CN105039342B - 能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用。本发明的抑制MAT2A基因表达的siRNA MAT2A‑1，其正义链如SEQ ID NO.2所示，反义链如SEQ ID NO.3所示；抑制MAT2A基因表达的siRNA MAT2A‑2，其正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示。根据抑制MAT2A基因表达的siRNA构建的抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体联合过表达MAT1A基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第256位‑1443位碱基所示)的慢病毒载体转染肝癌细胞成功的抑制了肝细胞癌血管生成、迁移和侵袭、肺转移，其可进一步应用于制备治疗肝癌疾病的药物，具有很高的理论和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，位居全国癌症发病率第二位，每年因肝癌死亡的人数约为35万。目前，手术切除和肝移植是治疗肝癌最有效的方法。但由于早期诊断率低、肝移植供体紧缺等原因，大部分患者失去了根治性手术的机会，患者5年生存率仅为10-20％。经动脉灌注化疗栓塞(Transarterialchemoembolization，TACE)是不能手术切除肝癌的主要治疗手段，可促进肿瘤缺血性坏死，抑制其生长，但栓塞难以彻底，术后的复发与转移始终是提高远期疗效的瓶颈；而传统的手术、放疗、化疗或中药等方法的治疗效果欠佳。因此，寻求新的治疗模式迫在眉睫，而基因治疗可能是从根本上解决这一难题的希望。
肝细胞癌的多种基因出现异常表达，其中MAT基因较为特别。MAT基因可分为MAT1A基因与MAT2A基因，编码唯一能催化合成S-腺苷蛋氨酸的酶——腺苷蛋氨酸转移酶(Methionine adenosyltransferase，MAT)。MAT有三种同工酶，分别是MAT Ⅰ、MATⅢ和MATⅡ，前两种是MAT1A(Methionine Adenosyltransferase 1A)基因编码的产物，后一种是MAT2A(Methionine Adenosyltransferase 2A)基因编码的产物。MAT1A基因主要在成人肝脏中表达，而MAT2A基因在除肝脏以外的人体组织器官中广泛表达。有趣的是，胎肝中主要表达的是MAT2A，在胎儿出生后逐步被MAT1A取代。在肝癌中MAT2A被诱导重新表达，MAT1A的表达则发生沉默，这种转变为肝癌细胞生长提供有利条件。国内外学者针对MAT基因已经做了多方面的研究，也取得可喜的成果。Cai等发现，恢复MAT1A表达的Huh-7细胞内SAMe的含量增加了52％，而DNA合成速率下降了20％，肿瘤细胞生长速度减缓了25％；再导入MAT2A反义RNA后，这些作用进一步增强。Li等构建过表达MAT1A的Huh-7稳定表达细胞株，发现SAMe升高将近3倍，细胞凋亡率升高超过2倍，生长受抑制；体内实验显示，过表达MAT1A的Huh-7在裸鼠成瘤速率下降约50％，微血管密度下降40％，SAMe含量升高2倍。Liu等应用RNA干扰技术抑制MAT2A的表达，结果显示MAT2A基因的mRNA含量和MAT Ⅱ活性均降低，细胞凋亡指数接近30％。这些研究表明，针对MAT基因的干预可明显抑制肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，减缓肿瘤的生长。然而，至今对于MAT1A和MAT2A联合干预肝癌细胞成瘤的研究仍然较少，尤其是MAT基因的表达失调对肝癌血管生成及侵袭转移是否有影响，目前尚未见报道。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一些外源性或内源性小双链RNA(smallinterfering RNA，siRNA)在细胞内根据碱基配对原则与相应的mRNA结合，诱导mRNA降解，特异性、高效地阻断特定基因的表达，导致细胞出现相应基因表达缺失的技术。Guo等在1995年将正义链或反义链RNA导入线虫体内，发现其par-1基因表达被特异性抑制了。随后，Fire等在1998年证实，真正有效地抑制目的基因表达的是双链RNA，从此揭开RNAi的神秘面纱。RNAi特异性降解同源mRNA，对基因的转录过程无影响，而是影响基因的翻译过程，因此也称转录后基因沉默。RNAi效率高、特异性强、操作简单等特点，已经成为研究特定基因功能的常用技术。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能抑制MAT2A基因表达的siRNA。
本发明的能抑制MAT2A基因表达的siRNA，其特征在于，包括siRNA MAT2A-1或siRNA MAT2A-2；
所述的siRNA MAT2A-1，其正义链为：5’-GCAACAGUCACCAGAUAUU-3’(如SEQ IDNO.2所示)，其反义链为：5’-AAUAUCUGGUGACUGUUGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
所述的siRNA MAT2A-2，其正义链为：5’-GCCUAUGGCCACUUUGGUA-3’(如SEQ IDNO.4所示)，其反义链为：5’-UACCAAAGUGGCCAUAGGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)。
本发明的第二个目的是提供一种抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体，其特征在于，其是将能抑制MAT2A基因表达的siRNA转入慢病毒载体而得到的。
所述的载体为慢病毒载体pCDH-U6。
本发明的第三个目的是提供过表达MAT1A基因的慢病毒载体联合抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体在制备抑制肝癌药物中的应用，所述的MAT1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第256位-1443位碱基所示。
所述的抑制肝癌的药物是抑制肝癌血管生成、肝癌迁移和侵袭、肝癌肺转移的药物。
过表达MAT1A基因的慢病毒载体优选是将MAT1A基因插入慢病毒载体pCDH-CMV的酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ之间而得到的。
