CN102229962B - 纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体及构建方法和应用 - Google Patents
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体及构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体，在人腺病毒5型基因组922bp-947bp有24bp碱基的缺失；在人腺病毒5型基因组28183bp～29906bp插入表达第一外源基因的表达元件、31042bp处插入纤维蛋白嵌合体、32021bp与32022bp插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件。构建方法为：构建pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭载体、pHBD24腺病毒载体骨架、pHBDE3-第一外源基因的穿梭载体、pHBDE3-第一外源基因/SwaI条件复制型腺病毒载体骨架、pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体、表达eGFP及第二外源基因的穿梭载体/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体序列、制备纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体。该载体能抑制恶性脑胶质瘤、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤作用。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤的基因治疗领域，具体涉及到一种纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体。
背景技术
肿瘤目前是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，通过常规治疗手段难以彻底治愈。基因治疗作为肿瘤治疗的一种新手段，在该领域有着重要的应用前景。近年来，肿瘤治疗中最引人注目的腺病毒载体是条件复制型溶瘤腺病毒载体(Conditionally ReplicatingOncolytic Adenoviral Vector，CRAd)。这类载体感染细胞之后，可以选择性地在肿瘤组织中迅速复制，大量扩增并最终将肿瘤细胞杀死，其子代细胞又会感染周围的肿瘤细胞并且继续复制，最终杀死周边的肿瘤细胞，而对周围的正常细胞产生很少影响，故具有明显的抗肿瘤活性。
CRAd载体大致可分为两种类型，一类是删除一些特定基因，这些特定基因是病毒在正常细胞中复制所必需、而在肿瘤细胞中复制非必需的。它包括E1B-55kD缺失和E1A-24bp缺失。另一类是利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因。但由于肿瘤的恶性程度与腺病毒受体呈负相关的特点，导致其治疗效果并不十分理想。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述条件复制型腺病毒载体的缺点，提供一种对肿瘤组织感染效率高、能增加载体外源基因表达数目的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种方法简单、操作简便的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体的构建方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体提供一种新的用途。
解决上述技术问题采用的技术方案是：在人腺病毒5型基因组922bp-947bp之间有24bp碱基的缺失；在人腺病毒5型基因组28183bp～29906bp之间插入一个表达第一外源基因的表达元件；在人腺病毒载体5型基因组中31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入一个纤维蛋白嵌合体；在人腺病毒载体5型基因组中32021bp与32022bp之间插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件；上述的纤维蛋白嵌合体为5/3F、5/6F、5/30F、5/11F、5/35F序列中的任意一个。
本发明的第一外源基因是Arresten、IL-24、Endostatin、Canstatin、Tumostatin、IFNα、IL-12中的任意一种。
本发明的第二外源基因是TRAIL、IL-24、Endostatin、Canstatin、Tumostatin、IFNα、IL-12中的任意一种。
上述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体的构建方法由下述步骤组成：
1、构建pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭载体
通过设计两对引物，以Ad5基因组质粒为PCR模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段，P1-P4为两对引物的序列：
P1：ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT；
P2：TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG；
P3：CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT；
P4：TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG。
聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、60秒，72℃、2分钟，30个循环；重叠聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回收片段；将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接；连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl2×T4连接酶缓冲液，0.5μl pGEMT-T easy载体，0.5μlT4连接酶，2μl三蒸水，25℃连接1小时，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中；挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆；将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F；将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体进行连接；连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl 2×T4连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μlT4连接酶，2μl三蒸水；连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24shuttle，此载体为获得的pAd5E1A 24bp缺失的穿梭载体。
2、构建pHBD24腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的pHBD24shuttle穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1，共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA；经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为Ad5E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架，命名为pHBD24。
3、构建pHBDE3-第一外源基因的穿梭载体
通过聚合酶链式反应方法扩增位于Ad5E3区12.5k 3’端上游2.0kb的片段，基因片段分别含有PacI与SalI-SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E3-5’；通过聚合酶链式反应方法扩增位于Ad5E3区E314.7k 5’端下游2.0kb的片段，基因片段分别含有SwaI-NotI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E3-5’载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E3，命名为pHBDE3；采用聚合酶链式反应扩增第一外源基因，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态DH5α，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/第一外源基因；在pHBDE3载体的上下游两个基因片段之间通过SalI与NotI插入第一外源基因表达元件；得到的载体即为表达第一外源基因的腺病毒E3穿梭载体，命名为pHBDE3-第一外源基因shuttle。
4、构建pHBDE3-第一外源基因/SwaI条件复制型腺病毒载体骨架
用PacI线性化的表达第一外源基因shuttle的穿梭载体与SwaI线性化的pHBD24腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coli BJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体称为pHBD24-第一外源基因/SwaI。
