CN114146178A - Pycr1基因作为靶标在制备食管癌产品中的用途及相关产品 - Google Patents

Pycr1基因作为靶标在制备食管癌产品中的用途及相关产品 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及PYCR1基因作为靶标在制备食管癌治疗和/或诊断的产品中的用途。本发明采用RNAi方法下调PYCR1基因的表达后可显著抑制食管癌细胞的增殖、生长、迁移和浸润，促进癌细胞的凋亡，可以有效地控制食管癌的生长进程。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制食管癌细胞的增殖速率、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞克隆、抑制食管癌细胞侵袭、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌生长，从而用于食管癌的治疗和检测，具有广泛应用前景。

Description

PYCR1基因作为靶标在制备食管癌产品中的用途及相关产品
技术领域
本发明属于生物医药研究领域，涉及人PYCR1基因作为靶标在制备食管癌产品中的用途及相关产品。
背景技术
食管癌是世界上第七大最常见的癌症类型，癌症相关死亡率也高居第六位。食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌的主要组织病理学亚型，在我国发病率较高2。在过去的20年里，临床诊断和治疗策略已经有所改善，但ESCC患者由于复发、广泛侵袭和转移，总体5年生存率仍不理想。此外， ESCC复发和转移的综合分子机制仍不清楚。
脯氨酸是细胞微环境中含量最丰富的氨基酸之一，其代谢和合成是肿瘤细胞所必需的。吡咯啉-5-羟酸还原酶(Pyrroline-5-carboxylate Reductase，PYCR)是催化脯氨酸合成的最后一步，表明PYCR可能参与了癌症的发展。已鉴定出三种人PYCR 亚型，即PYCR1、PYCR2和PYCRL。DNA芯片数据分析已经报道了PYCR1信使RNA(mRNA)在多种癌症中过表达，如乳腺癌、肺癌和前列腺癌，但没有PYCR2 和PYCRL。PYCR1的异常表达在肿瘤的发生发展中起着重要作用。有报道称， PYCR1敲减可抑制前列腺癌细胞的增殖和集落形成，而PYCR1上调可促进非小细胞肺癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。另一项研究通过共表达网络分析显示其对乳腺癌有抗凋亡作用。目前，PYCR1在食管癌中发挥的作用尚不可知。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供人PYCR1基因在食管癌中的用途及相关产品。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供人PYCR1基因作为靶标在制备食管癌治疗的药物或者在制备食管癌的诊断产品中的用途。
所述人PYCR1基因作为靶标在制备食管癌治疗药物具体是指：将PYCR1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人PYCR1基因表达的药物作为食管癌治疗备选药物。如本发明所述的PYCR1基因小分子干扰RNA (siRNA)即是以人PYCR1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制食管癌细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将PYCR1基因作为作用对象。
所述食管癌治疗药物为能够特异性抑制PYCR1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制PYCR1蛋白的表达或活性的分子，从而降低食管癌细胞中PYCR1基因的表达水平，达到抑制食管癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过PYCR1基因制备获得的食管癌治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。
所述食管癌治疗药物的施用量为足够降低人PYCR1基因的转录或翻译，或者足够降低人PYCR1蛋白的表达或活性的剂量，以使人PYCR1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
采用前述食管癌治疗药物治疗食管癌的方法，主要是通过降低人PYCR1基因的表达水平抑制食管癌细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人PYCR1基因表达水平的物质给药于患者。
在一种实施方式中，所述PYCR1基因的靶标序列如SEQ ID NO：1～3所示，具体为：
SEQ ID NO.1：5’-GGAAGAGGACCTGATTGATGC-3’；
SEQ ID NO.2：5’-GCCCACAAGATAATGGCTAGC-3’；
SEQ ID NO.3：5’-GAAGAAGCTGTCAGCGTTTCG-3’。
本发明的第二方面，提供PYCR1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
治疗食管癌；
抑制食管癌生长；
抑制食管癌细胞的增殖能力或增殖速率；
抑制食管癌细胞克隆；
促进食管癌细胞凋亡；
抑制食管癌细胞迁移；
抑制食管癌细胞侵袭转移。
所述产品必然包括PYCR1抑制剂，并以PYCR1抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为PYCR1抑制剂，亦可包含其它可起到前述功用的分子。
亦即，PYCR1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
所述PYCR1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。如本发明实施例列举的，所述PYCR1抑制剂可以为降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链RNA或shRNA。
本发明的第三方面，提供了一种治疗食管癌的方法，为向对象施用PYCR1抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的食管癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述食管癌细胞可以为离体食管癌细胞。
所述对象可以是罹患食管癌的患者或者期待治疗的食管癌的个体。或者所述对象为食管癌患者或者期待治疗食管癌的个体的离体食管癌细胞。
所述PYCR1抑制剂可以在接受食管癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明第四方面公开了一种降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。
其中，所述双链RNA中含有能够与PYCR1基因杂交的核苷酸序列；
所述shRNA中含有能够与PYCR1基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PYCR1基因中的靶序列基本相同。
