CN114854755B - 一种抑制vstm2l表达的慢病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其制备方法，该慢病毒载体含shRNA的核苷酸序列为两条，分别为：VSTM2L‑shRNA1：GCAGCAACATCTCCCACAAGCVSTM2L‑shRNA2：CAGCAACATCTCCCACAAGCT。所述慢病毒载体是通过将抑制VSTM2L表达的shRNA核苷酸序列插入慢病毒载体pLKO.1所得。或者慢病毒载体与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2通过脂质体Lipofectamine 2000TM共转染HEK293T细胞获得特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。经实验表明，上述shRNA或慢病毒载体或慢病毒能够有效且稳定抑制VSTM2L在人源前列腺癌细胞中的表达，能在制备抑制人前列腺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成能力的药物中应用。同时，也可应用于VSTM2L基因在人前列腺癌发生发展中的作用及机制研究。

Description

一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应用。
背景技术
前列腺癌是全世界范围内最常见的男性恶性肿瘤之一。在前列腺癌患者当中早期患者治愈率较高，而中晚期患者治愈率低并且预后较差。前列腺癌的发病机制复杂，因此寻找其预后分子靶点，对于提高前列腺癌患者预后水平至关重要。
经申请人进行的资料检索，截止目前为止，现有基因编辑技术中，并没有抑制VSTM2L在癌细胞中表达的慢病毒载体的相关文献和技术专利及研究报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应用，通过此慢病毒载体可以特异、持续、稳定、高效的抑制VSTM2L在癌细胞中的表达。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种抑制VSTM2L表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列为两条，分别为：
VSTM2L-shRNA1：GCAGCAACATCTCCCACAAGC
VSTM2L-shRNA2：CAGCAACATCTCCCACAAGCT。
一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体，其特征在于，该慢病毒载体含有权利要求1所述shRNA的核苷酸序列。
具体的，所述慢病毒载体是通过将抑制VSTM2L表达的shRNA核苷酸序列插入慢病毒载体pLKO.1所得。
或者，所述慢病毒载体与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2通过脂质体Lipofectamine 2000TM共转染HEK293T细胞获得特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。
上述抑制VSTM2L表达的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，具体包括：合成用于编码VSTM2L的核苷酸片段；分别利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和AgeⅠ对pLKO.1慢病毒载体进行双酶切；制备VSTM2L基因的 shRNA；连接双酶切慢病毒载体和制备好的shRNA片段；转化鉴定后所提取的质粒即为特异性抑制VSTM2L表达的shRNA慢病毒载体。
或者，利用慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2与重组VSTM2L慢病毒载体通过脂质体Lipofectamine 2000TM共转染HEK293T细胞后，即可得到特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。
经申请人的实验表明，上述抑制VSTM2L表达的慢病毒载体能够在制备抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及克隆形成的药物中的应用。
所制备抑制前列腺癌细胞增殖迁移药物能够有效抑制VSTM2L在前列腺癌细胞中的表达，从而抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成。
本发明的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体，填补了现有技术领域的空白，具体如下：
1、该抑制VSTM2L表达的慢病毒载体可以特异、持续、稳定、高效的抑制VSTM2L在癌细胞中的表达。能有效抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成，为前列腺癌的治疗应用提供一种新方法。
