CN110387356A - 一种利用盘鲍凝集素减轻痘苗病毒毒副作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域。痘苗病毒在治疗肿瘤过程中引发的毒副作用需要得到有效的缓解，本发明提供一种通过携带盘鲍凝集素(HddSBL)基因来减轻痘苗病毒治疗肿瘤时的毒副作用的方法；进一步地，本发明提供了一种携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒。本发明通过动物实验证实，HddSBL能够降低痘苗病毒在C6动物模型中引起的副作用，延长小鼠的存活时间；而且HddSBL是通过降低痘苗病毒诱导的肿瘤组织IL‑2释放来减轻痘苗病毒在治疗肿瘤时引发的毒副作用。

Description

一种利用盘鲍凝集素减轻痘苗病毒毒副作用的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地讲，涉及一种通过携带盘鲍凝集素基因来减轻痘苗病毒治疗肿瘤时的毒副作用的方法。
背景技术
溶瘤病毒是通过对自然界存在的致病力较弱的病毒进行改造，使其能够选择性的感染肿瘤细胞，大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，达到治疗肿瘤疾病作用的一类病毒。溶瘤病毒有着悠久的历史，可以追溯到1950年代，但只有最近进入常规临床实践。现较常见的有溶瘤腺病毒，疱疹病毒，痘病毒，小核糖核酸病毒(包括柯萨基病毒、脊髓灰质炎病毒和塞内加谷病毒)，麻疹病毒，呼吸道、细小病毒等。目前疱疹病毒T-VEC被FDA批准治疗黑色素瘤，T-VEC是携带重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的人类I型单纯疱疹病毒，在局部晚期和转移性黑色素瘤的三期临床试验中功效显著，在其他临床试验中安全性也较好。目前正在研究试验早期和晚期阶段的黑色素瘤和其他固体恶性肿瘤，包括了T-VEC结合免疫检查点抑制剂程序性死亡蛋白1(PD-1),细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，或者结合系统性化疗和放疗。溶瘤腺病毒H101被中国批准治疗鼻咽癌的结合全身化疗。
痘苗病毒是痘病毒家族中的大双链DNA病毒，相比其他溶瘤病毒有以下几个优点：1、它在DNA病毒中是独一无二的，因为它只在细胞质中复制，以尽量减少整合在宿主基因组内的风险；2、痘苗病毒最早被制成疫苗来对抗天花病毒，其安全性有较大的保障；3、痘苗病毒的克隆能力大，可以允许较大长度的基因片段的插入；4、病毒复制能力强。溶瘤痘苗病毒已经表现出抗肿瘤效力，多个临床前肿瘤模型系统并已进入临床试验。目前缺失胸苷激酶和牛痘生长因子基因的痘苗病毒vvDD，进行了静脉注射对实体瘤的一期临床试验，发现人体可以在4小时内清除血液中的病毒，但在随后几天肿瘤活体检验中发现痘苗病毒，在其他部位器官几乎没检测到痘苗病毒，有较高的肿瘤靶向性，该临床试验中除了出现一些急性病毒感染的症状，没有特别严重的副作用出现。使用痘苗病毒LIVP菌株，通过在F14.5L，J2R(胸苷激酶)和AIVR(血凝素)基因座插入三个表达框构建出GLV-1h68，已被证明可以选择性的在癌细胞中复制。在全身性递送的临床前动物肿瘤模型中GLV-1h68在肿瘤中复制，导致肿瘤消退。静脉注射GLONC-1(临床级GLV-1h68)目前正在进行临床试验(ClinicalTrials.gov标识符NCT00794131和NCT01443260)。重组痘苗溶瘤病毒不仅有较强的溶瘤能力，还能绕过许多肿瘤免疫逃逸机制如感染病毒的肿瘤细胞给免疫系统提供新的抗原，增强I型干扰素信号等。
盘鲍凝集素(Haliotis discus discus sialic acid binding,HddSBL)是一种唾液酸结合凝集素，之前的研究利用腺病毒携带HddSBL基因构建出非复制型腺病毒Ad-HddSBL，并且发现HddSBL可以通过降低抗凋亡因子Bcl-2来促进Hep3B、A549、H1299和SW480等肿瘤细胞的凋亡；原核表达的融合蛋白sCAR-HddSBL可以促进非复制型腺病毒对恶性胶质瘤细胞U87-MG的感染，sCAR是腺病毒受体的胞外部分，但却在体外细胞水平减缓了细胞病变凋亡的速度，表明HddSBL独特的作用方式。
目前尚未见将HddSBL应用于减轻痘苗病毒毒副作用的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过携带盘鲍凝集素(HddSBL)基因来减轻痘苗病毒治疗肿瘤时的毒副作用的方法。
本发明的另一目的在于提供一种携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒。
本发明的第三目的在于提供上述携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒的构建方法。
本发明的第四目的在于提供盘鲍凝集素基因在制备减轻毒副作用的痘苗病毒中的应用，即上述携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒在制备减轻毒副作用的抗肿瘤药物中的应用，即本发明携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒其毒副作用大大减轻。
本发明的主要技术方案在于：
构建一种携带盘鲍凝集素(HddSBL)基因的痘苗病毒，所述的HddSBL基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
具体构建方法如下：
A、将盘鲍凝集素(HddSBL)的基因序列(如SEQ ID NO:1所示的)通过Xba I和BglII位点插入pCB质粒，获得pCB-HddSBL质粒；