所述PYCR1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默PYCR1基因表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的PYCR1基因中的片段。
进一步的，所述双链RNA的靶序列如SEQ ID NO：1～3所示，具体如前所示。更进一步的，所述双链RNA第一链的序列如SEQ ID NO：4～6所示，具体为：
SEQ ID NO.4：5’-GGAAGAGGACCUGAUUGAUGC-3’；
SEQ ID NO.5：5’-GCCCACAAGAUAAUGGCUAGC-3’；
SEQ ID NO.6：5’-GAAGAAGCUGUCAGCGUUUCG-3’。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。
SEQ ID NO：4～6为以SEQ ID NO:1～3所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人PYCR1基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默食管癌细胞中内源PYCR1基因表达的作用。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PYCR1基因中的靶序列基本相同。
进一步的，所述shRNA的靶序列如SEQ ID NO：1～3所示。
所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默食管癌细胞中内源PYCR1基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。本发明茎环结构选择CUCGAG。
更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO：7～9所示，具体为：
SEQ ID NO.7：
5’-GGAAGAGGACCUGAUUGAUGCCUCGAGGCAUCAAUCAGGUCCUCUUCC-3’；
SEQ ID NO.8：
5’-GCCCACAAGAUAAUGGCUAGCCUCGAGGCUAGCCAUUAUCUUGUGGGC-3’；
SEQ ID NO.9：
5’-GAAGAAGCUGUCAGCGUUUCGCUCGAGCGAAACGCUGACAGCUUCUUC-3’。
其中，SEQ ID NO.7～9中，下划线部分代表颈环结构。
进一步的，所述PYCR1基因来源于人。
本发明第五方面，公开了一种PYCR1基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
所述的PYCR1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人PYCR1基因shRNA 的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步的，所述PYCR1基因干扰核酸构建体为PYCR1基因干扰慢病毒载体。
本发明公开的PYCR1基因干扰慢病毒载体是将编码前述PYCR1基因shRNA 的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述PYCR1 基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染食管癌细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默PYCR1基因的表达。
进一步的，所述PYCR1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码食管癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、 pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、 pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、 pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、GV493-gcGFP、pGCSIL-GFP 或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以GV493-gcGFP为载体构建的人PYCR1基因干扰慢病毒载体，命名为GV493-gcGFP-PYCR1-siRNA。
本发明的PYCR1基因siRNA可用于抑制食管癌细胞的增殖，进一步地可以用作治疗食管癌的药物或制剂。PYCR1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述 PYCR1基因siRNA。当用作治疗食管癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第六方面，公开了一种PYCR1基因干扰慢病毒，由前述PYCR1基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染食管癌细胞并产生针对PYCR1基因的小分子干扰RNA，从而抑制食管癌细胞的增殖。该PYCR1基因干扰慢病毒可用于制备治疗食管癌的药物。
本发明的第七方面，提供前述核酸分子，或前述PYCR1基因干扰核酸构建体，或前述PYCR1基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备治疗食管癌的药物，或用于制备降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的试剂盒。
所述治疗食管癌的药物的应用为食管癌的治疗提供了一种方法，具体为一种治疗对象体内食管癌的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
进一步的，所述药物用于治疗对象体内食管癌时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述食管癌的生长、增殖、迁移和侵袭转移被抑制，所述食管癌的凋亡被促进。进一步的，所述食管癌的生长、增殖、迁移和侵袭转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制，所述食管癌的凋亡被促进至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、95％或99％。
所述方法的对象可以为人。
本发明的第八方面，提供一种用于治疗食管癌的组合物，其有效物质含有：
前述的核酸分子和/或前述PYCR1基因干扰核酸构建体；和/或前述PYCR1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述组合物可以为药物组合物。