通过GenBank搜索，获得人源MAT1A的cDNA序列(Gene ID:4143，其序列如SEQ IDNO.1所示，具体的MAT1A基因如SEQ ID NO.1的第256位-1443位碱基所示)，设计引物并经PCR扩增cDNA后，使用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切，再与经过同样酶切的慢病毒载体pCDH-CMV连接；然后转化感受态大肠杆菌DH5α进行扩大培养；进行纯化质粒后可得到表达MAT1A基因的慢病毒载体pCDH-MAT1A，测序验证其序列的正确性；通过将慢病毒载体转染SMMC-7721细胞后验证转染后MAT1A基因的mRNA水平显著升高。
敲低MAT2A的慢病毒载体是采用siRNA表达载体法来实现的。根据在GenBank中搜索确定人源MAT2A的mRNA序列(Gene ID:4144)，设计并筛选得到了可有效抑制SMMC-7721中MAT2A的mRNA表达的siRNA MAT2A-1和siRNA MAT2A-2，再合成对应的siDNA序列，经PCR扩增后，使用Cal Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切，再与经同样酶切的慢病毒载体pCDH-U6连接；转化感受态大肠杆菌DH5α进行扩大培养；纯化质粒后可得到敲低MAT2A的慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2，测序验证其序列的正确性；通过将慢病毒载体转染SMMC-7721细胞后验证转染慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞中MAT2A的mRNA水平显著降低。
将构建好的慢病毒载体pCDH-MAT1A、pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-sh-MAT2A-2以及空载体质粒pCDH-CMV、pCDH-U6进行慢病毒包装，经过293T细胞扩增，浓缩后得到高滴度的慢病毒。将已经浓缩回收的5种慢病毒进行重组，得到以下6个组合：pCDH-CMV/pCDH-U6(control)、pCDH-MAT1A/pCDH-U6(MAT1A+pCDH)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1(pCDH+sh-MAT2A-1)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2(pCDH+sh-MAT2A-2)、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1(MAT1A+sh-MAT2A-1)和pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2(MAT1A+sh-MAT2A-2)。根据分组，将慢病毒组合分别感染SMMC-7721细胞，利用嘌呤霉素筛选出稳定表达细胞株；通过半定量RT-PCR验证mRNA的表达，利用Western blot检测蛋白表达情况，Western blot检测结果和RT-PCR的基本保持一致。
利用内皮细胞管形成实验证实低表达MAT2A基因、高表达MAT1A基因抑制肝细胞癌血管生成的能力，两者联合时效果更强。利用小室迁移、小室侵袭和动物实验证实低表达MAT2A基因联合高表达MAT1A基因能抑制肝癌血管生成、肝癌迁移和侵袭、肝癌肺转移。
本发明的利用siRNA敲低表达MAT2A基因且联合高表达MAT1A基因的用于肝细胞癌，具有良好的抑制肝癌血管生成、肝癌迁移和侵袭、肝癌肺转移的效果；可进一步将其应用于肝癌疾病的治疗，具有很高的理论和应用价值。
附图说明
图1是SMMC-7721细胞转染siRNA后MAT2A的mRNA表达半定量RT-PCR图。以GAPDH为内参，siRNA-N、siRNA-c、siRNA-3、siRNA-2和siRNA-1分别代表不转染、转染阴性对照siRNAMAT2A-c、转染siRNA MAT2A-3、转染siRNA MAT2A-2、转染siRNA MAT2A-1的SMMC-7721细胞。
图2是SMMC-7721细胞转染pCDH-MAT1A后MAT1A的mRNA的表达半定量RT-PCR图。以GAPDH为内参，SMMC-7721、pCDH和pCDH-MAT1A分别代表不转染、转染pCDH-CMV空载体和转染pCDH-MAT1A的SMMC-7721细胞。
图3是SMMC-7721细胞转染pCDH-sh-MAT2A-1或pCDH-sh-MAT2A-2后MAT2A的mRNA的表达半定量RT-PCR图。以GAPDH为内参，SMMC-7721、pCDH、sh-MAT2A-1和sh-MAT2A-2分别代表不转染、转染pCDH-U6空载体、转染pCDH-sh-MAT2A-1和转染pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞。
图4是稳定株中MAT1A和MAT2A的mRNA的表达半定量RT-PCR图。以GAPDH为内参，Control、pCDH+sh-MAT2A-1、pCDH+sh-MAT2A-2、MAT1A+pCDH、MAT1A+sh-MAT2A-1、MAT1A+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MAT1A/pCDH-U6、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞稳定株。
图5是稳定株中MAT1A与MAT2A蛋白含量Western blot检测图。以GAPDH为内参，Control、pCDH+sh-MAT2A-1、pCDH+sh-MAT2A-2、MAT1A+pCDH、MAT1A+sh-MAT2A-1、MAT1A+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MAT1A/pCDH-U6、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞稳定株。
图6是稳定株诱导HUVECs(脐静脉内皮细胞)管生成结果图。SFM、TCM、MAT1A、sh-MAT2A-2、MAT1A+sh-MAT2A-2分别代表无血清培养基、未转染细胞、转染pCDH-MAT1A细胞、转染pCDH-sh-MAT2A-2细胞、转染pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞上清液。
图7是稳定株小室迁移实验结果图。pCDH、pCDH+sh-MAT2A-1、pCDH+sh-MAT2A-2、MAT1A+pCDH、MAT1A+sh-MAT2A-1、MAT1A+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MAT1A/pCDH-U6、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞稳定株；***，P<0.001。
