CN114717320A - 一种新的肝癌肿瘤标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新发现肝癌肿瘤标志物及其临床检测相关应用，本发明所述的肝癌肿瘤标志物为OIT3，在肝癌组织中存在着异常低表达状态，此标志物可以应用在肝癌的诊断及治疗领域中，此外，本发明中还涉及到OIT3作为肝癌标志物的引物序列，可以作为肝癌诊断试剂，应用在肝癌的检测诊断领域当中。本发明可以为提高肝癌诊断的精准性、效率及早期诊断水平，适合在临床肝癌诊断工作上进行推广。

Description

一种新的肝癌肿瘤标志物及其应用
技术领域
本发明涉及肝癌肿瘤技术领域，具体涉及一种新的肝癌肿瘤标志物及其应用。
背景技术
肝癌的发病率高居全球癌症发病率第5位，肝癌的致死率高居癌症相关死亡率的第二位，每年新诊断的肝癌病例为854，000例左右，每年因肝癌死亡病例数达到810,000例。其中在全球新诊断的肝癌病例中，超过90%的都是肝细胞癌。其中，亚洲地区的新诊断病例数的比例高达75-80%，尤其是我国，我国肝癌的新诊断病例数占亚洲总病例数的50%以上。肝癌患者的防治以早发现早治疗最为关键，因为早期缺乏明显的不适症状，大多数患者并不能及时发现早期病变，当出现明显临床症状时，已经处于晚期，肝功能差，并丧失了手术机会。目前，肝癌的诊断主要依靠影像学和血清AFP（甲胎蛋白）水平的检测。
但是影像学检查手段对于小于2厘米的肝癌病灶的敏感性较差，这与其肿瘤血管结构不完整有关。自20世纪70年代以来，血清AFP检测已经开始用于临床肝癌诊断，可以提高诊断准确性，尤其对于已有临床症状的晚期肝癌患者。AFP检测手段可以提供39-64%的敏感性及76-91%的特异性，即使在早期肝癌的诊断中，AFP检测也能提供一定的价值。目前，AFP检测已经在临床上广泛用于肝癌的诊断。但是，仍有80%小肝癌患者其外周血AFP并没有显著变化，对于＞3 cm的肝癌的诊断，AFP检测的敏感性可以达到52%，但对于＜3 cm的肝癌的诊断，AFP检测的敏感性仅为25%。且存在着部分AFP阴性（< 25 ng/ml）的肝癌患者。此外，AFP的显著升高也可见于非肝癌病人，如患有急性肝炎的患者。总而言之，对于肝癌的诊断，我们仍需要更为精确灵敏，更可信且可以广泛应用的诊断指标。
肝癌的治疗主要以手术为主，早期的肝癌患者可以采用外科手术治疗等方法，其5年生存率可以达到70%，而晚期的患者只能进行保守治疗，其临床预后差，中位生存时间少于1年。对于中晚期的患者，还需要多学科综合治疗，如介入栓塞、局部消融、局部放疗等，即使经过多学科治疗，肝癌患者的长期预后仍然很差，且肝癌术后复发率高，复发进程较早，且无特异性的疗法，靶向及免疫治疗能带来一定的临床获益，却仍不能达到更高的治疗效率。上述情况迫使我们需要对肝癌的发生发展、侵袭转移、放化疗抵抗、复发等过程中所涉及信号调控通路等分子生物学基础进行研究，从而发掘新的肝癌肿瘤标志物，为肝癌的早期诊断、预后判断等提供新的思路，提高我国的肝癌诊疗水平。
基于此，本发明提供一种新的肝癌肿瘤标志物及其应用。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种新的肝癌肿瘤标志物及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明提供了一种新的肝癌肿瘤标志物，所述肝癌肿瘤标志物为OIT3；所述OIT3在肝癌患者外周血及肝癌组织中的表达水平采用qRT-PCR的方法进行检测；
其中OIT3在肝癌组织中处于显著低表达状态，且与肝癌细胞的肿瘤生物学行为密切相关。
优选地，所述肿瘤生物学行为为增殖、迁移和侵袭。
优选地，所述肝癌肿瘤标志物OIT3在肝癌组织中处于低表达状态，且其表达水平与肝癌患者的临床预后显著相关。
优选地，所述标志物可通过设计引物序列作为肝癌检测试剂盒的关键组分之一，并对肝癌患者临床样本进行该肿瘤标志物的检测。
优选地，所述临床样本包括外周血及肝癌组织标本，应在临床上进行相关样本的收集，其中外周血样本的收集程序如下：
研究对象空腹静脉血2.5-3.5 mL于促凝管中，室温垂直静置25-35min后，常温下1450-1550 r/min离心8-12 min，吸取上层液体至标记好的EP管中，-80℃保存备用。
优选地，所述肝癌标本的收集程序如下：切取新鲜肝癌组织保存于-80℃，以备后续用TRIzol试剂进行各血清样本及肝癌组织样本总RNA的提取。
优选地，所述OIT3引物序列：
ForwardPrimer：TGTTCTGCTTACATCAGCCTG;
Reverse Primer：GTTGTCACATAGAGGAGGACCT；
根据引物采用荧光定量PCR（qRT-PCR）对患者的肝癌组织及外周血标本进行OIT3表达水平的检测。