当所述组合物用于治疗对象体内食管癌时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述食管癌的生长、增殖、迁移和侵袭转移被抑制，所述食管癌的凋亡被促进。进一步的，所述食管癌的生长、增殖、迁移和侵袭转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制，所述食管癌的凋亡被促进至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、95％或99％。
所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本发明的第九方面提供PYCR1基因作为靶标在食管癌药物筛选中的应用，所述PYCR1作为靶标用于筛选抑制或减缓食管癌细胞的增殖、生长、迁移或侵袭转移的药物，或用于筛选促进食管癌细胞凋亡的药物。
综上所述，本发明设计了针对人PYCR1基因的RNAi靶点序列，构建相应的 PYCR1RNAi载体，其中RNAi载体GV493-gcGFP-PYCR1-siRNA能够显著下调 PYCR1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv) 作为基因操作工具携带RNAi载体GV493-gcGFP-PYCR1-siRNA能够靶向地将针对 PYCR1基因的RNAi序列高效导入食管癌KYSE-150细胞，降低PYCR1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和侵袭转移的能力。因此慢病毒介导的PYCR1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究发现，采用RNAi方法下调人PYCR1基因的表达后可有效地抑制食管癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，可以有效地控制食管癌的生长进程。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制食管癌细胞的增殖能力、抑制食管癌细胞克隆、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞侵袭转移，从而治疗食管癌，为食管癌治疗开辟新的方向。
附图说明
图1.RT-PCR检测KYSE-150细胞(图1A)和TE-1细胞(图1B)mRNA水平靶基因消减效率；其中，纵坐标表示相对内参ACTB的相对mRNA水平。
图2.Western Blot检测KYSE-150细胞(图2A)和TE-1细胞(图2B)靶点降低PYCR1基因蛋白水平表达情况。
图3.Celigo细胞计数法测定PYCR1基因对KYSE-150细胞(图3A)和TE-1 细胞(图3B)增殖影响(上图为Celigo连续5天记录细胞图片，下图为shPYCR1 组与shCtrl对照组细胞数目随时间变化的曲线)；其中，图3A上图横向从左至右依次标示为第一天、第二天、第三天、第四天、第五天，纵向从下至上依次为shPYCR1、shCtrl。
图4.MTT实验检测PYCR1基因对KYSE-150细胞(图4A)和TE-1细胞(图 4B)增殖的影响；其中，图4A上图横向从左至右依次标示为第一天、第二天、第三天、第四天、第五天，纵向从下至上依次为shPYCR1、shCtrl。
图5.克隆形成试验检测侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力。相比对照组，shPYCR1组细胞克隆数明显减少(P<0.05)。其中图5A为KYSE-150 细胞，图5B为TE-1细胞。
图6.Casepase3/7试验检测PYCR1基因对KYSE-150和TE-1细胞凋亡水平的影响。shRNA慢病毒分别感染KYSE-150和TE-1细胞，培养3天后，shPYCR1组与对照组的Caspase3/7活性对比。其中图6A为KYSE-150细胞，图6B为TE-1细胞。
图7.Celigo划痕试验检测PYCR1基因对KYSE-150和TE-1细胞迁移能力的影响。其中图7A为KYSE-150细胞中shCtrl组和shPYCR1组在0，4，8小时的扫板图，图7B为TE-1细胞中shCtrl组和shPYCR1组在0，3，6小时的扫板图。图 7C和7D分别为KYSE-150细胞和TE-1细胞中shCtrl组和shPYCR1组迁移率统计图(P＜0.05)。
图8.Transwell试验检测PYCR1基因对KYSE-150和TE-1细胞转移能力的影响(图8A和图8B分别显示KYSE-150细胞和TE-1细胞中显微镜下shCtrl组和shPYCR1组各1个重复孔的9张200倍照片。图8C和图8D分别为KYSE-150 细胞和TE-1细胞在数据统计时3个重复孔各9张照片的实验数据，其中左图代表transwell小室转移细胞数对比，右图代表transwell小室转移细胞数相比shCtrl 的变化值)。
图9.侵袭小室试验检测PYCR1基因对KYSE-150和TE-1细胞侵袭转移能力的影响(图9A和9B分别显示KYSE-150细胞和TE-1细胞中显微镜下照片仅展示各组1个重复孔的9张200倍照片。图9C和图9D分别为KYSE-150和TE-1细胞中数据统计时3个重复孔各9张照片的实验数据)。
具体实施方式
本发明的发明人经过广泛而深入的研究发现，在食管癌肿瘤组织中， PYCR1基因显著高表达；发明人发现，采用RNAi方法下调人PYCR1基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，可以有效地控制肿瘤的生长进程，这一研究成果表明PYCR1基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对 PYCR1基因的siRNA，筛选出了可有效抑制PYCR1的表达进而抑制人食管癌 KYSE-150增殖、生长、迁移和侵袭转移的siRNA，在此基础上完成了本发明。
本发明从细胞功能学角度出发证实PYCR1基因在食管癌发生中的作用。通过构建目的基因shRNA慢病毒后转染食管癌细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组食管癌细胞系内mRNA及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡等检测，结果显示shRNA组与对照组对比，shRNA组食管癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高。
PYCR1抑制剂
指对于PYCR1具有抑制效果的分子。对于PYCR1具有抑制效果包括但不限于：抑制PYCR1的表达或活性。
抑制PYCR1活性是指使PYCR1活力下降。优选地，相比抑制前，PYCR1 活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制PYCR1表达具体的可以是抑制PYCR1基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使PYCR1的基因不转录，或降低PYCR1的基因的转录活性，或者使 PYCR1的基因不翻译，或降低PYCR1的基因的翻译水平。
本领域技术人员可以使用常规方法对PYCR1的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。