5、构建pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；聚合酶链式反应扩增位于Ad5E4区3’端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，得到的载体称为pshuttleAd5E4-3′；采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3’端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3’载体相应的酶切位点中，获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber；合成Ad5的Tail以及纤维蛋白嵌合体的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位点，在纤维蛋白嵌合体的Knob3’端引入SpeI位点，通过NdeI和SpeI双酶切，将此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber载体的相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体。
6、构建表达eGFP及第二外源基因的穿梭载体pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体序列
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMTeasy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40，将miniCMV-SV40片段从pGEMT/miniCMV-SV40上经ClaI和NotI双酶切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40；采用聚合酶链式反应方法扩增第二外源基因，扩增的产物经电泳纯化后与pGEMT easy载体相连接，经酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pGEMT/第二外源基因，将第二外源基因片段从pGEMT/第二外源基因上经XhoI和XbaI双酶切下来，用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40进行连接；连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达eGFP及第二外源基因的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；eGFP及第二外源基因的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；将pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因经BamHI及SfuI双酶切末端补平后与经SwaI酶切的腺病毒pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体进行连接，获得的阳性克隆为表达eGFP及第二外源基因的腺病毒pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体，命名为pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体。
7、制备纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因
用XhoI线性化的pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体的穿梭载体与SwaI线性化的pHBD24-第一外源基因/SwaI腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coliBJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体命名为pHBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因；采用磷酸钙法将PacI线性化的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体pHBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因的转染HEK 293细胞系，经过7～10天后，离心收获病毒原液，经2～3轮的病毒扩增，通过两次氯化铯密度梯度超速离心纯化，获得纯化的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因，-80℃冰箱内保存。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗恶性脑胶质瘤药物中的用途。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗肝癌药物中的用途。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗胃癌药物中的用途。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗肺癌药物中的用途。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗结肠癌药物中的用途。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。
本发明在Ad5D24条件复制型溶瘤腺病毒载体的基础上，经过两方面的改造以提高增加载体外源基因的表达数目(2-3个)，对病毒载体进行修饰以提高其感染效率。采用本发明构建方法构建的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL，经药效试验表明，纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对恶性脑胶质瘤细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞有明显的抑制作用。
附图说明
图1是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL的结构示意图。
图2是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对恶性脑胶质瘤细胞系U87细胞的生长抑制曲线。
图3是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肝癌细胞系HepG2细胞的生长抑制曲线。
图4是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对胃癌细胞系BGC-823细胞的生长抑制曲线。
图5是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肺癌细胞系A549细胞的生长抑制曲线。
图6是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对结肠癌细胞系Caco-2细胞的生长抑制曲线。
图7是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的生长抑制曲线。
图8是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc细胞的生长抑制曲线。
图9是纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL在脑胶质瘤模型动物中的抑制曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL如下：
1、在人腺病毒载体5型基因组中第922bp-947bp之间有24bp碱基的缺失。所缺失的24bp碱基序列为：CTTACCTGCCACCAGGCTGGCTTT。
2、在人腺病毒载体5型基因组中28183bp～29906bp之间插入一个Arresten表达元件，Arresten表达元件的序列为：
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3、在人腺病毒载体5型基因组中31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入一个纤维蛋白嵌合体5/11F，纤维蛋白嵌合体5/11F的序列为：
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4、在人腺病毒载体5型基因组中32021bp～32022bp之间插入双表达TRAIL与eGFP的表达元件，双表达TRAIL与eGFP的表达元件序列为：
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上述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL载体的构建方法步骤如下：
1、构建Ad5E1A分子中24bp碱基缺失的穿梭载体
通过设计两对引物，以Ad5基因组质粒为PCR模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段。P1-P4为两对引物的序列：
P1：ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT；
P2：TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG；
P3：CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT；
P4：TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG。
聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、60秒，72℃、2分钟，30个循环。重叠聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回收片段。将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl2×T4连接酶缓冲液，0.5μl pGEMT-T easy载体，0.5μl T4连接酶，2μl三蒸水，25℃连接1小时，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F。将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体进行连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl 2×T4连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，2μl三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24 shuttle，此载体为获得的pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭载体。
2、构建pHBD24腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的pHBD24shuttle穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1，共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为Ad5E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架，命名为pHBD24。
3、构建pHBDE3-Arresten的穿梭载体
通过聚合酶链式反应方法扩增位于Ad5E3区12.5k 3’端上游约2.0kb的片段，基因片段分别含有PacI与SalI-SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E3-5’。通过聚合酶链式反应方法扩增位于Ad5E3区E314.7k 5’端下游2.0kb的片段，基因片段分别含有SwaI-NotI与SpeI位点。将此片段克隆到pshuttle Ad5E3-5’载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E3，命名为pHBDE3。采用聚合酶链式反应扩增Arresten，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态DH5α，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/Arresten。在pHBDE3载体的上下游两个基因片段之间通过SalI与NotI插入Arresten表达元件。这样所得到的载体即为表达第一外源基因的腺病毒E3穿梭载体，命名为pHBDE3-Arresten shuttle。
4、构建pHBDE3-Arresten/SwaI条件复制型腺病毒载体骨架
用PacI线性化的表达Arresten的穿梭载体与SwaI线性化的pHBD24腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coli BJ5183，然后通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体称为pHBD24-Arresten/SwaI。
5、构建pshuttle Ad5-E4-5/11F穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；聚合酶链式反应扩增位于Ad5E4区3′端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，得到的载体称为pshuttleAd5E4-3′；采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3′端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3′载体相应的酶切位点中，获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber。合成Ad5的Tail以及Ad11纤维蛋白的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位点，在Ad11纤维蛋白的Knob3’端引入SpeI位点，通过NdeI和SpeI双酶切，将此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber载体的相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-5/11F。
6、构建表达eGFP及TRAIL的穿梭载体pshuttle Ad5-CMVeGFP/TRAIL-E4-5/11F
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMT-Teasy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40，将miniCMV-SV40片段从pGEMT/miniCMV-SV40上经ClaI和NotI双酶切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40；采用聚合酶链式反应方法扩增TRAIL基因，扩增的产物经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pGEMT/TRAIL，将TRAIL基因片段从pGEMT/TRAIL上经XhoI和XbaI双酶切下来，用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40进行连接；连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达eGFP及TRAIL的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-TRAIL；eGFP及TRAIL的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-TRAIL；将pshuttle-Bio-eGFP-TRAIL经BamHI及SfuI双酶切末端补平后与经SwaI酶切的腺病毒pshuttle Ad5-E4-5/11F穿梭载体进行连接，获得的阳性克隆为表达eGFP及TRAIL的腺病毒pshuttle Ad5-E4-5/11F穿梭载体，命名为pshuttleAd5-CMVeGFP/TRAIL-E4-5/11F。
7、制备纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL
用XhoI线性化的pshuttle Ad5-CMVeGFP/TRAIL-E4-5/11F的穿梭载体与SwaI线性化的pHBD24-Arresten/SwaI腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coli BJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体命名为pHBD24-5/11F.Arresten/TRAIL；采用磷酸钙法将PacI线性化的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体pHBD24-5/11F.Arresten/TRAIL转染HEK 293细胞系，经过7～10天后，离心收获病毒原液，经2～3轮的病毒扩增，通过两次氯化铯密度梯度超速离心纯化，获得纯化的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL，-80℃冰箱内保存。
实施例2
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Endostatin/TRAIL如下：
实施例1中的第一外源基因Arresten用Endostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Endostatin/TRAIL。
其构建方法与实施例1相同。
实施例3
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.IL-24/TRAIL如下：
实施例1中的第一外源基因Arresten用IL-24替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.IL-24/TRAIL。
其构建方法与实施例1相同。
实施例4
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Tumostatin/TRAIL如下：
实施例1中的第一外源基因Arresten用Tumostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Tumostatin/TRAIL。
其构建方法与实施例1相同。
实施例5
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Canstatin/TRAIL如下：
实施例1中的第一外源基因Arresten用Canstatin替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Canstatin/TRAIL。
其构建方法与实施例1相同。
实施例6
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.IFNα/TRAIL如下：
实施例1中的第一外源基因Arresten用IFNα替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.IFNα/TRAIL。
其构建方法与实施例1相同。
实施例7
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.IL-12/TRAIL如下：
实施例1中的第一外源基因Arresten用IL-12替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.IL-12/TRAIL。
其构建方法与实施例1相同。
实施例8