优选地，所述肝癌肿瘤标志物在作为肝癌检测诊断试剂中的应用及临床预后预测模型中的价值。
本发明还提供了一种肝癌肿瘤标志物的检测在肝癌诊断中的应用。
优选地，所述的应用可根据OIT3的表达水平对肝癌患者进行早期筛选并进行临床预后的预测指标，具有临床转化价值。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明提供一种肝癌肿瘤标志物，可以作为肝癌诊断试剂，应用于肝癌患者的早期诊断领域，使肝癌患者的诊断更为简便、准确与快速，可以提高我国的肝癌诊疗水平，适于临床肝癌患者初筛，进行推广与应用。
2、本发明还提供和上述肝癌标志物的检测引物序列，可用于OIT3检测试剂盒的重要组分，从而使得肝癌肿瘤标志物的检测更为简便与快速，具有实用性，便于更大范围地进行推广应用。
3、本发明还提供上述肿瘤标志物检测水平与患者临床预后的预判模型，从而能为肝癌临床诊疗过程中对患者临床转归的判断提供一定的思路，从而在肝癌诊疗过程中起到一定的提示作用。
附图说明
图1是在不同的肿瘤数据库中验证OIT3在肝癌组织与正常癌旁组织中的表达差异示意图；
图2是在肝癌临床样本（组织芯片）中通过免疫组化验证OIT3在肝癌组织与癌旁组织中的表达差异示意图；
图3是在肝癌细胞与肝细胞中检测OIT3的mRNA表达水平示意图；
图4是在数据库中及组织芯片中验证OIT3表达水平与肝癌患者临床预后之间关系的示意图；
图5是验证OIT3在肝癌细胞中起到抑制肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的示意图；
图6是对OIT3在肝癌中发挥的调控机制进行探索，花生四烯酸的变化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了使肝癌患者的诊断更为简单、便捷、快速及准确，本发明提供了一种新的肝癌肿瘤标志物，即OIT3，进一步的，OIT3作为肿瘤标志物，我们设计了其荧光定量PCR的引物，并以此进行OIT3在肝癌细胞中表达水平的检测，本发明还验证了OIT3表达水平与肝癌患者临床预后之间的相关性，在肿瘤细胞功能学方面，本发明还进一步验证了OIT3可以在肝癌组织中起到抑癌作用，本发明最终提供了OIT3作为肝癌肿瘤标志物的检测应用，及OIT3实时定量PCR引物在肝癌诊断试剂中的应用。
本实施例的一种新的肝癌肿瘤标志物，所述肝癌肿瘤标志物为OIT3；所述OIT3在肝癌患者外周血及肝癌组织中的表达水平采用qRT-PCR的方法进行检测；
其中OIT3在肝癌组织中处于显著低表达状态，且与肝癌细胞的肿瘤生物学行为密切相关。
本实施例的肿瘤生物学行为为增殖、迁移和侵袭。
本实施例的肝癌肿瘤标志物OIT3在肝癌组织中处于低表达状态，且其表达水平与肝癌患者的临床预后显著相关。
本实施例的标志物可通过设计引物序列作为肝癌检测试剂盒的关键组分之一，并对肝癌患者临床样本进行该肿瘤标志物的检测。
本实施例的临床样本包括外周血及肝癌组织标本，应在临床上进行相关样本的收集，其中外周血样本的收集程序如下：
研究对象空腹静脉血2.5-3.5 mL于促凝管中，室温垂直静置25-35min后，常温下1450-1550 r/min离心8-12 min，吸取上层液体至标记好的EP管中，-80℃保存备用。
本实施例的肝癌标本的收集程序如下：切取新鲜肝癌组织保存于-80℃，以备后续用TRIzol试剂进行各血清样本及肝癌组织样本总RNA的提取。
本实施例的OIT3引物序列：
ForwardPrimer：TGTTCTGCTTACATCAGCCTG;
Reverse Primer：GTTGTCACATAGAGGAGGACCT；
根据引物采用荧光定量PCR（qRT-PCR）对患者的肝癌组织及外周血标本进行OIT3表达水平的检测。
本实施例的肝癌肿瘤标志物在作为肝癌检测诊断试剂中的应用及临床预后预测模型中的价值。
本实施例的一种肝癌肿瘤标志物的检测在肝癌诊断中的应用。
本实施例的的应用可根据OIT3的表达水平对肝癌患者进行早期筛选并进行临床预后的预测指标，具有临床转化价值。
实施例1：
参见图1-6；
图1是在不同的肿瘤数据库中验证OIT3在肝癌组织与正常癌旁组织中的表达差异示意图，可见OIT3在肝癌组织中普遍存在低表达的状态；
图1：不同数据库证实：OIT3在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。
A：GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds#）中GSE33006、GSE45050、GSE121248、GSE45267进行交集分析；
B：GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）提示：肝癌组织中，OIT3的表达要显著低于癌旁组织；