图8是稳定株小室侵袭实验显微镜扫描图。pCDH、pCDH+sh-MAT2A-1、pCDH+sh-MAT2A-2、MAT1A+pCDH、MAT1A+sh-MAT2A-1、MAT1A+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MAT1A/pCDH-U6、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞稳定株。
图9是稳定株小室侵袭实验结果统计图。***，P<0.001；各样品标号同图8。
图10是裸鼠接种稳定株30天后肺组织病理切片图。裸鼠双肺进行连续切片，进行HE染色，镜下统计转移病灶数目(400×)。pCDH、pCDH+sh-MAT2A-2、MAT1A+pCDH、MAT1A+sh-MAT2A-2分别代表转染的质粒载体类型为pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MAT1A/pCDH-U6、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2的SMMC-7721细胞稳定株。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1
1构建过表达MAT1A的慢病毒载体
为了研究MAT1A对人肝癌细胞系SMMC-7721的影响，我们构建了过表达MAT1A的慢病毒载体，基因表达质粒载体为慢病毒载体pCDH-CMV。
1.1基因位点选择
在GenBank中搜索获得人源MAT1A的cDNA序列，即Gene ID:4143(其序列如SEQ IDNO.1所示)。设计引物对，正向引物序列为：5’-CCTGTGAGACAGTGTGCAAG-3’，反向引物序列为：5’-ATGCACTCCTCTGTCTCGTC-3’，以该引物对PCR扩增人基因组DNA模板得到基因片段：MAT1A基因mRNA的编码序列(Coding sequence，CDS)，即Gene ID:4143(其序列如SEQ IDNO.1所示)的第256-1443位。该引物对由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
1.2 PCR扩增MAT1A的cDNA
(1)逐一加入反应物，反应体系50μl：
(2)反应条件为：
得到PCR产物。
1.3 PCR产物进行琼脂糖凝胶回收并纯化
(1)称取0.3g琼脂糖，加入30ml电泳缓冲液，使用微波炉加热至琼脂糖完全溶解，再加入1000×SYBA 5μl，摇匀；
(2)将琼脂糖溶液轻轻加入制胶模具中，插入梳子，待其自然冷却；
(3)待琼脂糖胶凝固后，拔出梳子，并将凝胶放入电泳槽中，确保电泳缓冲液没过凝胶；
(4)将loadingBuffer与DNA样品(PCR产物)混匀，再把混合液加入样品槽，每个加入5μl，记录点样次序；
(5)正确连接电泳槽正负电极，打开电源，调节电压至140V，电泳25分钟；
(6)将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统中，找到长度约为1187bp的cDNA对应条带，即为MAT1A基因cDNA条带；
(7)切下含有目的MAT1A基因cDNA的琼脂凝胶，使用纸巾吸净表面液体并切碎，将200μl的凝胶碎粒加入1.5ml离心管中；
(8)加入600μl凝胶熔化剂，混合均匀，置于75℃水浴锅中，轻摇直到凝胶完全溶解，此时溶液呈红色；
(9)加入300μl结合液，上下缓慢倒置混合均匀，此时混合液呈黄色；
(10)将步骤9中的混合液转移到DNA制备管中，12000×g离心1分钟，弃废液；
(11)将制备管置入2ml离心管中，加入500μl洗涤液，12000×g离心30sec，弃废液；
(12)将制备管置入2ml离心管中，加入700μl去盐液，12000×g离心30sec，弃废液，重复一次，确保盐分被完全清除；
(13)将制备管置入2ml离心管中，12000×g离心1分钟；
(14)将制备管置入1.5ml离心管中，在制备膜中央加入30μlDEPC水，室温静置1min，12000×g离心1分钟，洗脱目的cDNA；
(15)得到纯化的MAT1A-cDNA(MAT1A的基因编码序列，其前后带有酶切位点)，将其置于-20℃冰箱中备用。
1.4 EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切纯化后的MAT1A-cDNA
(1)反应体系30μl
(2)纯化并回收酶切后的MAT1A-cDNA，方法同前。注意回收过程中应将离心速度调整为10000×g，以免降低回收率。由此得到经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后的MAT1A-cDNA。
1.5 EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切质粒载体pCDH-CMV
(1)逐一加入反应物，反应体系20μl
(2)纯化并回收酶切后的质粒，方法同前。由此得到经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后的质粒载体pCDH-CMV。
1.6连接酶切后的MAT1A-cDNA及质粒载体pCDH-CMV
(1)反应体系10μl
由此得到MAT1A-cDNA与质粒载体pCDH-CMV重组连接产物，命名pCDH-MAT1A。
1.7制备并扩大培养转化感受态大肠杆菌DH5α
(1)从-80℃冰箱中取出感受态大肠杆菌DH5α，置于冰上溶解。取90μl感受态大肠杆菌DH5α，向其中加入10μl MAT1A-cDNA与质粒载体pCDH-CMV重组连接产物(pCDH-MAT1A)，混匀，置于冰上30分钟；
(2)取出置于预加热的42℃水浴42sec，促使大肠杆菌吞噬连接产物；
(3)将转化后的感受态细胞涂布在LB琼脂培养板上；
(4)置于37℃恒温箱中，倒置培养12h；
(5)挑选长势良好的单个菌落，置于50ml试剂管中，加入20ml LB+10ug/ml氨苄抗生素的培养基中；
(6)放入细菌摇床中，室温扩大培养12h。得到含有重组慢病毒载体pCDH-MAT1A的大肠杆菌。
1.8提取慢病毒载体pCDH-MAT1A
(1)取扩大培养后的含有重组慢病毒载体pCDH-MAT1A的大肠杆菌菌液20ml，加入离心管，5000×g，4℃，离心10min，可见细菌团沉积于管底，弃掉废液；
(2)加入4ml悬液缓冲剂/RNase混合液重悬细菌，混匀；
(3)加入4ml细菌裂解液，轻轻地上下倒置EP管6-8次，混合均匀，待液体变澄清后置于15℃孵育2分钟；
