CN110499298A - 间充质干细胞包装腺病毒系统的建立方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了间充质干细胞包装腺病毒系统的建立方法及应用,属于基因治疗领域。本发明中对用作载体的MSC细胞进行改造获得稳定表达E1基因的MSC‑E1细胞系。再将具有杀伤肿瘤细胞作用的复制缺陷型腺病毒感染这种细胞系,通过细胞内组装,制备一种能够包装并复制腺病毒的细胞系统,将该细胞系统对肿瘤模型小鼠进行尾静脉注射,达到极好的杀伤小鼠肿瘤块的目的。本发明所建立的系统可以解决肿瘤基因治疗中的三大瓶颈,1)使生物治疗剂免除宿主防御机制的攻击;2)使生物治疗剂特异性的到达肿瘤部位;3)使治疗基因在肿瘤组织内高效表达。
Description
技术领域
本发明涉及病毒载体的构建,MSC细胞的克隆基因E1体外转染,以及重组腺病毒感染MSC细胞,并应用于乳腺癌的治疗,属于基因治疗领域。
背景技术
基因治疗的手段是将抑癌基因用某种载体导入到肿瘤细胞中,使其表达并执行对肿瘤细胞的杀伤作用。目前众多的抑癌基因已被发现,病毒载体以其高效性广泛应用于科研及临床实践,80%以上使用腺病毒和逆转录病毒。逆转录病毒能够整合到宿主基因组,因此可能产生插入突变,而造成安全性的问题。而腺病毒可以高效表达目的基因,且不整合到宿主基因组中,故使用更安全,更有发展前景。某些治疗性的抑癌基因,比如p53,p14已经应用于临床生物治疗。虽然能够抑制肿瘤生长的候选基因很多,但是肿瘤基因治疗的实际效果仍不很理想,这主要有三个重要的瓶颈需要克服:一是要解决生物治疗剂怎样免除宿主防御机制的攻击,二是要解决生物治疗剂怎样特异性的到达肿瘤部位,三是要让治疗基因怎样在肿瘤组织内高效表达。当前腺病毒载体介导基因转移,以其高转染效率成为目前基因治疗中经常采用的方法,但这种方法无法解决靶向性的问题,而且裸病毒有很强的免疫原性,所以只能局限于对表层实体肿瘤的局部注射,而不能用于治疗深层肿瘤和肿瘤的扩散。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)由Friedenstein等在1968年首先发现,是一种存在于骨髓与其他组织间质内的非造血系成体干细胞,具有自我更新、增殖及多向分化的潜能,在体外能够贴壁培养并大量扩增,在特定的诱导条件下能够分化为中胚层的脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞等组成。间充质干细胞是是骨髓微环境的重要组成部分,能够分泌许多因子,包括SCF、IL26、IL27、IL28、IL211、IL212、IL214、IL215和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),在体内和体外均具有支持和调控造血的作用。MSC具有独特的免疫表型和免疫调节能力,已有的研究显示MSC不表达MHC2Ⅱ类分子和FasL,不表达或极低水平表达MHC2Ⅰ分子,也不表达共刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD40L,在体内和体外均表现出较强的免疫抑制作用。因此,MSC被广泛应用于干细胞移植、组织工程和器官移植免疫治疗等方面。
肿瘤微环境对维持肿瘤的生长和进展起着重要的作用。肿瘤微环境包含有各种基质细胞:血管内皮细胞,成纤维细和炎性细胞等。许多报道表明这些细胞均来源于骨髓细胞,特别是骨髓来源的间充质干细胞有很强的嗜肿瘤特性,且具有多项分化潜能,因此MSC在肿瘤微环境的形成过程中起非常重要的作用。肿瘤生长过程中可通过自分泌或旁分泌等方式产生多种可溶性因子,趋化骨髓来源的MSC向肿瘤的靶向迁移,而不同组织来源的MSC对不同的肿瘤可能由不同的分子信号途径所介导。
发明内容
本发明的目的在于解决上述三大瓶颈,其技术原理在于:(1)间充质干细胞具有嗜瘤性,用稳定表达E1基因的间充质干细胞包裹缺失E1基因的腺病毒,可以包装出具有复制能力的腺病毒并将腺病毒特异性到达肿瘤部位产生作用。(2)间充质干细胞缺乏免疫原性,用其包裹重组腺病毒可以解决裸露病毒被宿主防御机制攻击的问题。(3)由于体外操作时初始毒种缺失E1基因,不能在体外自主复制,极大的提高了操作的安全性。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