C：不同GSE数据集提示：肝癌组织OIT3的表达要显著低于癌旁组织（除外GSE33006）；
D：UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）提示：OIT3在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001）。
图2是在肝癌临床样本（组织芯片）中通过免疫组化验证OIT3在肝癌组织与癌旁组织中的表达差异示意图，可见OIT3确实是在肝癌组织中低表达；
肝癌组织芯片结果证实：OIT3在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织；A：OIT3在肝癌组织与相应的癌旁组织中的免疫组化代表图；B：OIT3在肝癌组织与相应的癌旁组织中的免疫组化评分统计图（***P<0.001）。
图3是在肝癌细胞与肝细胞中检测OIT3的mRNA表达水平，可见肝癌细胞中，OIT3的表达水平要低于肝细胞；
OIT3在肝癌细胞中的表达水平显著低于正常肝细胞。
左图：OIT3与GAPDH对应的溶解曲线。可见二者均为单一峰，说明OIT3引物正确；
右图：肝癌细胞与正常肝细胞中OIT3的mRNA水平差异（**P<0.01;***P<0.001）。
图4是在数据库中及组织芯片中验证OIT3表达水平与肝癌患者临床预后之间关系的示意图，可见OIT3表达水平越低，患者预后越差；
OIT3表达水平越低，患者的预后越差；
A- C：不同的数据库提示：OIT3表达水平越低，患者的预后越差（A-B: KM- plotter:
Figure 871945DEST_PATH_IMAGE001
C: HCCDB：lifeome.net/database/hccdb/home.html）；D-E：组织芯片结果提示：OIT3表达水平越低，患者的预后越差。
图5是验证OIT3在肝癌细胞中起到抑制肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的示意图，可见OIT3在肝癌中发挥着抑癌基因的作用；
OIT3高表达可以抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等肿瘤学表型功能；
过表达OIT3后，
A: cck8检测细胞增殖能力变化；
B：Transwell检测细胞侵袭能力变化；
C：划痕实验检测细胞迁移能力变化；（*P < 0.05;**P<0.01;***P<0.001）。缩写：OE-OIT3: Overexpress OIT3：过表达OIT3；ctrl：Control：对照组。
图6是对OIT3在肝癌中发挥的调控机制进行探索，可见OIT3改变后诸多生物学机制发生了变化，其中最明显的是花生四烯酸的变化，这提示OIT3可以通过调控脂肪酸代谢参与肝癌发生发展。
本实施例说明OIT3引物序列的确定及qRT-PCR检测OIT3在肝癌细胞中的表达情况。
OIT3引物序列于
Primer Bank（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html）中获得,并进一步制成引物。
Forward Primer:TGTTCTGCTTACATCAGCCTG
Reverse Primer:GTTGTCACATAGAGGAGGACCT。
总RNA提取：
细胞处理之后，将培养皿中的培养基弃去，并用PBS将培养皿洗涤3遍，随后将1 mlTRIZOL加入培养皿中，并置于冰上约5-10min，再将细胞从培养皿中吹打下来，最后用移液器将其转移至1.5 ml EP管中，常温放置2分钟后用黄枪头加入氯仿（三氯甲烷）0.2ml（1/5Trizol体积），用手剧烈震摇15秒，室温放置5min后用高速离心机以4℃、12000g速度离心15min后可见分层；
随后用黄枪头小心收集上层水相约0.3 ml置于另一1.5ml灭酶EP管中（避免吸入中间层和有机相）；
各管分别加入0.3 ml异丙醇（等体积），用力震荡使其充分混匀，置室温10min；（提前将异丙醇4℃预冷，或混匀后置-20℃ 60min，提取效果更好）；随后用高速离心机以4℃、12000g速度进行离心10min，可见RNA沉淀；
倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶乙醇1ml，用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起洗涤，后以4℃、7500g速度离心5min，弃上清，再次重复用75%灭酶乙醇清洗，弃上清后沉淀即为总RNA，真空干燥约4min或空气中干燥5~10min，加入20μl DEPC水，并取少量用微量核算测量仪Nanodrop测所提取的RNA的浓度及纯度鉴定，其余于-80℃保存备用。值得注意的是，如果提取肝癌组织的总RNA，应使用组织研磨仪，并使用研磨珠和TRIZOL彻底将肝癌组织研磨完全。