(4)加入4ml预冷的中和液，轻轻地上下倒置EP管6-8次，直至看到白色絮状物出现，再置于冰上孵育5分钟；
(5)使用滤纸过滤细菌裂解液，将滤纸对折2次，再分开形成漏斗状，尖端朝下插入50ml塑料管中；用少量双蒸水湿润滤纸；将细菌裂解液缓慢滴入湿润后的滤纸，再加入5mlPBS冲洗残存于滤纸的裂解液；收集滤过液待其自然澄清；
(6)将洗脱柱套入密封环中，再插入集液管中，用2.5ml平衡液湿润洗脱柱，待其自然滤干，弃掉过滤液；
(7)将第5步中澄清的滤过液倒入湿润后的洗脱柱中，待其自然滤干，弃掉过滤液；
(8)加入5ml清洗液，待其自然滤干，弃掉过滤液；
(9)重复第8步的实验，弃掉过滤液与集液管；
(10)将洗脱柱插入新的集液管中，加入5ml预热到50℃的洗脱液，待其自然滤干，收集滤过液(内含重组质粒)；
(11)加入3.6ml异丙醇，置于离心机中离心，15000×g，3.5℃，40分钟，小心地吸净上清液；
(12)加入3ml预冷至4℃的70％乙醇，离心，15000×g，3.5℃，10分钟，使用移液枪吸净上清液，静置10分钟待质粒DNA自然干燥；
(13)加入20μl超纯水，收集质粒，分装备用；由此提取得到慢病毒载体pCDH-MAT1A。
2构建低表达MAT2A的慢病毒载体
为了研究MAT2A基因对SMMC-7721的影响，采用siRNA表达载体法抑制MAT2A基因的表达，构建了敲低MAT2A的慢病毒载体，基因的表达载体为慢病毒系统载体pCDH-U6。
2.1基因位点选择
根据GenBank中的人源MAT2A基因cDNA开放阅读框的序列(Gene ID:4144)，设计了3条siRNA和一条siRNA阴性对照序列，分别是siRNA MAT2A-1、siRNA MAT2A-2、siRNAMAT2A-3和siRNA MAT2A-c，由苏州吉玛基因股份有限公司合成。
siRNA MAT2A-1其正义链为：5’-GCAACAGUCACCAGAUAUU-3’，其反义链为：5’-AAUAUCUGGUGACUGUUGC-3’。
siRNA MAT2A-2的正义链为：5’-GCCUAUGGCCACUUUGGUAdTdT-3’，反义链为：5’-UACCAAAGUGGCCAUAGGCdTdG-3’。
siRNA MAT2A-3其正义链为：5’-CCCAUCAGAGUCCACACAAdTdT-3’，其反义链为：5’-UUGUGUGGACUCUGAUGGGdAdA-3’。
siRNA MAT2A-c其正义链为：5’-GCACUCAGAGAGUAGUCCAdTdT-3’，其反义链为：5’-UAGUGGAUGUGGACUCUGCdAdA-3’。
2.2将4种siRNA分别转染SMMC-7721细胞筛选有效的siRNA序列
上述4种siRNA经退火形成小双链siRNA后，使用Lipofectamine 2000将siRNA分别转染SMMC-7721细胞内。转染48小时后，提取细胞总RNA，逆转录获得cDNA，半定量RT-PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，检测各个siRNA的有效性。具体步骤如下：
2.2.1转染SMMC-7721细胞
(1)在转染前24小时，加入500μl含10％FBS的英潍捷基公司生产无抗生素的DMEM培养基接种1×105个SMMC-7721细胞，待细胞融合度达到30-50％时进行转染；
(2)加入胰蛋白酶消化SMMC-7721细胞，并用含10％FBS的英潍捷基公司生产无抗生素的DMEM重悬细胞，进行细胞计数；
(3)加入50μl Opti-MEM稀释双链siRNA(siRNA终浓度为50nM)，用移液枪轻轻吹打混匀，得到稀释后的siRNA；
(4)上下倒置混匀转染试剂，加入50μl Opti-MEM稀释1μl Lipofectamine 2000，用移液枪轻轻吹打混匀，于室温下静置5分钟，稀释后的转染试剂；
(5)混合稀释后的siRNA和转染试剂，轻轻吹吸混匀，于室温下静置15分钟，得到转染复合物；
(6)将转染复合物加入到24孔板中，每孔100μl，轻轻前后左右轻摇细胞板混匀；
(7)将细胞板放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，转染4小时后更换新鲜的培养基，转染24小时后，得到转染了siRNA的SMMC-7721细胞，提取该细胞总RNA，以用于后续半定量RT-PCR验证siRNA的有效性。
2.2.2提取RNA
(1)按照1ml/10cm2细胞加入TRIzol裂解转染了siRNA的SMMC-7721细胞，置于室温下5分钟；
(2)按0.2ml/1ml的TRIzol加入氯仿，剧烈震荡15秒，置于室温下孵育2-3分钟；
(3)置于离心机中离心，12000×g，4℃，15min，可见上层水相，中间层，下层酚氯仿相，RNA即在水相中；
(4)将上层水相转入EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，置于室温下10分钟；
(5)将EP管置于离心机中离心，12000×g，4℃，15分钟，见RNA沉于管底；
(6)弃上清液，加入1ml 75％乙醇，清洗RNA沉淀，12000×g，4℃，10分钟；
(7)弃上清液，置于室温中自然干燥10分钟；
(8)加入50μl无RNAase的水，反复吹打溶解RNA，标记并分装于-80℃冰箱备用。
2.2.3 RNA逆转录为cDNA
(1)将RNA作为模板逆转录合成cDNA，反应体系10μl，
(2)将以上体系放入70℃恒温变性10分钟，取出后放在冰水上；
(3)在冰上逐一加入以下反应物，
(4)置于30℃恒温10分钟，再42℃孵育1小时，最后置于70℃，15分钟，即可得到cDNA，置于-80℃备用。
2.2.4半定量PCR验证
(1)将cDNA进行PCR扩增，使用无菌水将备用cDNA溶液稀释5倍，取2μl稀释液作为模板，反应体系为25μl，其中，primer1为：CACACTGGAGAATACGCACA，primer2为：GCATCAAGGACAGCATCACT；
反应条件为：
(2)收获PCR反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳验证siRNA的有效性，电泳具体步骤基本同前。
结果显示：在各组转染siRNA的SMMC-7721细胞中，MAT2A的mRNA水平不同，其中转染siRNA MAT2A-1，siRNA MAT2A-2和siRNA MAT2A-3这三组的mRNA水平下降(图1)，不转染组和阴性对照组无明显变化。据此可初步推测所设计的siRNA MAT2A-1，siRNA MAT2A-2和siRNA MAT2A-3均可有效抑制SMMC-7721中MAT2A的mRNA表达，但前两者效果更明显，遂选择siRNA MAT2A-1和siRNA MAT2A-2为标靶序列进行后续研究。