PYCR1的基因表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，PYCR1基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地PYCR1 基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
制备治疗食管癌的药物
可以利用降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的核酸分子；和/或，PYCR1基因干扰核酸构建体；和/或，PYCR1基因干扰慢病毒，作为有效成分，制备治疗食管癌的药物。通常，所述药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1针对人PYCR1基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人PYCR1基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取PYCR1(NM_001282281)基因信息；设计针对PYCR1基因的有效的siRNA靶点。根据RNA干扰序列设计原则，以CCT7基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点(表1-1)。
表1-1靶向于人PYCR1基因的siRNA靶点序列
Figure BDA0003322454970000111
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo 序列(表1-2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV493-gcGFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表1-2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
Figure BDA0003322454970000121
其中，编号一列，1-1和1-2分别对应靶点1，2-1和2-2分别对应靶点2，3-1 和3-2分别对应靶点3。
通过T4 DNA 连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-3所示，37℃，反应1 h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表1-4所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56 页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl 作为模板；再以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物，上游引物序列：5’-GGAAAGAATAGTAGACATAATA-3’(SEQ ID NO：10)；下游引物序列：5’-GAGCCGACACGGGTTAGGATCC-3’(SEQ ID NO：11)，进行PCR 鉴定实验(PCR反应体系如表1-5，反应条件如表1-6)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：1的表达 RNAi的载体，命名为GV493-gcGFP-PYCR1-siRNA。
构建GV493-gcGFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：12)。构建GV493-gcGFP-Scr-siRNA 阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表1-3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同GV493-gcGFP-PYCR1-siRNA。
表1-3 GV439-gcGFP质粒酶切反应体系
试剂 体积(μl)
GV439-gcGFP质粒(1μg/μl) 2.0
10×buffer 5.0
Age I(10U/μl) 1.0
EcoR I(10U/μl) 1.0
dd H<sub>2</sub>O 41.0
Total 50.0
表1-4载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系
Figure BDA0003322454970000131
表1-5 PCR反应体系
试剂 体积(μl)
10×buffer 2.0
dNTPs(2.5mM) 0.8
上游引物 0.4
下游引物 0.4
Taq聚合酶 0.2
模板 1.0
ddH<sub>2</sub>O 15.2
Total 20.0
表1-6 PCR反应体系程序设定
Figure BDA0003322454970000132
Figure BDA0003322454970000141
4.包装PYCR1-siRNA慢病毒
用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒，按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取RNAi质粒GV439-gcGFP-PYCR1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板，37℃， 5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM) 20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS 溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20 离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心 10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3) 4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min，离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80℃保存。
对照慢病毒的包装过程同PYCR1-siRNA慢病毒，仅将以 GV493-gcGFP-PYCR1-siRNA载体替换为GV493-gcGFP-Scr-siRNA载体。
实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测基因的沉默效率
处于对数生长期的人食管癌KYSE-150细胞和人食管癌TE-1细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数值(MOI，A549：10)，实验组加入适宜量的实施例1制备的PYCR1-siRNA慢病毒，对照组加入对照慢病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表2-1，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。PYCR1基因的引物如下：上游引物5’-GGCTGCCCACAAGATAATGGC-3’(SEQ ID NO：13) 和下游引物5’-CAATGGAGCTGATGGTGACGC-3’(SEQ ID NO：14)。以管家基因ACTB为内参，引物序列如下：上游引物5’-GCGTGACATTAAGGAGAAGC-3’ (SEQ ID NO：15)和下游引物5’-CCACGTCACACTTCATGATGG-3’(SEQ ID NO：16)。按表2-2中的比例配置反应体系。