间充质干细胞包装腺病毒系统的建立过程主要包括三个部分,即一、构建稳定表达腺病毒E1基因的MSC细胞MSC-E1;二、用缺失E1基因的AdGFP腺病毒感染MSC-E1细胞;三、获取转染了AdGFP的MSC-E1细胞悬液,对肿瘤模型小鼠进行尾静脉注射。本发明将分别对每个部分进行详细说明。
一、本发明提供的构建稳定表达腺病毒E1基因的MSC细胞MSC-E1的方法包括以下步骤:
1.在NCBI上查找Human adenovirus 5基因的E1A+E1B序列,具体为腺病毒基因组上的560bp至3509bp,首尾添加pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒上的单酶切位点,进行全序列合成E1基因。
2.步骤1中选定的酶可以是任意的单一存在的酶切位点,虽然提供了我们做的时候选择的酶切位点作参考,但不限于这个。步骤1中选定的酶对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro进行酶切,并用琼脂糖凝胶对酶切后的载体片段进行分离并用切胶回收试剂盒对酶切后线性化的载体进行回收。
3.用T4连接酶将合成的E1基因和线性化的载体进行连接,将连接产物转入DH5α感受态细胞中,涂在带有氨苄抗性的LB固体培养皿上。
4.隔天挑取培养板上的单个克隆进行一代测序,保存测序结果符合要求的菌种,构建成功的质粒命名为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1。
5.提取pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1质粒,与慢病毒骨架质粒共转染MSC细胞。
6.用嘌呤霉素筛选转染后的MSC细胞如何筛选,得到稳定表达E1基因的MSC细胞MSC-E1。
嘌呤霉素的筛选方式为在培养基中添加浓度为2μg/ml的嘌呤霉素培养2周,在下面的具体实施方案中体现,稳定表达算是专业术语,就是利用这种方式构建的细胞株之后就可以认为可以稳定表达这一基因。
二、本发明提供的用缺失E1基因的AdGFP腺病毒感染MSC-E1细胞的方法包括以下步骤:
1.将MSC-E1细胞接种于T25细胞培养瓶中,待细胞密度达到70%时感染缺失E1的AdGFP病毒。细胞密度70%指:当细胞长满细胞培养瓶时为100%,长到培养瓶培养面积的70%。70%指培养瓶底表面积,细胞在培养瓶中只贴壁生长一层。
2.将T25细胞培养瓶中的培养基换成含有2%血清的DMEM高糖培养基,DMEM高糖培养基以MOI=5接种AdGFP病毒。2%血清指血清和培养基的体积比,DMEM高糖培养基在HyClone公司购买。
3.培养4-5小时后,用胰酶将细胞消化至变圆,用移液枪将细胞吹下,并通过台盼蓝染色的方法对细胞悬液进行细胞计数。
4.离心细胞悬液,倒掉上清,用PBS垂悬细胞沉淀,并根据细胞计数的结果将细胞密度调整为107/ml。
三、本发明提供的用间充质干细胞包装腺病毒系统注射肿瘤模型小鼠的方法包括以下步骤:
1.在裸鼠乳房垫处注射小鼠乳腺癌细胞悬液,观察肿瘤球的生长情况。
2.至肿瘤球生长可见时,在小鼠尾静脉注射步骤二中所得到的细胞悬液。
3.每天观察肿瘤球的大小变化情况。
附图说明
图1间充质干细胞由于存在包装出的AdGFP腺病毒呈现绿色荧光
图2间充质干细胞包装的腺病毒对小鼠肿瘤的杀伤
图3间充质干细胞在小鼠各组织中的分布
具体实施方式:
1.在NCBI上查找Human adenovirus 5基因的E1A+E1B序列,具体为腺病毒基因组上的560bp至3509bp,首尾添加XbaⅠ和NotⅠ的酶切位点,序列发往生工生物工程(上海)股份有限公司进行全序列合成。
2.用NEB的XbaⅠ和NotⅠ酶各1μl对1μg的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒进行酶切,并用琼脂糖凝胶对酶切后的载体片段进行分离并用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后线性化的载体进行回收。
3.用1μl NEB的T4 DNA连接酶将150ng合成的E1基因和50ng线性化的载体DNA,将连接产物转入DH5α感受态细胞中,涂在带有氨苄抗性的LB固体培养皿上。
4.隔天挑取培养板上的单个克隆进行一代测序,保存测序结果符合要求的菌种,构建成功的质粒命名为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1。