2.3合成siRNA MAT2A-1和siRNA MAT2A-2同序列的sh-MAT2A-1和sh-MAT2A-2
根据筛选结果，合成siRNA MAT2A-1和siRNA MAT2A-2同序列的siDNA序列：sh-MAT2A-1和sh-MAT2A-2，由上海吉玛制药技术有限公司合成。
根据siRNA MAT2A-1，设计sh-MAT2A-1序列为GCGCCTCACTATGGCTTGGTATCAGTACCAAGAAAGTGGTGGGCTTTCCATAGTATGC，正向引物序列为：5’-GAGATGCACACATACGCACA-3’反向引物序列为：5’-CAGCATCAAGGCATCACTAG-3’。
根据siRNA MAT2A-2序列，设计与之对应的sh-MAT2A-2序列为CGGCCTATGGCCACTTT GGTATCAAGAGTACCAAAGTGGCCATAGGCTTTTTGGATCC，进行PCR扩增，正向引物序列为：5’-TTCTGGTAGTCAACAGCAGC-3’反向引物序列为：5’-CCTTTTCACCTCAGAGTCGG-3’。
反应体系为50μl：
反应条件：
2.4 PCR产物进行琼脂糖凝胶回收并纯化
(1)称取0.3g琼脂糖，加入30ml电泳缓冲液，使用微波炉加热至琼脂糖完全溶解，加入1000×SYBA 5μl，摇匀；
(2)将琼脂糖溶液轻轻加入制胶模具中，插入梳子，待其自然冷却；
(3)待琼脂糖胶凝固后，拔出梳子，并将凝胶放入电泳槽中，确保电泳缓冲液没过凝胶；
(4)将loadingBuffer与DNA样品(PCR产物)混匀，再把混合液加入样品槽，每个加入5μl，记录点样次序；
(5)正确连接电泳槽正负电极，打开电源，调节电压至140V，电泳25分钟；
(6)将琼脂糖凝胶放入紫外透射反射分析仪中，检测结果；
(7)在紫外透视反射分析仪中切下目的sh-MAT2A基因cDNA电泳条带的琼脂凝胶，使用纸巾吸净表面液体并切碎，将200μl的凝胶碎粒加入1.5ml离心管中；
(8)加入600μl凝胶熔化剂，混合均匀，置于75℃水浴锅中，轻摇直到凝胶完全溶解，此时溶液呈红色；
(9)加入300μl结合液，上下缓慢倒置混合均匀，此时混合液呈黄色；
(10)将步骤9中的混合液转移到DNA制备管，12000×g离心1分钟，弃废液；
(11)将制备管置入2ml离心管中，加入500μl洗涤液，12000×g离心30sec，弃废液；
(12)将制备管置入2ml离心管中，加入700μl去盐液，12000×g离心30sec，弃废液，重复一次，确保盐分被完全清除；
(13)将制备管置入2ml离心管中，12000×g离心1分钟；
(14)将制备管置入1.5ml离心管中，在制备膜中央加入30μlDEPC水，室温静置1分钟，12000×g离心1分钟洗脱目的DNA；
(15)将回收的DNA置于-20℃冰箱中备用。由此分别获得sh-MAT2A-1和sh-MAT2A-2。
2.5用Cal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切纯化后的sh-MAT2A-1和sh-MAT2A-2
(1)依次加入下列反应物，反应体系30μl：
(2)纯化并回收酶切后的sh-MAT2A-1或sh-MAT2A-2，方法同前。注意回收过程中应将离心速度调整为10000×g，以免降低回收率；由此得到Cal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后的sh-MAT2A-1或sh-MAT2A-2。
2.6用Cal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切质粒载体pCDH-U6
(1)依次加入下列反应物，反应体系30μl
(2)纯化并回收酶切后的质粒，方法同前。由此得到Cal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后的pCDH-U6。
2.7连接酶切后的sh-MAT2A及质粒载体pCDH-U6
(1)依次加入下列反应物，反应体系10μl
(2)混匀，置于4℃冰箱中过夜，由此得到sh-MAT2A-1或sh-MAT2A-2与质粒载体pCDH-U6重组连接产物，分别命名为pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2。
2.8制备并扩大培养转化感受态细胞DH5α
(1)从-80℃冰箱中取出感受态大肠杆菌DH5α，置于冰上溶解。向90μl感受态大肠杆菌DH5α细胞中加入10μl pCDH-sh-MAT2A-1或pCDH-sh-MAT2A-2与质粒载体pCDH-U6重组连接产物(pCDH-sh-MAT2A-1或pCDH-sh-MAT2A-2)，混匀，置于冰上30min；
(2)取出置于预加热的42℃水浴42sec，促使大肠杆菌吞噬连接产物；
(3)将转化后的感受态细胞涂布在LB琼脂培养板上；
(4)置于37℃恒温箱中，倒置培养12h；
(5)挑选长势良好的单个菌落，置于50ml试剂管中，加入20mlLB+10ug/ml氨苄抗生素的培养基中；
(6)放入细菌摇床中，室温扩大培养12h。得到含有慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1或pCDH-sh-MAT2A-2的大肠杆菌。
2.9提取慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2
(1)取扩大培养后的含有慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1或pCDH-sh-MAT2A-2的大肠杆菌菌液20ml，加入离心管，5000×g，4℃，离心10min，可见细菌团沉积于管底，弃掉废液；；
(2)加入4ml悬液缓冲剂/RNase混合液重悬细菌，混匀；
(3)加入4ml细菌裂解液，轻轻地上下倒置EP管6-8次，混合均匀，待液体变澄清后置于15℃孵育2分钟；
(4)加入4ml预冷的中和液，轻轻地上下倒置EP管6-8次，直至看到白色絮状物出现，再置于冰上孵育5分钟；
(5)使用滤纸过滤细菌裂解液。将滤纸对折2次，再分开形成漏斗状，尖端朝下插入50ml塑料管中；用少量双蒸水湿润滤纸；将细菌裂解液缓慢滴入湿润后的滤纸，再加入5mlPBS冲洗残存于滤纸的裂解液，收集滤过液，待其自然澄清；
(6)将洗脱柱套入密封环中，再插入集液管中；用2.5ml平衡液湿润洗脱柱，待其自然滤干，弃掉过滤液；
(7)将第5步中澄清的滤过液倒入湿润后的洗脱柱中，待其自然滤干，弃掉过滤液；
(8)加入5ml清洗液，待其自然滤干，弃掉过滤液；
(9)重复第8步的实验，弃掉过滤液与集液管；
(10)将洗脱柱插入新的集液管中，加入5ml预热到50℃的洗脱液，待其自然滤干，收集滤过液(内含质粒)；