表2-1逆转录反应体系
试剂 体积(μl)
5×RT buffer 4.0
10mM dNTPs 2.0
RNasin 0.4
M-MLV-RTase 1.0
RNase-Free 2.6
Total 10.0
表2-2 Real-time PCR反应体系
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 6.0
引物MIX(5μM)： 0.3
cDNA 0.6
ddH<sub>2</sub>O 5.1
Total 12.0
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，30s；之后每一步变性95℃， 5s；退火延伸60℃，30s；共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性15s，然后冷却至60℃，使DNA 双链充分结合。从60℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了PYCR1 mRNA的表达丰度。实验结果如图1和表2-3所示，表明在人食管癌 KYSE-150和TE-1细胞中PYCR1 mRNA的表达水平分别下调了90.2％和93.6％％。
表2-3 RT-PCR检测基因沉默效率结果
Figure BDA0003322454970000161
实施例3 Western Blotting法检测基因的沉默效率
1.细胞总蛋白抽提
(1)制备病毒侵染细胞：制备处于对数生长期的人食管癌目的细胞KYSE-150和TE-1分别进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6 孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，A549：10)，实验组加入适宜量的实施例1制备的针对PYCR1干扰靶点的RNAi病毒 (PYCR1-siRNA慢病毒)，对照组加入对照慢病毒，培养24h后更换培养基，侵染5天。
然后，接收细胞样品，PBS洗涤两次。取适当量的RIPA裂解液，使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。(使用RIPA裂解液，说明书链接：http://www.beyotime.com/ripa-lysis-bufferm.htm)。
(2)加入适当量的RIPA裂解液，冰上裂解10-15min。细胞刮刮下细胞转移入新的EP管中，然后超声破碎细胞(40W共20次，每次1s，间隔2s)。
(3)4℃、12000g，离心15min，取上清BCA法测定蛋白浓度(BCA Protein Assay Kit说明书链接：http://www.beyotime.com/p0010s.htm)。
(4)加入新的裂解液将每个样品蛋白浓度调为一致，一般为2μg/μL。然后加入1/5体积的6X lodding buffer混匀，100℃金属浴煮10min，短暂离心后 -80℃保存备用。
2.SDS-PAGE
(1)制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如表3-1、表 3-2、表3-3所示：
表3-1 SDS-PAGE分离胶(8mL体系)
分离胶(8mL体系) 8％ 9％ 10％ 12％ 13％ 15％
H<sub>2</sub>O 3.7 3.4 3.1 2.6 2.3 1.8
30％PAGE 2.1 2.4 2.7 3.2 3.5 4
1.5mol/L Tris(pH 8.8) 2 2 2 2 2 2
10％SDS 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
10％APS 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
TEMED 0.005 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004
表3-2 SDS-PAGE分离胶(10mL体系)
分离胶(10mL体系) 8％ 9％ 10％ 12％ 13％ 15％
H2O 4.6 4.3 4 3.3 2.9 2.3
30％PAGE 2.7 3 3.3 4 4.4 5
1.5mol/L Tris(pH 8.8) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
10％SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
10％APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
TEMED 0.006 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004
表3-3 SDS-PAGE浓缩胶
浓缩胶(5％) 3mL 4mL 5mL
H<sub>2</sub>O 2.1 2.7 3.4
30％PAGE 0.5 0.67 0.83
1.0mol/L Tris(pH6.8) 0.38 0.5 0.63
10％SDS 0.03 0.04 0.05
10％APS 0.03 0.04 0.05
TEMED 0.003 0.004 0.005
(2)上样：胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。
(3)电泳：浓缩胶80mA，20min；分离胶120mA，1h。
3.免疫印迹(湿转)
电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。
4.抗体杂交：
(1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或 4℃过夜。
(2)一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，并用TBST洗膜4次，每次8min。
(3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜1.5h，并用TBST 洗膜4次，每次8min。
5.X光显影：(采用CST公司20X
Figure BDA0003322454970000181
Reagent and 20X Peroxide#7003试剂盒，说明书链接：
https://www.cst-c.com.cn/products/wb-ip-reagents/20x-lumiglo-reagent-and-20x-peroxi de/7003？site-search-type＝Products)
(1)将试剂盒中A液和B液按1:1比例混合颠倒混匀，放置数分钟后可使用。