5.选用天根生化科技(北京)有限公司的质粒大提试剂盒提取pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1质粒,与慢病毒骨架质粒共转染MSC细胞。
6.按照2μg/ml的浓度在细胞培养基中添加嘌呤霉素,加入量筛选转染后的MSC细胞,培养2周后,得到稳定表达E1基因的MSC细胞MSC-E1。
7.取一管冻存的MSC-E1细胞于37℃水浴融化,4℃,800rpm离心5min,弃掉上清,用含有10%FBS的DMEM高糖培养基垂悬细胞沉淀,将MSC-E1细胞接种于T25细胞培养瓶中。
8.待T25培养瓶中细胞密度达到70%时,将培养基吸出,用PBS清洗一次,以MOI=5计算接种AdGFP病毒的病毒量,将病毒与含有2%FBS的DMEM高糖培养基混匀后加入培养瓶中。
9.培养4-5小时后,得到可以包装出AdGFP腺病毒的间充质干细胞,见附图1。
10.用1ml胰酶消化3分钟,将细胞消化至刚刚变圆,加入2mlDMEM高糖培养基,用移液枪将细胞轻柔吹下,收集细胞悬液。
11.取20μl细胞悬液与20μl台盼蓝混匀打入加样板,利用细胞计数仪对细胞悬液进行细胞计数。
12.将计数后的细胞悬液进行4℃,800rp离心,离心时间5分钟。
13.倒掉上清,用PBS垂悬细胞沉淀,并根据细胞计数的结果将细胞密度调整为1×107/ml。
14.在裸鼠乳房垫处注射1x106 N2O2-H2BGFP乳腺癌细胞悬液,观察肿瘤球的生成情况。
15. 2-3周后,肿瘤球生长清晰可见,此时在小鼠尾静脉注射100μl步骤中所得到的细胞悬液。
16.每天观察肿瘤球的大小变化情况,统计发现与单纯的间充质干细胞或腺病毒相比较,间充质干细胞包装的腺病毒对肿瘤有明显的杀伤作用,结果见附图2
17.每隔24h杀死5只小鼠,连续观察至72h。取小鼠的心肝脾肺肾及肿瘤组织,研磨成细胞悬液后测量吸光度值。发现MSC绝大部分定位在肿瘤组织内,24h、48h、72h后MSC在肿瘤内的占比分别为83%、96%和84%,见附图3。
Claims (6)
1.一种使用间充质干细胞包装重组腺病毒的方法,其特征在于,包括:
(1)用慢病毒系统改造MSC细胞,获得稳定表达腺病毒E1基因的MSC-E1细胞系;
(2)用缺失E1基因的腺病毒AdGFP感染MSC-E1细胞系,以获得可复制的腺病毒AdGFP。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(1)具体为:构建pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1质粒,与腺病毒骨架质粒共转染MSC细胞。
3.如权利要求2所述方法,其特征在于,步骤(1)具体为:
1)选取腺病毒基因组上的560bp至3509bp,首尾添加XbaⅠ和NotⅠ的酶切位点,进行全序列合成;
2)用XbaⅠ和NotⅠ酶对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒进行酶切,并用琼脂糖分离并切胶回收线性化的载体;
3)用T4连接酶将合成的E1基因和线性化载体连接并转入DH5α感受态细胞中,并于带有氨苄抗性的LB培养基中筛选出单克隆进行一代测序,保存测序结果符合要求的菌种,构建成功的质粒命名为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1;
4)将pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1质粒与慢病毒骨架质粒共转染MSC细胞并用嘌呤霉素筛选转染后的MCS细胞,得到稳定表达的MSC-E1细胞系。
4.如权利要求1所述方法,其特征在于,用缺失E1基因的AdGFP腺病毒在含有2%血清的DMEM高糖培养基培养环境下,2%血清指血清和培养基的体积比,以MOI=5感染MSC-E1细胞。
5.如权利要求1所述方法,其特征在于,还包括:
将步骤(2)中的细胞消化下来,对构建了肿瘤模型的小鼠进行尾静脉注射;
(1)每只裸鼠乳房垫注射1×106N2O2-H2BGFP细胞悬液;
(2)2-3周后在小鼠尾静脉注射100μl浓度为1×107/ml的包装有缺失E1基因的AdGFP腺病毒的MSC-E1细胞悬液。
6.权利要求1所制备的间充质干细胞包装腺病毒的系统,用于治疗恶性肿瘤的腺病毒的药物。
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