CN112980888B - 分泌il-6抗体/cd20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用 - Google Patents

分泌il-6抗体/cd20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及分泌IL‑6抗体/CD20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用，通过将携带IL‑6抗体基因和/或CD20抗体基因的慢病毒载体转染人间充质干细胞，制得分泌IL‑6抗体和/或CD20抗体的间充质干细胞，将该间充质干细胞用于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)治疗，通过持续稳定地在DLBCL肿瘤组织局部高表达IL‑6抗体和CD20抗体，利用IL‑6抗体和CD20抗体的协同抗肿瘤作用，能有效抑制IL‑6介导的DLBCL发展，利用细胞毒性杀伤肿瘤细胞，减少和降低抗体直接注射对肌体正常组织及细胞的影响和副作用，解决体外给药的血药浓度波动问题，为复发、难治性DLBCL提供以间充质干细胞为载体的双抗体同时作用于肿瘤细胞和微环境的双重靶向治疗药物新方案。

Description

分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞、构建方法及其应用。
背景技术
弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金氏淋巴瘤最常见的亚型，全球发病超过10万例。由利妥昔单抗(CD20mAb)、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松构成的R-CHOP一线化疗方案改善了DLBCL患者的预后，但仍有1/3的DLBCL患者因化疗耐药而出现进展或复发。临床实践中，增加CD20mAb剂量并不能明显提高难治或复发DLBCL患者的临床疗效，剂量大到500mg/m2的CD20mAb仅可改善部分老年男性患者的预后，但可引起严重的中性粒细胞减少，血小板下降，感染等3-4级的严重不良反应。因此，不能通过简单提高CD20mAb血药浓度来增加临床疗效。
托珠单抗(Tocilizumab，TCZ)是人源抗IL-6受体单克隆抗体(IL-6RmAb)，可通过与IL-6受体结合抑制IL-6的生物学作用，在风湿关节炎(RA)和巨细胞动脉炎(GCA)治疗中，取得了一定疗效。托珠单抗用于临床肿瘤治疗仅见在消化道肿瘤做了尝试，发现其可以增加消化道肿瘤对化疗的敏感性，但尚未发现其用于非霍奇金氏淋巴瘤临床治疗，发明人所在研究团队研究首次发现难治与复发DLBCL患者肿瘤组织中的IL-6水平高于良性组织，并进一步研究证实肿瘤微环境中的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)分泌IL-6到肿瘤微环境中，IL-6在体外通过诱导Th17和Treg细胞分化上调IL-17A的表达，在DLBCL小鼠模型中，IL-6和IL-17A通过JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路抑制DLBCL凋亡，促进DLBCL细胞生长和耐药，而IL-6抗体在体外显示了对DLBCL细胞株和淋巴瘤体的良好的生长抑制疗效。
此外，现有治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的药物，如利妥昔单抗剂通常采用静脉注射，使得血药浓度在正常组织和肿瘤组织中均匀分布，同时随着时间呈峰谷波动，不能够在肿瘤局部形成高浓度，甚至由于实体肿瘤常表现为瘤内高压，使得体液中的抗体难以进入肿瘤区域，故而现有依靠血液循环将抗体递送靶区域的方式，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时，对正常组织也有一定的损伤。同时，已有的研究结果表明增加利妥昔单抗剂量并不会显著提高难治性、复发性患者的疗效，500mg/m2大剂量抗CD20 mAb仅可以改善部分老年男性患者预后，但会出现中性粒细胞减少，血小板下降，感染等严重不良反应。
发明内容
针对现有治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的药物存在的复发和难治、以及副作用问题，基于发明人所在研究团队的研究发现认为，难治和复发性DLBCL的治疗要同时兼顾杀伤肿瘤细胞和逆转促进肿瘤发展的微环境两个方面及其协同效应。本发明旨在提供一种副作用小的用于弥漫性大B细胞淋巴瘤靶向治疗的药物：分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞，用于近距离、持续分泌IL-6抗体和或CD20抗体，破坏肿瘤微环境，杀伤肿瘤细胞，为复发、难治性DLBCL提供全新的治疗药物；构建分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞的方法，作为本发明的另一个目的。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞的构建方法，该方法包括如下步骤：