(11)加入3.6ml异丙醇，置于离心机中离心，15000×g，3.5℃，40分钟，小心地吸净上清液；
(12)加入3ml预冷至4℃的70％乙醇，离心，15000×g，3.5℃，10分钟，使用移液枪吸净上清液，静置10分钟待质粒DNA自然干燥；
(13)加入20μl超纯水，收集质粒，分装备用。由此得到慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2。
3验证慢病毒质粒的正确性与表达情况
3.1测序
将以上收集的质粒载体送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，以验证目标序列与预测序列的一致性。测序结果表明：构建的pCDH-MAT1A慢病毒载体序列与设计的序列完全一致，构建的pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2慢病毒载体序列与设计的序列完全一致。
3.2将慢病载体转染SMMC-7721细胞
(1)在转染前24小时，接种1×105SMMC-7721细胞于500μl的无血清培养基(SFM)中；
(2)用50μl Opti-MEM稀释慢病毒质粒DNA，混匀；
(3)取适量Opti-MEM与Lipofectamine2000混匀，室温下静置5分钟；
(4)将稀释的Lipofectamine与慢病毒质粒DNA混匀，总体积100μl，室温下静置20分钟；
(5)按100μl混合液加入每个细胞板孔中，轻轻摇动混匀；
(6)将细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养18小时；得到含慢病毒质粒DNA(pCDH-MAT1A、pCDH-sh-MAT2A-1或pCDH-sh-MAT2A-2)的细胞稳定株。
3.3提取总RNA
(1)按照1ml/10cm2细胞加入TRIzol裂解上述含慢病毒质粒DNA的细胞稳定株，置于室温下5分钟；
(2)按0.2ml/1ml的TRIzol加入氯仿，剧烈震荡15秒，室温下孵育2-3分钟；
(3)置于离心机中离心，12000×g，4℃，15min，可见上层水相，中间层，下层酚氯仿相，RNA即在水相中；
(4)将上层水相转入EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，置于室温下10min；
(5)将EP管置于离心机中离心，12000×g，4℃，15min，可见RNA沉于管底；
(6)弃上清液，加入1ml 75％乙醇，清洗RNA沉淀，12000×g，4℃，10min；
(7)弃上清液，置于室温中自然干燥10分钟；
(8)加入50μl无RNAase的水，反复吹打溶解RNA，标记并分装于-80℃冰箱备用；
(9)按1:100稀释RNA溶液与TE溶液，使用分光光度计读取260nm和280nm的吸收值，测定RNA的浓度和纯度；
(10)以1％琼脂凝胶电泳后，在紫外透射光下观察并拍照，检测RNA序列的完整性。以后续用作RNA模板逆转录为cDNA。
3.4将RNA逆转录为cDNA
(1)反应体系10μl：
(2)放入70℃恒温变性10min，取出后冰水浴；
(3)于冰上操作，依次加入下列反应物：
(4)先置于30℃恒温10min，再42℃孵育1小时，最后置于70℃15分钟；
(5)最后得到的即为cDNA溶液，置于-80℃冰箱备用。
3.5以备好的cDNA为模板，进行半定量RT-PCR
(1)反应体系25μl：其中，扩增MAT2A cDNA的primer1序列为CACACTGGAGAATACGCACA，primer2序列为GCATCAAGGACAGCATCACT；扩增MAT1A cDNA的primer1为GAGTCAACGGATTTGGTCGT，primer2为GACAAGCTTCCCGTTCTCAG。
(2)反应条件：
收获反应产物，4℃冰箱保存备用；
(3)以1％琼脂凝胶电泳分离PCR产物，用凝胶成像系统分析基因表达情况，操作过程同前所述。
半定量RT-PCR结果显示：不转染载体和转染空载体对照组中MAT1A的mRNA水平极低，几乎检测不到；转染慢病毒载体pCDH-MAT1A的实验组中MAT1A的mRNA水平显著升高，明显高于对照组(图2)。不转染载体和转染空载体对照组中MAT2A的mRNA水平相当高；转染慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2的实验组中MAT2A的mRNA水平显著降低，明显低于对照组，几乎检测不到(图3)。由此确认得到过表达MAT1A的慢病毒载体pCDH-MAT1A，得到敲低MAT2A的慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-1和pCDH-sh-MAT2A-2。
4构建过表达MAT1A或低表达MAT2A细胞稳定株
为了研究过表达MAT1A、敲低MAT2A对SMMC-7721细胞功能的影响，进一步构建MAT1A、MAT2A相关的稳定表达细胞株。
将构建好的慢病毒载体pCDH-MAT1A、pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-sh-MAT2A-2以及空载体质粒pCDH-CMV、pCDH-U6分别进行慢病毒包装，利用Lemti-X293T细胞扩增，浓缩后对应得到高滴度的慢病毒。
4.1慢病毒包装
(1)使用TaKaRa Lenti-XTM HTX Packaging System进行病毒包装；
(2)进行转染24小时之前，在10ml培养皿铺Lemti-X293T细胞，浓度为4×106/100mm，置于37℃，5％CO2培养箱培养，当细胞汇合度为80-90％时可进行转染；
(3)充分震荡混匀Xfect Polymer；
(4)对于每个备转染样品，准备2个小离心管，依次加入以下反应物：
(5)将上述两个离心管分别震荡混匀；
(6)将管2混合液加入管1中，震荡混匀；
(7)将DNA-Xfect混合物置于室温下孵育10分钟，以利于转染复合物的形成；
(8)将1200μl DNA-Xfect混合物逐滴加入第2步中的Lemti-X293T细胞中，前后摇动培养板以混匀；
(9)将培养板置于37℃下孵育；
(10)孵育过夜后，吸净转染培养基，加入10ml新鲜完全培养基，置于37℃继续孵育24-48小时；
(11)离心10分钟，500×g，以除去细胞碎片；
(12)使用Lenti-X GoStixTM测定病毒产量，置于-80℃备用。
4.2慢病毒的收获及浓缩
(1)转染Lemti-X293T细胞48小时后，收集细胞上清液(含慢病毒)；
(2)将离心管中的上清液置于离心机中，500×g，10分钟；
(3)将上清液转移到无菌管中，按1/3体积的Lenti-X浓缩液，上下倒置无菌管混匀；
(4)将混合液置于4℃孵育过夜；
(5)置于离心机中离心，1500×g，4℃，45分钟；离心后可见灰白色沉淀，即为慢病毒；