(2)将膜取出，吸水纸擦干，平铺入暗盒，滴加适量混匀的ECL发光液，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1s-数min(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。
(3)取出X光片，放入显影液中，出现条带后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min。
(4)取出X光片，晾干，分析。
结果如图2所示(其中图2A为KYSE-150细胞，图2B为TE-1细胞)，Western Blot实验表明靶点对PYCR1基因的内源表达有敲减作用，因而是有效靶点。
实施例4检测侵染了PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力(Celigo 实验)
参照实施例3中第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞：制备处于对数生长期的人食管癌KYSE-150细胞和TE-1细胞分别进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数 (MOI，A549：10)，实验组加入适宜量的实施例1制备的PYCR1-siRNA慢病毒，对照组加入对照慢病毒，培养24h后更换培养基，侵染5天。
收集处于对数生长期的各组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为1500个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Celigo仪器(Nexcelom) 检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出 5天的细胞增殖曲线。
结果如图3所示。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤细胞在体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，表明PYCR1基因沉默导致人食管癌KYSE-150和TE-1细胞的增殖能力均被抑制。
实施例5侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞增殖水平的检测(MTT检测)
按实施例3中的第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞。
将处于对数生长期的各组细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)，每组3-5重复，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96孔板)。统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现Con组细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养。从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入 20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液。4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μL DMSO溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。
结果如图4显示。相比shCtrl组，shPYCR1组细胞增殖显著减缓(P<0.05)，其中图4A为KYSE-150细胞，图4B为TE-1细胞。
实施例6侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测(克隆形成实验)
参照实施例3中第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞：人食管癌KYSE-150 和TE-1细胞分别胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将实施例1制备的PYCR1-siRNA慢病毒按照侵染复数MOI，A549：10加入到培养板中，对照组加入对照慢病毒，感染12-24h 后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到80％。
将处于对数生长期的感染病毒后的各组细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中(800个细胞/孔)，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到12天，中途隔3天进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；实验终止时用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤细胞后， Giemsa染色，拍照。
结果如图5所示(图5右图纵坐标clone表示克隆数)，与对照干扰(shCtrl组) 相比，RNA干扰降低基因的表达(shPYCR1组)后，食管癌KYSE-150细胞(图 5A)和TE-1细胞(图5B)形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小；表明基因沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。平板克隆形成实验检测降低基因的表达后，肿瘤细胞的克隆形成能力下降。
实施例7侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞凋亡水平的检测(Caspase3/7检测)
按实施例3中第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞。
将各组人食管癌KYSE-150和TE-1细胞用胰酶消化后接种于96孔板中，在37℃下CO2培养箱培养细胞3天。将Caspase-Glo3/7缓冲液和Caspase-Glo3/7冻干粉置于 18-22℃(室温)环境下待温度与环境平衡。然后将10ml Caspase-Glo3/7缓冲液加入装有Caspase-Glo3/7底物的棕瓶中，涡旋或反复颠倒直至底物完全溶解，形成 Caspase-Glo反应液。细胞计数后，在室温中调整细胞悬液浓度至1×104细胞/孔，并将目的细胞(实验组：shPYCR1组细胞)与阴性对照细胞按照每孔100μl加入新的96孔板中，同时设置一组不含细胞的空对照组(只加入培养基100μl/孔)。然后每孔中加入100μl Caspase-Glo反应液，加样过程中注意更换枪头，严格避免交叉污染。将加有细胞的培养板置于摇板机上以300-500rpm的转速轻摇30分钟混匀。然后根据细胞状况18-22℃室温孵育0.5-3小时(以1-2小时为宜)。最后使用仪器测定信号强度。
结果如图6显示。相比对照组，shPYCR1组Caspase3/7活性增加，凋亡细胞显著增多(P<0.05)。其中图6A为KYSE-150细胞，图6B为TE-1细胞。