将携带IL-6抗体基因和/或CD20抗体基因的慢病毒载体转染人间充质干细胞，制得分泌IL-6抗体和/或CD20抗体的间充质干细胞。
发明人所在研究团队首次发现IL-6抗体能够体内外抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长，基于该研究发现，利用上述方法构建能够分泌IL-6抗体和/或CD20抗体的间充质干细胞；由于间充质干细胞具有多向分化、免疫调节和自我复制更新能力，并且在外界因素作用下，表现出趋向损伤和癌变病变组织的定向迁移能力(归巢性能)；本发明通过对间充质干细胞进行基因修饰，将间充质干细胞构建成IL-6抗体和/或CD20抗体的“生产工厂”和靶向性递送系统，借助间充质干细胞实现将IL-6抗体和/或CD20抗体递送至病变区域，完成针对肿瘤等疾病的干细胞介导的免疫治疗。
进一步地，所用慢病毒载体为Tandab(IL-6Ab)、Tandab(CD20Ab)、Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)中的任一种。
其中，Tandab(IL-6Ab)为含有IL-6抗体基因的慢病毒载体，Tandab(CD20Ab)为含有CD20抗体基因的慢病毒载体，Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)为含有IL-6抗体基因和CD20抗体基因的慢病毒载体。利用上述三种不同的慢病毒载体分别转染间充质干细胞，得到三种不同的间充质干细胞Tandab(IL-6Ab)-MSCs、Tandab(CD20Ab)-MSCs、Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs。该三种间充质干细胞均能够作为治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的药物。
进一步地，间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的任一种。
间充质干细胞的来源广泛，包括但不限于上述四种间充质干细胞，间充质干细胞亦可来源于滑膜、骨骼、肌肉、肝脏、胎盘等。
第二方面，本发明提供了由上述方法构建的分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞。
进一步地，上述间充质干细胞能够分泌产生IL-6抗体和/或CD20抗体。
利用上述间充质干细胞在靶细胞内持续性地分泌产生IL-6抗体和/或CD20抗体，达到对弥漫性大B细胞淋巴瘤形成理想的治疗效果。
第三方面，本发明提供了上述分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞在生产IL-6抗体和/或CD20抗体中的应用。
第四方面，本发明提供了一种生产IL-6抗体和/或CD20抗体的方法，该方法包括：
培养权利要求4所述分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞，以分泌表达IL-6抗体和/或CD20抗体。
进一步地，上述培养条件为：在37℃、5％CO2的条件下，于完全培养基中静置培养。
采用本发明的方法，应用间充质干细胞作为IL-6抗体和/或CD20抗体的“生产工厂”，能够在较长时期内持续分泌表达IL-6抗体和/或CD20抗体。
第五方面，本发明提供了将上述分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞在作为治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤药物的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明首次发现IL-6促进弥漫性大B细胞淋巴瘤生长，而IL-6抗体能够抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长，基于该研究发现，构建能够分泌IL-6抗体和/或CD20抗体的间充质干细胞，作为药物用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤，具有靶向性以及治疗效果好的优势。
(2)本发明构建分泌IL-6抗体/CD20抗体的间充质干细胞，利用间充质干细胞对肿瘤等病灶的主动趋化归巢迁移行为，达到目标区域，实现IL-6抗体和/或CD20抗体的递送，与现有抗体只能依靠血液循环输送至靶区域的方式相比，本发明利用间充质干细胞进行递送抗体的方式，具有靶向性，能够显著降低正常组织中的血药浓度，明显降低对正常组织产生的损伤。