mRNA逆转录反应和mRNA检测试验
所需试剂：FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（KR106）及SuperReal荧光定量检测试剂盒（FP209）从北京天根生化公司购买；采用八连排进行qRT-PCR反应。
mRNA cDNA第一链合成反应：
反转录体系1
Figure 8659DEST_PATH_IMAGE002
反转录体系2
Figure 398183DEST_PATH_IMAGE003
将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min；95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到cDNA。
mRNA检测程序：
反应体系
Figure 137600DEST_PATH_IMAGE004
real-time PCR反应程序
Figure 561759DEST_PATH_IMAGE005
总结：
总而言之，由上述实验结果可以得出结论：
1. OIT3在肝癌组织中处于低表达状态，其表达水平越低，患者临床预后越差；
2. OIT3在肝癌细胞中的表达水平低于普通肝细胞；
3. OIT3是抑癌基因：过表达OIT3对于肝癌细胞的增殖、迁移以及侵袭均有抑制作用。
4. OIT3可以通过调控脂肪酸（花生四烯酸）代谢参与对肝癌发生发展的调节作用。
因此，OIT3基因作为诊断肝癌的标志物，使肝癌诊断更加准确、快速，本发明的OIT3基因可以为肝癌的诊断提供新的指标，同时OIT3或许可以作为制备治疗肝癌药物的靶向药物提供新的思路。
综上所述，本发明的肝癌肿瘤标志物能够使得肝癌诊断简便准确快速，提高肝癌早期诊断水平，适于临床上推广应用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述肝癌肿瘤标志物为OIT3；所述OIT3在肝癌患者外周血及肝癌组织中的表达水平采用qRT-PCR的方法进行检测；
其中OIT3在肝癌组织中处于显著低表达状态，且与肝癌细胞的肿瘤生物学行为密切相关。
2.根据权利要求1所述的一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤生物学行为为增殖、迁移和侵袭。
3.根据权利要求2所述一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述肝癌肿瘤标志物OIT3在肝癌组织中处于低表达状态，且其表达水平与肝癌患者的临床预后显著相关。
4.根据权利要求1所述一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述标志物可通过设计引物序列作为肝癌检测试剂盒的关键组分之一，并对肝癌患者临床样本进行该肿瘤标志物的检测。
5.根据权利要求4所述一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述临床样本包括外周血及肝癌组织标本，应在临床上进行相关样本的收集，其中外周血样本的收集程序如下：
研究对象空腹静脉血2.5-3.5 mL于促凝管中，室温垂直静置25-35min后，常温下1450-1550 r/min离心8-12 min，吸取上层液体至标记好的EP管中，-80℃保存备用。
6.根据权利要求5所述的一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述肝癌标本的收集程序如下：切取新鲜肝癌组织保存于-80℃，以备后续用TRIzol试剂进行各血清样本及肝癌组织样本总RNA的提取。
7.根据权利要求6所述的一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述OIT3引物序列：
ForwardPrimer：TGTTCTGCTTACATCAGCCTG;
Reverse Primer：GTTGTCACATAGAGGAGGACCT；
根据引物采用荧光定量PCR（qRT-PCR）对患者的肝癌组织及外周血标本进行OIT3表达水平的检测。
8.根据权利要求1所述的一种新的肝癌肿瘤标志物，其特征在于，所述肝癌肿瘤标志物在作为肝癌检测诊断试剂中的应用及临床预后预测模型中的价值。
9.一种如权利要求1-8任一项所述肝癌肿瘤标志物的检测在肝癌诊断中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用可根据OIT3的表达水平对肝癌患者进行早期筛选并进行临床预后的预测指标，具有临床转化价值。
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