B、痘苗病毒和pCB-HddSBL质粒的重组，构建获得携带HddSBL基因的痘苗病毒。
以上步骤A或B均为本领域常规技术。
所述的痘苗病毒可选择本领域常规的重组痘苗病毒载体，包括但不限于痘苗病毒Western Reserve(WR)株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株，或痘苗病毒NYCBH株等。
在发明的优选实施例中，步骤B、痘苗病毒Western Reserve(WR)株和pCB-HddSBL质粒的重组，构建获得oncoVV-HddSBL。
进一步研究oncoVV-HddSBL在减轻痘苗病毒毒副作用上的应用。并在肿瘤模型上验证其减轻痘苗病毒毒副作用的效果及机制。
本发明通过动物实验证实，HddSBL能够降低痘苗病毒在C6动物模型中引起的副作用，延长小鼠的存活时间；而且HddSBL是通过降低痘苗病毒诱导的肿瘤组织IL-2释放来减轻痘苗病毒在治疗肿瘤时引发的毒副作用。
附图说明
图1是荷瘤小鼠分别注射PBS、oncoVV和oncoVV-HddSBL后的存活曲线。
图2是荷瘤小鼠分别注射PBS、oncoVV和oncoVV-HddSBL后第15天瘤内静脉取血，利用ELISA方法对血清IL-2浓度的检测结果。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，给出以下系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。
实施例1、痘苗病毒oncoVV-HddSBL的构建和鉴定
1、将盘鲍凝集素(Haliotis discus discus sialic acid binding,HddSBL)的基因序列(如SEQ ID NO:1所示的)通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-HddSBL质粒。
2、Western Reserve(WR)株痘苗病毒和pCB-HddSBL质粒的重组，过程如下：
(1)在面积6cm2的培养皿内接种适当数量的293A细胞，使之能于次日长至80-90％成片。
(2)弃去培养液，沿侧壁轻轻加入1mL病毒液(0.05～0.1MOI，用含2％血清的培养基稀释病毒液)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养2～4小时，其间大约每15min摇匀一次，以防细胞局部干死。
(3)细胞转染按照试剂盒(Effectene)说明书进行操作，步骤如下：
将1μg的pCB-HddSBL补加buffer EC至150μL，再分别加8μL Enhance buffer，振荡1s，室温静置5min。在上述三份混合物中分别加入25μL的Effectene buffer，颠倒混匀5次，振荡10s，室温静置5～10min，然后向上述混合物中分别加入1mL的新鲜培养液(可含血清，抗生素)，上下颠倒两次。与此同时，将步骤2中的培液弃去，加入4mL 10％FBS的新鲜培养液，并将混合好的转染液分别加入其中。将培养皿置于37℃，5％CO2培养箱中培养6～18个小时后吸弃培养液，PBS洗一次，加入5mL的新鲜培养液继续培养。
(4)细胞完全病变后，在生物安全柜中收集病毒液，分装到离心管中，标记好，将离心管置-80℃和37℃反复冻融三次，彻底裂解细胞释放病毒，2000rmp离心5min收集上清，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
3、重组病毒的筛选，步骤如下：
(1)将生长状态良好的293A细胞接种于培养皿中，次日细胞密度可达约80％-90％。
(2)准备三种筛选药物：黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸
(3)向(1)中每个培养皿沿侧壁小心加入500μL之前包装出来的病毒液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养2-4h。约2～4h后，吸弃悬浮的病毒液，加入3mL新鲜培养液，其中含7.5μL的(1×)霉酚酸、75μL的(1×)黄嘌呤与7.5μL的(1×)次黄嘌呤。
(4)每天观察细胞病变情况，大约两三天后在生物安全柜中收集全部病变的细胞液，反复冻融三次，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。
(5)每次收集的病毒液按照以上方法重复筛选3～4次。
4、病毒挑空斑及鉴定
(1)5％低溶点胶的配制：称取0.25g的低熔点胶溶于5mL的PBS中，将其121℃高压灭菌20min，然后放于4℃冰箱保存备用。
(2)将状态良好的293A细胞接种于六孔板中，次日，待细胞密度达到90％左右时，将病毒液按照10-4～10-6梯度进行系列稀释，之后弃去六孔板中旧的培养液，向每孔加入1mL稀释好的病毒液使病毒吸附，置于培养箱中培养2～4h后将已煮沸的低熔点胶放置40℃水浴锅中保温，然后放入超净台，加入三倍体积的DMEM培养液使其最终浓度为1.25％，然后用吸管快速混匀并迅速用移液枪将板中的悬浮病毒液吸弃，用吸管沿侧壁小心加入2mL含1.25％低熔点胶的培液，注意不要将细胞吹起，然后将其置于37，5％CO2的细胞培养箱培养。
(3)每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况，如果有孤立的病毒空斑出现，将其挑取置于提前铺好293A细胞的12孔板中，标记好，将其置于37℃，5％CO2的细胞培养箱培养，待其充分病变后，在安全柜收集病毒液于1.5 1mL离心管，置于-80℃超低温冰箱保存，以备下一步鉴定。