2、为制备治疗人前列腺癌的药物提供了一种新的慢病毒载体。能够特异、持续、稳定、高效的抑制VSTM2L表达的前列腺癌细胞株，可以为研究VSTM2L基因功能提供新的实验材料，填补VSTM2L基因在前列腺癌功能研究中的空白。
3、所述的shRNA不仅可以用于制备治疗人前列腺癌药物中，还可以用于VSTM2L基因在人前列腺癌发生发展中的作用及机制研究。
附图说明
图1是VSTM2L慢病毒载体构建所使用的包装载体pLKO.1质粒的DNA 图谱；
图2是pLKO.1-VSTM2L-shRNA1慢病毒表达载体的部分测序结果图；
图3是pLKO.1-VSTM2L-shRNA2慢病毒表达载体的部分测序结果图；
图4是前列腺癌细胞22Rv1分别感染两种慢病毒后VSTM2L的mRNA 表达情况；
图5是前列腺癌细胞22Rv1分别感染两种慢病毒后VSTM2L的蛋白表达情况；
图6是前列腺癌细胞22Rv1分别感染两种慢病毒后细胞增殖能力的检测结果；
图7是前列腺癌细胞22Rv1分别感染两种慢病毒后细胞迁移能力的检测结果；
图8是前列腺癌细胞22Rv1分别感染两种慢病毒后细胞克隆形成能力的检测结果。
以下结合附图和实施例对本发明进行进一步地详细说明。
具体实施方式
研究发现，V集和跨膜结构域含蛋白质样2(V-set and transmembrane domaincontaining protein 2-like，VSTM2L)是一种能激活细胞间粘附介质活性的受体，该受体在前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌等癌症中显著高表达。该受体与前列腺癌的恶性程度、Gleason评分及无病生存期显著相关，因此下调该受体的表达对抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭具有良好作用，是治疗前列腺癌的一种有效预后靶点。
因此，申请人采用慢病毒靶向的RNAi技术，在癌细胞当中制备一种特异、持续、稳定、高效的抑制VSTM2L基因表达水平的慢病毒载体，填补了该技术领域的空白，同时以前列腺癌细胞系为例进行治疗人前列腺癌的药物应用。该慢病毒载体也可以用来开发抑制VSTM2L基因表达的癌症治疗药物。
需要说明的是，在以下的实施例中，未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均按照常规条件，如分子克隆实验指南，第四版，北京：科学出版社2017中所述的条件。
实施例1：
VSTM2L基因shRNA慢病毒载体构建
(1)设计合成shRNA
本实施例共设计靶向VSTM2L的CDS区或3’UTR的shRNA核苷酸序列两条，分别为：
VSTM2L-shRNA1：GCAGCAACATCTCCCACAAGC
VSTM2L-shRNA2：CAGCAACATCTCCCACAAGCT
设计好shRNA核苷酸序列后，将shRNA核苷酸序列按照下列结构插入即可得到两对shRNA的寡聚核苷酸序列(sense是shRNA序列，anti-sense 是与其互补的序列)：
Forward oligo：5’CCGG-21bp sense-CTCGAG-21bp anti-sense-TTTTTG 3’；
Reverse oligo：5’AATTCAAAAA-21bp sense-CTCGAG-21bp anti-sense 3’；
设计好后交由上海生工生物工程有限公司进行合成，最终得到的靶向 VSTM2L的shRNA寡聚核苷酸序列如下：
VSTM2L-shRNA1：
Forward oligo： 5’-CCGGGCAGCAACATCTCCCACAAGCCTCGAGGCTTGTGGGAGATGTTGCTGCTTTTTG-3’
Reverse oligo：5’-AATTCAAAAAGCAGCAACATCTCCCACAAG CCTCGAGGCTTGTGGGAGATGTTGCTGC-3’；
VSTM2L-shRNA2：
Forward oligo： 5’-CCGGCAGCAACATCTCCCACAAGCTCTCGAGAGCTTGTGGGAGATGTTGCTGTTTTTG-3’
Reverse oligo： 5’-AATTCAAAAACAGCAACATCTCCCACAAGCTCTCGAGAGCTTGTGGGAGATGTTGCTG-3’；
(2)重组VSTM2L shRNA与pLKO.1慢病毒载体
首先，对设计合成的shRNA寡聚核苷酸链进行退火制备；其次，分别用限制性内切酶EcoRⅠ和AgeⅠ对图1所示pLKO.1慢病毒载体进行双酶切，对酶切后的载体进行核酸电泳验证，验证成功后进行胶回收；接着，使用T4 DNA连接酶连接具有相同黏性末端的载体和shRNA片段；最后，转化，提质粒，送测序，选取阳性单克隆即可，测序结果如图2，3所示。
实施例2：
靶向VSTM2L基因的慢病毒制备
(1)HEK293T细胞培养
本实施例所用HEK293T细胞购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，使用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养于37℃、5％CO2培养箱中，细胞长至90％融合状态时进行传代。慢病毒包装前一天将HEK293T细胞经胰酶消化后接种至6孔板，培养24h细胞完全贴壁后，细胞密度达到60-70％即可进行下一步操作。