(6)将上清液移入另一个离心管，再次离心，1500×g，4℃，45分钟；
(7)用PBS重悬第5、6步离心后所得的慢病毒沉淀；
(8)将浓缩病毒液吸出，分装保存与-70℃冰箱中备用。由此得到各质粒的高滴度的慢病毒。
4.3构建细胞稳定株
将已经浓缩回收的5种慢病毒进行重组，得到以下6个组合(括号中为对应的组名)：pCDH-CMV/pCDH-U6(control)、pCDH-MAT1A/pCDH-U6(MAT1A+pCDH)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1(pCDH+sh-MAT2A-1)、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2(pCDH+sh-MAT2A-2)、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1(MAT1A+sh-MAT2A-1)和pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2(MAT1A+sh-MAT2A-2)。根据分组，将慢病毒组合分别感染SMMC-7721细胞，以终浓度为0.1-0.5μg/ml的嘌呤霉素对应的筛选出6个SMMC-7721细胞稳定株。
4.4半定量RT-PCR验证各细胞稳定株中MAT1A和MAT2A的mRNA的表达
利用半定量RT-PCR验证细胞稳定株中MAT1A和MAT2A的mRNA的表达情况，具体操作步骤同前所述。
结果显示：Control组中MAT1A的mRNA表达水平低，MAT2A的mRNA表达水平高；与Control相比，pCDH+sh-MAT2A-1和pCDH+sh-MAT2A-2两组中MAT1A的mRNA均处于低表达水平，与对照组基本相当，而两者都可以抑制MAT2A的mRNA表达，并且后者的抑制能力更强。在MAT1A+pCDH细胞株中，MAT1A的mRNA表达显著提高，但是MAT2A的mRNA也处于高表达水平，与对照组相差不大。MAT1A+sh-MAT2A-1以及MAT1A+sh-MAT2A-2这两组中，都能明显促进MAT1A的mRNA表达，都降低了MAT2A的mRNA表达水平，但后者的抑制作用更明显(图4)。
4.5 Western Blot验证各稳定株中MAT1A和MAT2A表达情况
利用Western blot检测各SMMC-7721细胞稳定表达株中MAT1A与MAT2A蛋白含量的情况。
(1)吸净SMMC-7721细胞稳定表达株培养基后，加入2ml 1×PBS洗涤细胞，加入适量1×SDS细胞裂解液，比例为100μl/2-4×105个细胞；
(2)将细胞吸入1.5ml EP管中，在95℃加热10分钟；
(3)再置于离心机中离心，12000×g，4℃，8分钟；
(4)收集上清液，储存于-80℃冰箱中备用；
(5)制备8-12％的SDS-PAGE固体凝胶，安装于电泳槽中，并将1×TBE加入到电泳槽内；
(6)将上清液样品充分混合均匀后上样；
(7)首先以10mA恒流进行浓缩胶电泳，再以20mA恒流进行分离胶电泳；
(8)将完成电泳的凝胶取出，以海绵垫、滤纸、PVDF膜、凝胶次序安装，于250mA恒流转膜4小时；
(9)转膜结束后，以1×TBS清洗PVDEF膜5分钟，再加入封闭液，于室温下缓慢摇动2小时；
(10)使用TBS/T清洗PVDEF膜5分钟，重复3次；
(11)加入已经稀释好的一抗溶液，于4℃的条件下孵育过夜；
(12)使用TBS/T清洗PVDEF膜5分钟，重复3次；
(13)加入二抗溶液，置于室温下孵育1h；
(14)使用TBS/T清洗PVDEF膜5分钟，重复3次；
(15)使用ECL溶液显色，最后进行显影和定影。
结果显示：Control组中MAT1A的蛋白含量较低，MAT2A的蛋白含量处于高水平；与对照组相比，pCDH+sh-MAT2A-1和pCDH+sh-MAT2A-2两组中MAT1A的蛋白含量依然处于低水平，与对照组基本相当，而两者都可以降低MAT2A的蛋白含量，并且后者的抑制能力更强。在MAT1A+pCDH细胞株中，MAT1A的蛋白含量显著提高，但是MAT2A的蛋白也处于较高水平，与对照组相差不大。MAT1A+sh-MAT2A-1以及MAT1A+sh-MAT2A-2这两组中，都能明显提高MAT1A的蛋白含量，都降低了MAT2A的蛋白含量，但后者的作用更明显(图5)。Western blot检测结果和RT-PCR的基本保持一致。综合以上情况，我们筛选出了四个稳定表达株，分别是：control、MAT1A+pCDH、pCDH+sh-MAT2A-2、MAT1A+sh-MAT2A-2。
5管形成实验
在完成上述工作的基础上，进一步通过小管形成细胞实验研究MAT1A与MAT2A基因对血管生成的影响。
5.1收集肿瘤细胞上清液
(1)使用Lipofectamine2000将200nM高表达MAT1A慢病毒载体(转染pCDH-MAT1A)、低表达MAT2A慢病毒载体(转染pCDH-sh-MAT2A-2)、高表达MAT1A慢病毒载体和低表达MAT2A慢病毒载体(联合转染组pCDH-MAT1A+pCDH-sh-MAT2A-2)转染入SMMC-7721细胞中，同时设置阴性对照组(不转染组)；
(2)转染36小时后吸净培养基，用2ml 1×PBS清洗细胞3次；
(3)分别加入内皮细胞无血清培养基，继续培养12小时；
(4)使用移液枪吸取收集肿瘤细胞培养上清液；
(5)将收集管置于离心机中离心，500×g，4℃，10分钟，以除去漂浮细胞；
(6)再置于离心机中离心，12000×g，4℃，10分钟，以除去细胞碎片；
(7)将肿瘤上清液分装并冻存于-80℃冰箱中备用。得到以下4组肿瘤培养上清，分别是：未转染组(TCM)，转染pCDH-MAT1A组(MAT1A)，转染pCDH-sh-MAT2A-2组(sh-MAT2A-2)和联合转染组(MAT1A+sh-MAT2A-2)。
5.2内皮细胞小管形成实验
使用以上4组肿瘤培养上清和无血清培养基(SFM)在基质胶铺设的96孔板上培养脐静脉内皮细胞(HUVECs)，6小时后观察。
(1)将冻存于-80℃冰箱中的Matrigel(基质胶)取出，放入冰盒内，置于4℃冰箱中12小时；
(2)将Matrigel/SFM(无血清培养基)以4:6混合均匀，放于4℃冰箱中；
(3)将预冷后的50μl Matrigel/SFM加入预冷96孔板内，离心，500×g，4℃，5分钟，使混合物平铺于孔底；
(4)静置于37℃中2小时，待混合物自然聚合凝成固态；
(5)使用胰蛋白酶消化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，离心后计数，使用SFM或收集的TCM肿瘤培养上清液(或另外3组的肿瘤上清液)重悬细胞，浓度为1.5×105细胞/ml；