(4)利用野生型病毒具有完整的TK区而重组病毒却不具有的特征进行PCR鉴定，获得纯化的痘苗病毒oncoVV-HddSBL。
实施例2、HddSBL显著减轻痘苗病毒在小鼠肿瘤模型上的毒副作用
为了探究oncoVV-HddSBL在荷瘤小鼠体内的作用，我们建立了大鼠C6细胞的裸鼠皮下移植模型，在BALB/c nude裸鼠皮下注射C6细胞后的第10天，接种的裸鼠均长出实体瘤，平均直径为0.6cm。3组小鼠的瘤子体积差异无统计学意义(P＞0.05)。分别用PBS、oncoVV和oncoVV-HddSBL进行腹腔注射，在注射后的第8天再补打一次，观察小鼠的存活情况。结果显示，对照痘苗病毒oncoVV腹腔注射组小鼠在第28天到第50天之间相继死去，而PBS对照组只在第36天出现一只死亡，这说明oncoVV在C6细胞裸鼠皮下移植模型中有极大的毒副作用。然而，oncoVV-HddSBL腹腔注射组虽然分别在第39至57天死亡，但与oncoVV组相比，明显延长了小鼠的存活时间(平均延长9天)，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明HddSBL能够降低oncoVV在C6动物模型中引起的副作用，延长小鼠的存活时间(如图1所示)。
我们用ELISA试剂盒对其血清白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)水平进行了检测。在小鼠初次腹腔注射PBS、oncoVV和oncoVV-HddSBL治疗的第15天，分别从小鼠肿瘤静脉中取200μL左右的血，用血清进行大鼠IL-2的ELISA检测。结果显示，oncoVV组的IL-2明显比PBS组的多，而oncoVV-HddSBL组的明显比oncoVV组的少(如图2所示)。因为高剂量的IL-2引发严重的毒副作用，这一结果提示HddSBL减轻痘苗病毒的毒副作用可能是通过降低痘苗病毒诱导的肿瘤组织IL-2释放。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 李, 恭楚
<120> 一种利用盘鲍凝集素减轻痘苗病毒毒副作用的方法
<130> 说明书，权利要求书
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggatggtg tgtttaaggg aatccttttt ctcggtgtga ccctgtgtgc tgcacaggat 60
gtcagccagt ttgagaccgc cttcagcgcc ggcttgacaa cacatcttac cctccaagcc 120
ggagcgaccg tcatatatga caaagtcttc accaacattg gcaacgccta cgacaacaac 180
accggcgtgt ttacctgccc ccagaccggc atctacgtct tccagtacca cggcctgtcg 240
atgagtgacg ataccctgtg gctagaactc taccacaact acaactacgt gtcgtcagcc 300
tatgcccaca ccaacagcga ctacgcatct gctggcaact ccgtcatcct ccacttgttt 360
aagggggata cggtgatggt gaatgccgaa ccagaccagg agtcgaacct gtacggcgtc 420
agtgatgatg tgtactgcac attctcaggg tacctcattg caccggtgtt tgaggagagc 480
gttgttgtag ggtag 495

Claims (7)

1.一种通过携带盘鲍凝集素基因来减轻痘苗病毒治疗肿瘤时的毒副作用的方法，其特征在于，所述的痘苗病毒携带盘鲍凝集素基因，所述盘鲍凝集素基因的DNA序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒，其特征在于，所述的痘苗病毒携带盘鲍凝集素基因，所述盘鲍凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒，其特征在于，所述的痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株或痘苗病毒NYCBH株。
4.一种如权利要求2或3所述的携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括以下步骤：
A、将如SEQ ID NO:1所示的盘鲍凝集素的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-HddSBL质粒；
B、痘苗病毒和pCB-HddSBL质粒的重组，构建获得携带HddSBL基因的痘苗病毒。
5.根据权利要求4所述的携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒的构建方法，其特征在于，步骤B为痘苗病毒Western Reserve株和pCB-HddSBL质粒的重组，构建获得oncoVV-HddSBL。
6.盘鲍凝集素基因在制备减轻毒副作用的痘苗病毒中的应用，所述的应用是构建携带盘鲍凝集素基因的痘苗病毒，所述盘鲍凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求6所述的盘鲍凝集素基因在制备减轻毒副作用的痘苗病毒中的应用，所述的盘鲍凝集素基因通过降低痘苗病毒诱导的肿瘤组织IL-2释放来减轻痘苗病毒在治疗肿瘤时引发的毒副作用。
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