实施例8侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞迁移能力的检测(Celigo划痕试验)
按实施例3中的第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞。
将处于对数生长期的各组细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；根据细胞大小决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为50000cell/well)，以次日细胞达到90％以上汇合度为准。37℃、5％CO2培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔。第二天换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。使用无血清培养基轻轻漂洗2-3遍，加入低浓度血清培养基(如0.5％FBS)，0h拍照。37℃、5％CO2培养箱培养，在培养第4和8小时用Celigo扫板。最后用Celigo分析迁移面积。
本实施例试验中shCtrl组和PYCR1组分别做5个重复孔，用Celigo分析迁移面积，通过t检验来分析两组迁移率的差异。
如图7所示，其中图7A为KYSE-150细胞实验中shCtrl组和PYCR1组分别选1组代表性的重复孔在0、4、8小时的Celigo扫板图。图7B为TE-1细胞实验中shCtrl组和 PYCR1组分别选1组代表性的重复孔在0、3、6小时的Celigo扫板图。图7C和7D分别为KYSE-150细胞和TE-1细胞中shCtrl组和shPYCR1组迁移率统计图。试验结果显示，相比shCtrl组，shPYCR1组细胞划痕迁移率显著降低(P<0.05)。
实施例9侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞转移能力的检测(Transwell检测)
按实施例3中的第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞。
取出试剂盒，将所需数目的小室置于新的24孔板中，上室加100μL无血清培养基，37℃培养箱中放置1h。制备无血清细胞悬浮液，并计数，细胞数根据预实验调整，一般为105/孔(24孔板)。小心除去上室中培养基并加入100μL细胞悬液，下室内加入600μL 30％FBS培养基。37℃培养箱培养16h(根据预实验确定的实验时间)。倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，将小室置于4％多聚甲醛固定液中固定半小时。固定后，将小室捞出，用吸水纸吸干小室表面固定液，滴1-2滴染色液到膜的下表面染色转移细胞1-3min后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。显微镜拍照：每个Transwell小室，随机选取视野，拍100 倍照片4张，200倍照片9张。shCtrl和shPYCR1组分别做3个重复孔。以200倍的照片来计数，进行数据分析，比较实验组与对照组细胞转移能力的差异：计算各组转移细胞数(Migratory cells per field)，T-Test分析得到p值，判断是否有显著性差异。
如图8所示，图8A和图8B分别显示KYSE-150细胞和TE-1细胞中显微镜下shCtrl 组和shPYCR1组各1个重复孔的9张200倍照片。图8C和图8D分别为KYSE-150细胞和TE-1细胞在数据统计时3个重复孔各9张照片的实验数据，其中左图代表transwell 小室转移细胞数对比，右图代表transwell小室转移细胞数相比shCtrl的变化值。相比 shCtrl组，shPYCR1组Transwell转移率显著降低(P＜0.05)。
实施例10侵染PYCR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞侵袭转移能力的检测(侵袭小室检测实验)
按实施例3中的第1点(1)的方法制备病毒侵染细胞。
从冰箱-20℃中取出试剂盒，将所需数目的小室置于新的24孔板中，无菌操作台内放置使其恢复到室温。上、下小室各加500μL无血清培养基，37℃培养箱中放置2h使Matrigel基质层再水化。制备无血清细胞悬浮液，并计数，细胞数根据预实验调整，一般为105/孔(24孔板)。Matrigel基质层再水化完成后，将小室全部转移至新的孔板中，小心除去上室中培养基并加入200μL细胞悬液，下室内加入 750μL 30％FBS培养基。37℃培养箱培养一段时间(具体时间根据预实验调整)。倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非侵袭细胞，滴2-3 滴染色液到膜的下表面染色转移细胞3-5min后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。显微镜拍照：每个小室，随机选取视野，拍100倍照片4张，200倍照片9张。shCtrl 和shPYCR1组分别做3个重复孔。以200倍的照片来计数，进行数据分析，比较实验组与对照组细胞侵袭能力的差异：计算各组侵袭转移细胞数(Migratory cells perfield)，标准差T-Test分析得到p值，判断是否有显著性差异。
如图9所示，图9A和9B分别显示KYSE-150细胞和TE-1细胞中显微镜下照片仅展示各组1个重复孔的9张200倍照片。图9C和图9D分别为KYSE-150和TE-1细胞中数据统计时3个重复孔各9张照片的实验数据，其中左图为侵袭小室转移细胞数对比，右图为侵袭小室转移细胞数相比shCtrl的变化值对比。由图可知，相比shCtrl 组，shPYCR1组侵袭转移率降低(P＜0.05)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 兰州大学第二医院
<120> PYCR1基因作为靶标在制备食管癌产品中的用途及相关产品
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaagaggac ctgattgatg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcccacaaga taatggctag c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagaagctg tcagcgtttc g 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaagaggac cugauugaug c 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcccacaaga uaauggcuag c 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagaagcug ucagcguuuc g 21
<210> 7
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaagaggac cugauugaug ccucgaggca ucaaucaggu ccucuucc 48