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/Endostatin如下：
实施例1中的第二外源基因TRAIL用Endostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/Endostatin。
其构建方法与实施例1相同。
实施例9
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/Tumostatin如下：
实施例1中的第二外源基因TRAIL用Tumostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/Tumostatin。
其构建方法与实施例1相同。
实施例10
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/Canstatin如下：
实施例1中的第二外源基因TRAIL用Canstatin替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/Canstatin。
其构建方法与实施例1相同。
实施例11
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/IL-24如下：
实施例1中的第二外源基因TRAIL用IL-24替换。元件的其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/IL-24。
其构建方法与实施例1相同。
实施例12
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/IL-12如下：
实施例1中的第二外源基因TRAIL用IL-12替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/IL-12。
其构建方法与实施例1相同。
实施例13
本实施例纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/IFNα如下：
实施例1中的第二外源基因TRAIL用IFNα替换。其它结构与实施例1相同，构成纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/IFNα。
其构建方法与实施例1相同。
实施例14
以上的实施例1～13，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的5/11F序列用5/3F序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例15
以上的实施例1～13，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的5/11F序列用5/6F序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例16
以上的实施例1～13，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的5/11F序列用5/30F序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例17
以上的实施例1～13，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的5/11F序列用5/35F序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例18
有效成分纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗恶性脑胶质瘤、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机固体或液体赋形剂混合，在制剂中，活性成分的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体含量为95％。
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL(以下简称HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL)进行了药效试验，各种试验情况如下：
1、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对恶性脑胶质瘤细胞生长抑制作用
采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对恶性脑胶质瘤细胞系U87增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的恶性脑胶质瘤细胞系U87，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×103。将10MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染恶性脑胶质瘤细胞系U87，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液(PBS)处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对恶性脑胶质瘤细胞系U87生长的抑制作用。每24小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温反应10分钟。用酶标仪在570nm波长处测吸光值，所测结果用统计产品与服务解决方案软件(SPSS)13.0的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图2。由图2可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对恶性脑胶质瘤细胞系U87增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.01)。
2、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肝癌细胞生长抑制作用
采用MTT比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肝癌细胞系HepG2增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的肝癌细胞系HepG2，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×103，将10MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染肝癌细胞系HepG2，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对肝癌细胞系HepG2生长的抑制作用。每24小时后加入5g/L的MTT20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，置于水平摇床上，室温反应10分钟。用酶标仪在570nm波长处测吸光值，所测结果用SPSS 13.0软件的One WayANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图3。由图3可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肝癌细胞系HepG2增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.01)。
3、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对胃癌细胞生长抑制作用
采用MTT比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对胃癌细胞系BGC-823增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的胃癌细胞系BGC-823，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×103，将10MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染胃癌细胞系BGC-823，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对胃癌细胞系BGC-823生长的抑制作用。每24小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，置于水平摇床上，室温反应10分钟。用酶标仪在570nm波长处测吸光值，所测结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图4。由图4可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对胃癌细胞系BGC-823增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.05)。
4、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肺癌细胞生长抑制作用
采用MTT比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肺癌细胞系A549增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的肺癌细胞系A549，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×103。将5MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染肺癌细胞系A549，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对肺癌细胞系A549生长的抑制作用。每24小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。用酶标仪570nm波长处测吸光值，所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图5。由图5可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对肺癌细胞系A549增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.01)。