(2)慢病毒包装
待HEK293T细胞长至60-70％即可进行慢病毒包装。以下操作仅代表六孔板一个孔的用量：取两支1.5mL无菌离心管，第一支离心管中加入125μL opti-MEM稀释慢病毒包装质粒pMD2.G(375ng)、psPAX2(1125ng)与 pLKO.1shRNA质粒(1500ng)；第二支离心管中加入125μL的opti-MEM 与6μL的Lipofectamine 2000TM脂质体；分别将两支离心管静置5min后混匀，室温放置10-15min后滴加到六孔板中，再放置细胞培养箱内继续培养过夜。第二天更换新鲜的低糖完全培养基以去除脂质体，24h后开始收细胞培养液，连收3天后过滤病毒液并于-80℃保存备用。
实施例3：
有效抑制VSTM2L表达的慢病毒载体细胞株构建与鉴定
(1)前列腺癌细胞的培养
前列腺癌细胞22Rv1细胞系购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，在含有10％胎牛血清与1％双抗的RPMI-1640完全培养基中培养于37℃、5％ CO2培养箱中，细胞长至90％融合状态时即可进行传代。
(2)有效抑制VSTM2L表达的22Rv1细胞株的构建
首先，将处于对数生长期的22Rv1细胞系用胰酶消化5min，使用胰酶2 倍体积的完全培养基中和消化后，小心吹落消化下来的细胞收集至15mL离心管中，800×rpm，离心3min，弃掉上清液，收集细胞于离心管底部；接着，向离心管中加入1mL RPMI-1640完全培养基重悬细胞，将细胞接种至6孔板中，接种密度以24h贴壁后细胞达到60-70％融合状态为宜；培养24h后，细胞长至60-70％融合状态时，吸弃原培养基，向每孔中重新加入含有 12μg/mL聚凝胺(polybrene)的完全培养基1mL，同时加入病毒液500μL，轻轻混匀后放回细胞培养箱继续培养，2h后补加500μL的RPMI-1640完全培养基过夜；培养24h后，更换2mL的RPMI-1640完全培养基继续培养；培养24h后，吸弃原培养基，向每孔加入含有1μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640 完全培养基进行筛选，当没有感染慢病毒的阴性对照组细胞全部死亡后，存活下来的细胞即为敲低VSTM2L或对照组的22Rv1细胞稳定株。
(3)稳定抑制VSTM2L表达的22Rv1细胞株效果鉴定
收集构建好的敲低VSTM2L或对照组的22Rv1细胞稳定株，使用 RT-PCR及WesternBlot方法分别检测VSTM2L的敲低效果。如图4、5所示，与对照组相比，感染了VSTM2L-shRNA慢病毒的两个组细胞中VSTM2L的 mRNA表达水平及蛋白表达水平均显著降低；说明设计并构建的靶向 VSTM2L基因的shRNA或慢病毒载体或慢病毒能够有效抑制VSTM2L基因在22Rv1细胞系中的表达。
实施例4：
抑制VSTM2L表达可显著抑制22Rv1细胞的增殖、迁移及克隆形成能力
(1)cck8细胞增殖实验
扩增培养构建好的敲低VSTM2L或对照组的22Rv1细胞稳定株，分别收集不同细胞株，收集方法见实施例3。使用血球计数板对细胞计数后，将细胞接种至96孔板，密度为每孔2000个细胞。分别在第0、1、3、5天同一时间在每孔加入cck8试剂10μL，继续培养4h后使用微孔分光光度计在 450nm处检测吸光度值，每组设置5个重复孔，最终结果输出为Mean±SE。如图6所示，与对照组相比，抑制22Rv1细胞内源VSTM2L表达可明显减弱细胞的增殖能力。
(2)划痕愈合实验
待不同细胞株长至对数期时，胰酶消化并分别收集不同细胞株，使用血球计数板计数后，将细胞株分别接种至12孔板中，每孔接种1×106个细胞，每组设置3个重复孔，12孔板需提前在底部用黑色马克笔横着画三条直线。培养24h后细胞长至100％融合状态，用200μL枪头垂直于黑色线条均匀画三条直线。用1×PBS清洗划掉的细胞三次后，向培养孔中各加入1mL完全培养基，分别在划痕后0h与60h时在倒置显微镜下拍照，并记录每一个拍照点。最后，使用image J软件进行统计分析，计算划痕愈合前后面积。如图7所示，与对照组相比，抑制VSTM2L表达可显著减弱22Rv1细胞的划痕愈合能力，该结果表明抑制VSTM2L的表达能显著抑制前列腺癌细胞 22Rv1的迁移能力。
(3)克隆形成实验
待不同细胞株长至对数期时，用胰酶消化并分别收集细胞株，使用血球计数板计数后，将细胞接种于24孔板中，每孔接种500个细胞，每组重复三个孔，每三天给细胞换液一次，待细胞长出肉眼可见的克隆后即可停止培养。取出细胞培养板，用1mL的1×PBS洗两遍，每孔加入700μL浓度3.7％的甲醛固定15min后小心吸弃甲醛，再向每孔中加入700μL浓度0.1％的结晶紫染液染色30min，染色结束后吸弃染液，用双蒸水清洗培养孔两遍，洗掉浮色，待培养孔干燥后使用数码相机拍照。最后使用image J软件进行克隆个数统计，每个克隆集落所包含的细胞个数不能低于50个。
如图8所示，与对照组相比，抑制VSTM2L表达可显著减少22Rv1细胞的克隆形成数量，表明抑制VSTM2L的表达可明显抑制前列腺癌细胞 22Rv1的克隆形成能力。