(3)本发明利用能够分泌IL-6抗体和CD20抗体的间充质干细胞的趋化性，将其移植于荷瘤动物体内，通过持续稳定地在DLBCL肿瘤组织局部高表达IL-6抗体和CD20抗体，避免了静脉给药的血药浓度平均分布和峰谷问题，能有效近距离中和DLBCL微环境中IL-6，抑制IL-6介导的DLBCL发展，解除耐药，促进其凋亡；CD20抗体与DLBCL细胞中的CD20抗原特异性结合，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用杀伤肿瘤细胞，减少和降低抗体直接注射对肌体正常组织及细胞的影响，解决体外给药的血药浓度波动问题；利用IL-6抗体和CD20抗体的协同作用，建立针对DLBCL细胞和淋巴瘤微环境细胞因子的双重靶向治疗途径，最终阻断淋巴瘤免疫逃逸，为复发、难治性DLBCL提供以间充质干细胞为载体的双抗体同时作用于肿瘤细胞和微环境的双重靶向治疗药物新方案。
附图说明
图1为含有目的基因Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)的YOE-LV001载体；
图2为Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)(简称MSCs.tandab组)、MSCs.Vector组和MSCs组中目的基因表达情况图；
图3为MSCs.tandab组、MSCs.Vector组和MSCs组中目的蛋白表达情况图；
图4为MSCs.tandab组、MSCs.Vector组和MSCs组中荧光检测图；
图5为本发明间充质干细胞Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)治疗DLBCL的机理图；
图6为Tandab(IL-6Ab)对DLBCL细胞的抑制效果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例所涉及各原料如无特别说明，均为市售通用产品。
实施例1分泌IL-6抗体和CD20抗体的间充质干细胞及其构建方法
一、分泌IL-6抗体和CD20抗体的间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤：
1.构建IL-6抗体和CD20抗体轻链、重链的串联双抗体目的基因Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)，该基因构成为：CD33SP-VLCD20Ab-GGGGS-VHCD20Ab-3×GGGGS-VLIL-6Ab-GGGGS-VHIL-6Ab-6His。
2.Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)载体构建及病毒包装
委托广州井源生物科技有限公司定制载体YOE-LV001-Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)，如图1所示，并将其与病毒包装辅助质粒一起共转入293T细胞，包装慢病毒，检测抗体滴度构建稳转MSCs，制得Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs。具体制备方法如下：
2.1病毒包装
1)293T接种4×105～6×105个细胞至10cm培养皿；细胞放入37℃，5％CO2培养。
2)取病毒包装辅助质粒与目的质粒(YOE-LV001-Tandab(IL-6Ab/CD20Ab))至洁净的离心管，加入一定量的Ubigene转染试剂，混合均匀后室温孵育5分钟，随后逐滴加入293T细胞培养皿内，摇晃均匀后放入培养箱中继续培养5-6小时。吸除含有转染体系的培养液，更换新鲜的完全培养基，放入培养箱中继续培养48～72小时。
3)于4℃、1500g离心20分钟以去除细胞碎片；取离心后的上清，用0.45μm针头滤器过滤至100kda超滤管中，随后于4℃、3000g离心20分钟，剩余液体即为浓缩的慢病毒；置于-80℃冰箱保存备用。
2.2慢病毒滴度检测
1)接种293T3×105/孔至6孔板。培养液总体积为2ml。细胞放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养24小时。进行细胞计数，计算平均每孔的细胞量。
2)吸取一定量的待测慢病毒样品加入293T细胞培养液中，每个样品做3个复孔。加入Polybrene至终浓度5μg/ml促进病毒感染，轻轻摇晃均匀后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养48小时；提取其基因组DNA。
3)稀释标准品：将包含慢病毒特征单拷贝基因的质粒标准品和包含细胞特征单拷贝基因的质粒标准品分别稀释至107、106、105、104、103、102copies/μL。qPCR反应体系，检测病毒滴度。
2.3 MSCs细胞准备
间充质干细胞(MSCs)，接种于10cm OriCellTM MSCs完全培养基，轻轻吹打，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.4慢病毒转染MSCs
1)MSCs细胞消化成单细胞悬液，接种细胞至6孔板，每孔培养液体积为2ml。细胞放入37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，取2～3个孔的MSCs细胞消化成单细胞悬液。