<210> 8
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcccacaaga uaauggcuag ccucgaggcu agccauuauc uugugggc 48
<210> 9
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaagaagcug ucagcguuuc gcucgagcga aacgcugaca gcuucuuc 48
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaaagaata gtagacataa ta 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagccgacac gggttaggat cc 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggctgcccac aagataatgg c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caatggagct gatggtgacg c 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcgtgacatt aaggagaagc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccacgtcaca cttcatgatg g 21
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccggggaaga ggacctgatt gatgcctcga ggcatcaatc aggtcctctt cctttttg 58
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aattcaaaaa ggaagaggac ctgattgatg cctcgaggca tcaatcaggt cctcttcc 58
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccgggcccac aagataatgg ctagcctcga ggctagccat tatcttgtgg gctttttg 58
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aattcaaaaa gcccacaaga taatggctag cctcgaggct agccattatc ttgtgggc 58
<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccgggaagaa gctgtcagcg tttcgctcga gcgaaacgct gacagcttct tctttttg 58
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aattcaaaaa gaagaagctg tcagcgtttc gctcgagcga aacgctgaca gcttcttc 58

Claims (11)

1.PYCR1基因作为靶标在制备治疗食管癌的药物和/或在制备食管癌诊断产品中的用途。
2.PYCR1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
治疗食管癌；
抑制食管癌生长；
抑制食管癌细胞的增殖能力或增殖速率；
抑制食管癌细胞克隆；
促进食管癌细胞凋亡；
抑制食管癌细胞迁移；
抑制食管癌细胞侵袭转移。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述PYCR1抑制剂是指对PYCR1具有抑制效果的分子；
2)所述PYCR1抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一；
3)所述PYCR1抑制剂选自双链RNA、shRNA、抗体或小分子化合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO：1～3任一所示；
2)所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，所述第一链的序列如SEQ ID NO：4～6所示；
3)所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示。
5.一种降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：
a.双链RNA，所述双链RNA中含有能够与PYCR1基因杂交的核苷酸序列；或者，
b.shRNA，所述shRNA中含有能够与PYCR1基因杂交的核苷酸序列；
其中，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PYCR1基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PYCR1基因中的靶序列基本相同。
6.根据权利要求5所述的降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的核酸分子，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO：1～3任一所示；
2)所述双链RNA为siRNA，所述siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO：4～6所示；
3)所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示。
7.一种PYCR1基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求5或6所述的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
8.一种PYCR1基因干扰慢病毒，由权利要求7所述的干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
9.根据权利要求5或6所述的核酸分子，或权利要求7所述PYCR1基因干扰核酸构建体，或权利要求8所述的PYCR1基因干扰慢病毒的用途，其特征在于，用于制备治疗食管癌的药物，和/或用于制备降低食管癌细胞中PYCR1基因表达的试剂盒。
10.一种用于治疗食管癌的组合物，其特征在于，其包含：
权利要求5或6所述的核酸分子；和/或，权利要求7所述的PYCR1基因干扰核酸构建体；和/或，权利要求8所述的PYCR1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
11.PYCR1基因作为靶标在食管癌药物筛选中的应用，其特征在于，所述PYCR1作为靶标用于筛选抑制或减缓食管癌细胞的增殖、生长、迁移或侵袭转移的药物，或用于筛选促进食管癌细胞凋亡的药物。
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