综上所述，本发明通过慢病毒靶向的RNAi技术，所得的抑制VSTM2L 表达的慢病毒载体，能高效、稳定、特异的抑制VSTM2L基因的表达，为制备抗癌药物提供了一种新的慢病毒载体，能够促进新型抗癌药物的开发。
以上的实施例是本发明较优的例子，仅仅是帮助本领域的普通技术人员更好地理解本发明的技术方案，本发明不限于上述的实施例。应当理解，本领域普通技术人员在上述实施例的基础上可以进行改进，没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有技术方案都应当属于本发明保护的范围。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体及其应用
<140>
<141>
<160> 6
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> VSTM2L-shRNA1
<220>
<400>1
GCAGCAACATCTCCCACAAGC
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> VSTM2L-shRNA2
<220>
<400> 2
CAGCAACATCTCCCACAAGCT
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> VSTM2L-shRNA1（Forward oligo）
<220>
<400> 3
5’ CCGGGCAGCAACATCTCCCACAAGCCTCGAGGCTT GTGGGAGATGTTGCTGCTTTTTG-3’
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> VSTM2L-shRNA1（Reverse oligo）
<220>
<400> 4
5’- AATTCAAAAAGCAGCAACATCTCCCACAAG CCTCGA GGCTTGTGGGAGATGTTGCTGC-3’
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> VSTM2L-shRNA2（Forward oligo）
<220>
<400> 5
5’- CCGGCAGCAACATCTCCCACAAGCTCTCGAGAGCTT GTGGGAGATGTTGCTGTTTTTG-3’
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> VSTM2L-shRNA2（Reverse oligo）
<220>
<400> 6
5’- AATTCAAAAACAGCAACATCTCCCACAAGCTCTCGA GAGCTTGTGGGAGATGTTGCTG-3’

Claims (8)

1.一种抑制VSTM2L表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列为两条，分别为：
VSTM2L-shRNA1：GCAGCAACATCTCCCACAAGC
VSTM2L-shRNA2：CAGCAACATCTCCCACAAGCT。
2.一种抑制VSTM2L表达的慢病毒载体，其特征在于，该慢病毒载体含有权利要求1所述shRNA的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体是通过将抑制VSTM2L表达的shRNA核苷酸序列插入慢病毒载体pLKO.1所得。
4.如权利要求2所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2通过脂质体Lipofectamine 2000TM共转染HEK293T细胞获得特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。
5.权利要求2-4其中之一所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，具体包括：合成用于编码VSTM2L的核苷酸片段；分别利用限制性内切酶EcoRⅠ和AgeⅠ对pLKO.1慢病毒载体进行双酶切；制备VSTM2L基因的shRNA；连接双酶切慢病毒载体和制备好的shRNA片段；转化鉴定后所提取的质粒即为特异性抑制VSTM2L表达的shRNA慢病毒载体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2与重组VSTM2L慢病毒载体通过脂质体Lipofectamine2000TM共转染HEK293T细胞后，即可得到特异性抑制VSTM2L表达的慢病毒。
7.权利要求2-4其中之一所述的抑制VSTM2L表达的慢病毒载体用于制备抑制前列腺癌细胞增殖和迁移药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所制备抑制前列腺癌细胞增殖和迁移药物能够有效抑制VSTM2L在前列腺癌细胞中的表达，从而抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成。
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