(6)将100μl HUVEC重悬液加入第3步已铺好的Matrigel/SFM96孔板内，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养6小时；
(7)于微镜下观察并记录细胞相互连接的节点数。
结果显示：与SFM相比，TCM能显著诱导内皮细胞在基质胶中形成管状结构，而单独过表达MAT1A或敲低MAT2A的肿瘤细胞培养上清，其促进内皮细胞管形成的能力减弱。有意思的是：提高MAT1A表达的同时抑制MAT2A表达的肝癌细胞促进内皮细胞管形成的能力更弱，几乎等同于SFM(图6)。该实验结果表明，过表达MAT1A、敲低MAT2A抑制肝癌血管生成。
6小室迁移及侵袭实验
利用康宁(Corning)公司生产的转移小室研究MAT1A和MAT2A对SMMC-7721细胞迁移和侵袭能力的影响。
(1)使用转移小室进行小室迁移实验，其孔径为8μm，直径为6.5mm；
(2)将实验过程所用到的无菌枪头及EP管放置于冰上预冷，用无血清的DMEM浸泡转移小室1小时；
(3)使用移液枪吸净转移小室中的培养基，并用聚碳酸酯膜包被；
(4)先构建好SMMC-7721细胞表达株：pCDH-CMV/pCDH-U6、pCDH-MAT1A/pCDH-U6、CDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-CMV/pCDH-sh-MAT2A-2、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-1、pCDH-MAT1A/pCDH-sh-MAT2A-2，36小时后用胰蛋白酶消化并用无血清的DMEM进行重悬，将细胞浓度调整为5×105细胞/ml；
(5)将600μl的10％小牛血清+DMEM加入到转移小室下室中，将100μl细胞重悬液加入到上室中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养12小时；
(6)吸净上室中的培养基，用1×PBS洗涤一次；
(7)使用10％的福尔马林固定细胞30sec；
(8)吸净福尔马林溶液，加入0.1ml/孔结晶紫染液，静置于室温中20分钟；
(9)吸净染色液，使用双蒸水洗涤，将培养板置于37℃烘干；
(10)擦掉覆盖于聚碳酸酯膜正面的细胞，并在显微镜下记录转移至聚碳酸酯膜反面的细胞数。
结果显示：与control相比，单独过表达MAT1A或敲低MAT2A的SMMC-7721细胞迁移通过转移小室聚碳酸质膜的数量相差不大；而同时提高MAT1A表达并抑制MAT2A的肿瘤细胞迁移到转移小室下层的细胞明显减少(图7)。
同时还进行小室侵袭实验的研究，本研究使用基质胶包被聚碳酸酯膜，以模拟体外细胞外基质，其余操作过程同小室迁移实验。结果显示：与对照组相比，单独过表达MAT1A或敲低MAT2A的SMMC-7721细胞侵袭基质胶，转移到下室的数量相差不大，细胞密度相当；而同时提高MAT1A表达和抑制MAT2A的肿瘤细胞侵袭到下室的细胞数量明显减少，细胞密度显著降低(图8、图9)。该实验结果表明，过表达MAT1A联合敲低MAT2A抑制肝癌迁移和侵袭。
7动物实验
体外细胞实验并不能完全反映肿瘤在体内的生物学特性，遂进行动物实验进一步验证MAT1A与MAT2A对肝癌细胞转移的影响。将已经筛选出了四个稳定表达细胞株(control(pCDH)、MAT1A+pCDH、pCDH+sh-MAT2A-2和MAT1A+sh-MAT2A-2)分别接种于裸鼠肝左叶(每组接种4只裸鼠)，构建肝癌模型，30天后检测肿瘤及肺转移情况，原位成瘤率为100％。具体操作步骤如下：
(1)使用1％戊巴比妥钠按40mg/kg的剂量腹腔麻醉6周龄的BALB/c雄性裸鼠；
(2)待麻醉满意后，取仰卧位，使用胶布将裸鼠四肢固定于操作台上；
(3)使用眼科剪在裸鼠左上腹部建立长约1.5cm的横向切口，然后用棉签轻挑，充分暴露裸鼠肝左叶；
(4)使用胰岛素针，将25μl的Matrigel/PBS/细胞株混悬液接种于裸鼠肝左叶包膜下(可见到肝包膜下白点表示接种满意)；
(5)迅速拔出胰岛素针，使用棉签按压穿刺点30sec；
(6)轻轻回纳肝左叶，使用3#手术丝线缝合切口(务必将皮肤、肌层、腹膜完全对接缝合)；
(7)肝原位接种成瘤后将裸鼠交予中山大学附属第一医院动物实验中心饲养；
(8)接种后每3天观察裸鼠及肿瘤生长情况。接种30天后处死裸鼠，检测胸水及腹水情况；测量原位肿瘤长度(L)，宽度(W)，根据公式(L×W2)/2计算肿瘤体积；取下肿瘤、肝脏及双肺，固定于10％福尔马林液中备用。切片观察肺组织病理情况。
肺组织病理切片结果显示：在对照组(pCDH)、过表达MAT1A组(MAT1A+pCDH)、敲低MAT2A组(pCDH+sh-MAT2A-2)中都出现肺转移，转移瘤率均为50％；而过表达MAT1A并敲低MAT2A组(MAT1A+sh-MAT2A-2)中未检测到肺转移(图10)。该实验结果表明，过表达MAT1A联合敲低MAT2A抑制肝癌肺转移。
Claims (6)
1.一种能抑制MAT2A基因表达的siRNA，其特征在于，
为siRNA MAT2A-2，其正义链为：5’-GCCUAUGGCCACUUUGGUA-3’，反义链为：5’-UACCAAAGUGGCCAUAGGC-3’。
2.一种抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体，其特征在于，其是将权利要求1所述的能抑制MAT2A基因表达的siRNA转入慢病毒载体而得到的。
3.根据权利要求2所述的抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体，其特征在于，所述的慢病毒载体为慢病毒载体pCDH-U6。
4.过表达MAT1A基因的慢病毒载体联合权利要求2所述的抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体在制备抑制肝癌药物中的应用，所述的MAT1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第256位-1443位碱基所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抑制肝癌药物是抑制肝癌血管生成、肝癌迁移和侵袭的药物。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的过表达MAT1A基因的慢病毒载体是将MAT1A基因插入慢病毒载体pCDH-CMV的酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ之间而得到的。
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