2)吸取适量慢病毒加到MSCs细胞的培养液中，并加入Polybrene促进病毒感染，此步所需病毒量＝MOI×细胞量。病毒转导24小时后，更换新鲜的完全培养基。病毒转导48小时后观察病毒感染效率，对转导后的细胞及未转导病毒的空白细胞组更换2ml含相应浓度抗生素的完全培养基进行药筛。
3)此后每2～3天更换新鲜的药筛培养基，直至空白细胞全部死亡为止；获得MSCs.Tandab稳转细胞株，即Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs。
二、Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs中目的基因检测
通过RT-qPCR检测稳转细胞株Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs的基因表达，具体检测方法如下：
提取并测量RNA浓度，将样品放入PCR仪中，设定：37℃15min，85℃5sec，4℃保存，逆转录反应获得cDNA；常规RT-qPCR扩增目的基因，利用western blot检测目的蛋白表达情况。
1.利用western blot检测目的蛋白表达的具体方法如下：
(1)培养上清提取蛋白：将对数生长期的各组MSCs细胞消化成单细胞悬液，接种细胞至6孔板，不换液培养，待细胞长满后，分别吸取细胞培养上清液于离心管中，加入蛋白酶抑制剂；保存进行下一步实验。
(2)裂解细胞提取胞内蛋白：步骤(1)中吸弃多余的培养基，用PBS洗涤2次，在每孔中加入150μl RIPA提取液，冰上静置裂解约10分钟后，用细胞刮刮细胞，吸取细胞悬液于ep管中，涡旋振荡，于4℃、12000rpm，离心15min后收集上清于新的ep管中，并做好标记。
(3)检测蛋白浓度：BCA试剂盒检测裂解液中的蛋白浓度。
(4)制备凝胶，加样，电泳(80V 30min,后110V 1h)至条带到距底端约1min处结束电泳。
(5)转膜：剪PVDF膜并做好标记，置于装有甲醇的皿中浸泡约2分钟，使膜激活，根据蛋白大小及marker标记进行切胶，将切下的胶铺于组件黑色面，在胶上面铺上剪好的转膜纸，避免产生气泡；将组件加入槽内，倒满转膜液，电流200mA，冰上转膜约1H。
(6)封闭：将转好的PVDF膜于5％BSA中封闭1H。
(7)一抗孵育：配制6X his tag一抗溶液及GAPDH一抗溶液，4℃过夜孵育。洗涤。
(8)二抗孵育：配制二抗溶液，孵育1h、洗涤、曝光。
2.免疫荧光检测
(1)PBS洗涤细胞2次。用新鲜配制的4％多聚甲醛溶液在小皿中固定细胞15-20分钟，PBS洗三遍，每次5分钟。
(2)用0.5％triton X-100对细胞透化处理10分钟。PBS洗三遍，10％山羊血清封闭30分钟，PBS洗两遍。兔6x his tag抗体溶液，室温孵育1小时，PBS洗三遍。
(3)CST 594二抗，加入小皿中，室温避光孵育30分钟。PBS洗三遍。
(4)封片及观察：加入DAPI染色液染色3分钟，用PBS洗3遍，每皿中加入20ul封片剂封片，在共聚焦显微镜下观察，照相。
3.目的基因、目的蛋白的检测结果
以制得Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs作为MSCs.Tandab组；同时，参照上述Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs的构建方法，区别在于，以空载体(YOE-LV001))转染间充质干细胞制得的干细胞作为MSCs.Vector对照组，以未经转染的间充质干细胞作为MSCs对照组。
参照上述目的基因检测方法，对上述MSCs.Tandab组、MSCs.Vector对照组、MSCs对照组进行目的基因检测，结果如图2所示，目的基因表达显示MSCs.Tandab组中Tandab mRNA显著高表达，并且与MSCs.Vector组及MSCs组均有统计学意义(P＝0.0002)，MSCs.Vector组及MSCs组两组之间无统计学意义(P＞0.9999)(图2)。
目的蛋白表达结果如图3所示，显示MSCs.tandab组细胞裂解液经anti-6xHIS tagantibody及相应二抗孵育后，在约55kd处显影，表达tandab融合蛋白，而MSCs.Vector组和MSCs组在55kd处不显影。
细胞免疫荧光结果如图4所示，显示转染质粒(均含EGFP基因)的MSCs.tandab组及MSCs.Vector组均有自发绿色荧光，表明载体转染成功；经anti-6xHIS tag antibody及Anti-rabbit IgG(H+L)(Alexa 
Figure BDA0002946460870000081
594Conjugate)抗体孵育后，只有MSCs.tandab组显示红色荧光，表明目的基因表达了目的蛋白，而MSCs.Vector组和MSCs组则不表达目的基因。
实施例2分泌IL-6抗体的间充质干细胞及其构建方法
参照实施例1制备分泌IL-6抗体和CD20抗体的间充质干细胞的方法，本实施例构建分泌IL-6抗体的间充质干细胞的方法，与实施例1的区别在于定制载体的不同，本实施例分泌IL-6抗体的间充质干细胞制备过程中的定制载体为，YOE-LV001-Tandab(IL-6Ab)；最终制得能够分泌IL-6抗体的间充质干细胞，即Tandab(IL-6Ab)-MSCs。
