6个拷贝，感染PRV 24h的实验组的病毒拷贝数比对照组的低106.4个拷贝，感染PRV 36h的病毒拷贝数比对照组的低107.8个拷贝，与对照相比，CGP60474显著抑制PRV基因组的复制。
实施例3：CGP60474抑制伪狂犬病毒gE蛋白表达
用DMSO（二甲基亚砜）溶解CGP60474得到CGP60474的浓度为1mM 的原溶液。实验时用DMSO梯度稀释该原溶液，得到各个浓度的CGP60474溶液，将各个浓度的CGP60474溶液分别加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，分别得到含10μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为10μM，DMSO含量为1ml/L，作为CGP60474（10μM）组的培养基）、含1μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为1μM，DMSO含量为1ml/L，作为CGP60474（1μM）组的培养基）和含0.1μM CGP60474的培养基（CGP60474的含量为0.1μM，DMSO含量为1ml/L，作为CGP60474（0.1μM）组的培养基）。
以相应浓度的DMSO为对照，具体为在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中加入DMSO，得到对照培养基（DMSO含量为1ml/L）。
同时设置CGP60474（10μM）组、CGP60474（1μM）组、CGP60474（0.1μM）组和对照组（DMSO）进行平行实验。
CGP60474（10μM）组：PK-15细胞以1.5×105个细胞/孔铺于12板中，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基于37℃、5% CO2的培养箱中过夜培养。将培养基替换为含10μMCGP60474的培养基于37℃、5% CO2的培养箱中培养PK-15细胞3 h，设置3个重复。
将伪狂犬病毒HeNZZ株（PRV-HeNZZ）分别MOI=1感染PK-15细胞，于感染后24 h收取细胞样品。WB检测样品中伪狂犬病毒gE蛋白的表达情况（采用PRV gE单克隆抗体）。
CGP60474（1μM）组：与CGP60474（10μM）组的区别仅在于将含10μM CGP60474的培养基替换为含1μM CGP60474的培养基，其它操作均相同。
CGP60474（0.1μM）组：与CGP60474（10μM）组的区别仅在于将含10μM CGP60474的培养基替换为含0.1μM CGP60474的培养基，其它操作均相同。
对照组（DMSO）：与CGP60474（10μM）组的区别仅在于将含10μM CGP60474的培养基替换为对照培养基，其它操作均相同。
结果见图3，与DMSO处理组相比，CGP60474不同浓度均可显著抑制PRV gE蛋白的表达，并且较低剂量的CGP60474仍能有效抑制gE蛋白表达。
上述对CGP60474在PK-15细胞中对伪狂犬病毒病毒的抑制效果的研究，表明CGP60474可作为伪狂犬病毒病毒感染的防治候选药物。本发明对感染伪狂犬病毒病毒的治疗具有应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (3)
1.化合物或其药用盐在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病的药物中的应用，其特征在于：所述化合物为CGP60474，所述CGP60474为结构式是式I的化合物：
式I。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述药物为抑制伪狂犬病毒增殖的药物。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述药物为抑制伪狂犬病毒产生细胞病变的药物。
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Non-Patent Citations (1)
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| "Analysis of Viral and Cellular Factors Influencing Herpesvirus-Induced Nuclear Envelope Breakdown";Katharina S. Grimm等;《Journal of Virology》;第86卷(第12期);第1-10页 * |
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