5、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对结肠癌细胞生长抑制作用
采用MTT比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对结肠癌细胞系Caco-2增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的结肠癌细胞系Caco-2，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×103。5MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染结肠癌细胞系Caco-2，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对结肠癌细胞系Caco-2生长的抑制作用。每24小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。用酶标仪570nm波长处测吸光值，所得结果用SPSS 13.0软件的One WayANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图6。由图6可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对结肠癌细胞系Caco-2增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.05)。
6、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对乳腺癌细胞生长抑制作用
采用MTT比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×03。将10MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长的抑制作用。培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，置于水平摇床上，室温反应10分钟。用酶标仪570nm波长处测吸光值，所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图7。由图7可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.01)。
7、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对黑色素瘤细胞的生长抑制作用
采用MTT比色法检测HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc增殖的影响，具体操作如下：
取对数生长期的黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc，用质量分数为0.1％的胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×103。将10MOI的HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL病毒载体及对照病毒感染黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在1～4天检测以上病毒载体对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc生长的抑制作用。培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，置于水平摇床上，室温反应10分钟。用酶标仪570nm波长处测吸光值，所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图8。由图8可见，HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc增殖具有明显的抑制作用(*P＜0.01)。
8、采用HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL针对建立的脑胶质瘤动物模型进行药效实验
采用U87细胞，取对数生长期细胞，经胰酶消化，离心后，无血清、无双抗、无谷氨酰胺的DMEM培养液悬浮，制备7.5×106/mL的细胞悬液。选用6周龄BALB/C雌性裸鼠，裸鼠用乙醚吸入麻醉，每只右后肢上部皮下注射200μl的7.5×106/mL的细胞悬液，U87MG细胞注射量为2×106个细胞，在细胞接种3天后均可见肿块近似大小的肿瘤生长。接种一周后，肿瘤平均体积达到70～100mm3时，建立脑胶质瘤动物模型，注射HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL进行观测对脑胶质瘤生长抑制效果。
裸鼠模型随机分为磷酸盐缓冲液空白组、Ad5-eGFP对照组、HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL实验组，每组7只，空白组每只裸鼠注射50μl磷酸盐缓冲液，对照组和实验组每只裸鼠均注射1×1010PFU的腺病毒试验品，每两天重复注射1次，共4次，每次剂量均为1×1010PFU。开始治疗后每两天测量肿瘤体积1次，统计体积变化趋势并绘制肿瘤生长曲线，测量4周肿瘤体积。并用统计软件SPSS 13.0中的Oneway-ANOVA进行显著性差异分析。实验结果见图9。
由图9可见，实验组与空白组、对照组相比，实验组HBD24-5/11F.Arresten/TRAIL可以明显抑制实验模型中脑胶质瘤细胞的生长速度，具有明显的抑制脑胶质瘤生长效果(*P＜0.05)。
Claims (9)
1.一种纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体，在人腺病毒5型基因组922bp-947bp之间有24bp碱基的缺失，在人腺病毒5型基因组28183bp～29906bp之间插入一个表达第一外源基因的表达元件，在人腺病毒载体5型基因组中31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入一个纤维蛋白嵌合体，其特征在于：在人腺病毒载体5型基因组中32021bp与32022bp之间插入含有双表达第二外源基因与eGFP的表达元件；所说的第一外源基因是Arresten、IL-24、Canstatin、Tumostatin、IFNα、IL-12中的任意一种；上述的纤维蛋白嵌合体为5/3F、5/6F、5/30F、5/11F、5/35F序列中的任意一个；上述的第二外源基因是TRAIL、IL-24、Canstatin、Tumostatin、IFNα、IL-12中的任意一种。
2.一种权利要求1纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成：
（1）构建pAd5E1A24bp缺失的穿梭载体
通过设计两对引物，以人类腺病毒5型Ad5基因组质粒为PCR模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段，P1-P4为两对引物的序列：
P1:ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT；
P2:TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG；
P3:CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT；
P4:TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG；
聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、60秒，72℃、2分钟，30个循环；重叠聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳后回收片段；将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接；连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl2×T4连接酶缓冲液，0.5μl pGEMT-T easy载体，0.5μl T4连接酶，2μl三蒸水，25℃连接1小时，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中；挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆；将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F；将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳纯化后与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体进行连接；连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl2×T4连接酶缓冲液，0.5μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，2μl三蒸水；连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24shuttle，此载体为获得的pAd5E1A24bp缺失的穿梭载体；