实施例3分泌CD20抗体的间充质干细胞及其构建方法
参照实施例1制备分泌IL-6抗体和CD20抗体的间充质干细胞的方法，本实施例构建分泌CD20抗体的间充质干细胞的方法，与实施例1的区别在于定制载体的不同，本实施例分泌CD20抗体的间充质干细胞制备过程中的定制载体为，YOE-LV001-Tandab(CD20Ab)；最终制得能够分泌CD20抗体的间充质干细胞即Tandab(CD20Ab)-MSCs。
实施例4分泌IL-6抗体和CD20抗体的间充质干细胞对DLBCL的疗效试验
本实施例以实施例1制得的间充质干细胞：Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-MSCs对DLBCL进行治疗的机理如图5所示，我们设计构建了IL-6抗体和CD20抗体基因构建成的串联双抗(Tandab)载体，通过慢病毒转染人脐带血间充质干细胞(UCMSCs)，形成Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)-UCMSCs。利用UCMSCs的趋瘤效应，对肿瘤细胞和组织局部持续稳定地表达IL-6抗体和CD20抗体，通过有效中和肿瘤微环境细胞分泌的IL-6，逆转IL-6促进的DLBCL生长，增强CD20单抗治疗敏感性，促进DLBCL凋亡；同时CD20抗体与DLBCL细胞表面CD20抗原特异性结合，通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，尽量减少临床直接提高血药浓度带来的副作用。为复发、难治性DLBCL提供一众同时作用于CD20抗原及其微环境IL-6的双重抗体靶向治疗新方案。
为进一步探究分泌IL-6抗体的间充质干细胞在DLBCL治疗中效力，本实施例采用以典型的DLBCL细胞株SU-DHL-2细胞作为靶细胞，分别将间充质干细胞、实施例2制得的分泌IL-6的间充质干细胞Tandab(IL-6Ab)-MSCs分别与SU-DHL-2细胞在直接与间接共培养体系中以1:1比例共培养72h，通过检测共培养的DLBCL淋巴瘤细胞SU-DHL-2增值率以及相关信号分子的表达情况，探究本发明间充质干细胞分泌的IL-6抗体在DLBCL治疗中的效力，试验结果如下：
检测结果如图6所示，图6A为Tandab(IL-6Ab)-MSCs对DLBCL细胞SU-DHL-2的增殖试验结果。图中，Ctrl组为未经任何处理的DLBCL细胞SU-DHL-2增值率，MSC组为间充质干细胞与DLBCL细胞SU-DHL-2共培养时DLBCL细胞SU-DHL-2增殖情况，可以看出，当以间充质干细胞与DLBCL细胞SU-DHL-2共培养时，会促进DLBCL细胞SU-DHL-2的增殖；图中(IL-6Ab)MSCs组为由本发明实施例2制得的间充质干细胞Tandab(IL-6Ab)-MSCs，当其与DLBCL细胞SU-DHL-2共培养时，SU-DHL-2细胞的增殖情况；可见，与MSC组相比，分泌IL-6抗体的间充质干细胞则显著抑制了DLBCL细胞SU-DHL-2的增殖，这是由于间充质干细胞分泌的IL-6具有促进DLBCL细胞SU-DHL-2生长的作用，而通过IL-6抗体拮抗间充质干细胞分泌的IL-6，从而起到抑制IL-6促进的DLBCL细胞SU-DHL-2的生长，使得Tandab(IL-6Ab)-MSCs表现为抑制了MSC促进的DLBCL细胞SU-DHL-2的生长，因此，本发明以分泌IL-6抗体的间充质干细胞能够作为良好的药物载体，拮抗DLBCL环境分泌的IL-6，可用于难治、复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗。
图6B为Tandab(IL-6Ab)-MSCs对DLBCL细胞SU-DHL-2的生长中相关调控信号分子的表达情况。由图可以看出，当以间充质干细胞与肿瘤细胞SU-DHL-2共培养时，SU-DHL-2的生长中相关调控信号分子p-JKA2、p-STAT3的表达上调，而当分泌IL-6抗体的间充质干细胞与DLBCL细胞SU-DHL-2共培养时，与MSC组相比，能够显著抑制p-JKA2、p-STAT3的表达。这与图6A的试验结果相一致，均表明本发明分泌IL-6抗体的间充质干细胞能够作为良好的药物载体，用于弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (1)

1.分泌IL-6/CD20串联抗体的间充质干细胞在制备治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤药物中的应用，其特征在于，所述分泌IL-6/串联CD20抗体的间充质干细胞由如下方法构建得到，所述方法包括如下步骤：
将携带串联双抗体目的基因Tandab(IL-6Ab/CD20Ab)的慢病毒载体转染人间充质干细胞，制得分泌IL-6/CD20串联抗体的间充质干细胞。
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