（2）构建pHBD24腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的pHBD24shuttle穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3:1，共转化感受态细胞E.Coli BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA；经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为Ad5E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架，命名为pHBD24；
（3）构建pHBDE3-第一外源基因的穿梭载体
通过聚合酶链式反应方法扩增位于Ad5E3区12.5k3’端上游2.0kb的片段，基因片段分别含有PacI与SalI-SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E3-5’；通过聚合酶链式反应方法扩增位于Ad5E3区E314.7k5’端下游2.0kb的片段，基因片段分别含有SwaI-NotI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E3-5’载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E3，命名为pHBDE3；采用聚合酶链式反应扩增第一外源基因，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态DH5α，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/第一外源基因；在pHBDE3载体的上下游两个基因片段之间通过SalI与NotI插入第一外源基因表达元件；得到的载体即为表达第一外源基因的腺病毒E3穿梭载体，命名为pHBDE3-第一外源基因的穿梭载体；
（4）构建pHBDE3-第一外源基因/SwaI条件复制型腺病毒载体骨架
用PacI线性化的表达第一外源基因shuttle的穿梭载体与SwaI线性化的pHBD24腺病毒载体骨架按摩尔比3：1共转化E.coli BJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体称为pHBD24-第一外源基因/SwaI；
（5）构建pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；聚合酶链式反应扩增位于Ad5E4区3’端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，得到的载体称为pshuttle Ad5E4-3′；采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3’端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3’载体相应的酶切位点中，获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber；合成Ad5的Tail以及纤维蛋白嵌合体的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位点，在纤维蛋白嵌合体的Knob 3’端引入SpeI位点，通过NdeI和SpeI双酶切，将此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber载体的相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体；
（6）构建表达eGFP及第二外源基因的穿梭载体pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMT easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40，将miniCMV-SV40片段从pGEMT/miniCMV-SV40上经ClaI和NotI双酶切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40；采用聚合酶链式反应方法扩增第二外源基因，扩增的产物经电泳纯化后与pGEMT easy载体相连接，经酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pGEMT/第二外源基因，将第二外源基因片段从pGEMT/第二外源基因上经XhoI和XbaI双酶切下来，用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40进行连接；连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达eGFP及第二外源基因的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；eGFP及第二外源基因的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；将pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因经BamHI及SfuI双酶切末端补平后与经SwaI酶切的腺病毒pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体进行连接，获得的阳性克隆为表达eGFP及第二外源基因的腺病毒pshuttle Ad5-E4-纤维蛋白嵌合体穿梭载体，命名为pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体；
（7）制备纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒HBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因
用XhoI线性化的pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-纤维蛋白嵌合体的穿梭载体与SwaI线性化的pHBD24-第一外源基因/SwaI腺病毒载体骨架按摩尔比3：1共转化E.coli BJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体命名为pHBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因；采用磷酸钙法将PacI线性化的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体pHBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因的转染HEK293细胞系，经过7～10天后，离心收获病毒原液，经2～3轮的病毒扩增，通过两次氯化铯密度梯度超速离心纯化，获得纯化的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶 瘤腺病毒HBD24-纤维蛋白嵌合体.第一外源基因/第二外源基因，-80℃冰箱内保存。
3.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗恶性脑胶质瘤药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
4.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗肝癌药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
5.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗胃癌药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
6.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗肺癌药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
7.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗结肠癌药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
8.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗乳腺癌药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
9.权利要求1所述的纤维蛋白修饰表达两个外源基因的溶瘤腺病毒载体在制备治疗黑色素瘤药物中的用途，所述载体中的第一外源基因是Arresten，所述载体中的纤维蛋白嵌合体为5/11F，所述载体中的第二外源基因是TRAIL。
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| 王东阳，刘世海，李星，赵俊丽，陈皓，冯飞雪，王丽娴，夏海滨."携带eGFP及人endostatin-K5的嵌合腺病毒载体Ad5/11的构建及其体外实验研究".《细胞与分子免疫学杂志》.2011,第27卷(第2期),第143页-第145页，第149页. |
| 王东阳,刘世海,李星,赵俊丽,陈皓,冯飞雪,王丽娴,夏海滨."携带eGFP及人endostatin-K5的嵌合腺病毒载体Ad5/11的构建及其体外实验研究".《细胞与分子免疫学杂志》.2011,第27卷(第2期),第143页-第145页,第149页. * |
| 齐宗利，王东阳，边晔，赵俊丽，孙晓聪，夏海滨."RGD修饰携带tumstatin及eGFP新型腺病毒载体的构建及其表达研究".《解放军医学杂志》.2010,第35卷(第10期),第1215页-第1218页. |
| 齐宗利,王东阳,边晔,赵俊丽,孙晓聪,夏海滨."RGD修饰携带tumstatin及eGFP新型腺病毒载体的构建及其表达研究".《解放军医学杂志》.2010,第35卷(第10期),第1215页-第1218页. * |
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