CN106318945B - 由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物及复发预测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物及复发预测方法，所述复发标志物由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物，其特征在于，由血浆中多种核酸分子组成，每种所述的核酸分子，编码至少一个microRNA序列；所述的多种核酸分子包含let‑7e,miR‑125b,miR‑148a,miR‑21,miR‑222,miR‑26a,miR‑126和miR‑16。本发明能够在II、III期胃癌患者的循环中发现有预测价值的microRNA标志物，能够快速、准确、低成本地预测复发高危患者，为术后个体化辅助化疗提供参考；能够方便应用于临床，快速有效的在术前检测患者复发风险，检测外周血为非侵入性检查，创伤小，患者易于接受。
Description
技术领域
本发明涉及由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物以及复发预测方法。
背景技术
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居所有恶性肿瘤的第四位，病死率位居第二位。2008年，全球新增胃癌病例达98.9万，死亡病例达73.8万(A Jemal,etal.(2011)CA:a cancerjournal for clinicians 61,69-90)。尽管其全球发病率有逐年下降的趋势，但亚洲地区仍然为胃癌的高发区。我国是胃癌的高发国家之一，发病数占全球42％(CF Bosman FT,Hruban RH,Theise ND..(2010))。胃癌病情隐匿，多数患者早期无特异性症状，限制了胃癌的早期发现，使大多数患者就诊时已属于晚期。
胃癌的治疗主要以采取外科手术切除为主的综合治疗手段(Y Shi,et al.(2010)Journal of surgical oncology 101,687-692)，传统的治疗，包括手术、放疗以及化疗在早期胃癌的治疗上取得了一定进展，但对于诊断时已处于进展期、伴有深度浸润或淋巴结转移的胃癌患者，即使根治性切除术，仍有多数在术后发生复发或转移，而复发转移后患者的生存时间较少超过一年，成为限制胃癌术后生存率的最关键因素。术后辅助放化疗针对的是手术不能完全清除的微转移灶，但若对所有的病人均进行术后辅助治疗，不但带来沉重的社会经济负担，也使很多病人生存质量降低。只有有效区分将高复发风险与低复发风险的病人，实施个体化治疗，对高复发风险的病人加强术后辅助治疗，对于低风险患者减少过度治疗而不增加复发风险，才能有效降低术后复发率，提高患者生存质量。
然而，胃癌是一种高度异质性的疾病，有相似的临床特征的患者往往临床结局差异很大。目前传统的TNM分期系统在预测胃癌患者，尤其是II期和III期患者的复发及预后方面已经表现出明显的局限性，大约一半的II期患者术后三年会发生复发，而仍有约三分之一的患者术后三年不会复发。根据传统的治疗方案，一部分早期患者可能能够从术后辅助化疗中获益，而相反，有些低复发风险的进展期患者可能接受了原本不必要的辅助化疗，并为此接受化疗的毒性和风险带来的生活质量下降。因此，探索胃癌预测术后复发转移的新的标志物，区分出高复发风险的患者对于提供更有效、个体化的胃癌术后治疗十分必要。
microRNA是一类广泛存在于生物体内，序列长度为19-25个不编码蛋白质的单链核苷酸。成熟的microRNA能够识别特定的靶向mRNA3’非编码区，并与之结合，如果两者碱基互补，则可使mRNA降解，如不完全互补，则抑制靶mRNA翻译，影响蛋白质表达水平，但不影响靶mRNA的稳定性(VN Kim,et al.(2009)Nature reviews.Molecular cell biology 10,126-139)。近年来研究表明，肿瘤迁移、侵袭、粘附、上皮-间质转化以及转移瘤增殖等多个肿瘤转移关键步骤中均有microRNA参与调控，起到类似癌基因或抑癌基因的作用(MVIorio,et al.(2009)Journal of clinical oncology:official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology 27,5848-5856)。例如，let-7家族在多种肿瘤中通过负向调节Ras，Myc和JAK等通路抑制肿瘤增殖(X Wang,et al.(2012)Oncologyletters 3,955-960)。miR-222则可以通过抑制RECK(N Li,et al.(2012)FEBS letters586,722-728)和PTEN(Z Chun-Zhi,et al.(2010)BMC cancer 10,367)促进肿瘤增殖。
初步的研究表明，组织microRNA在胃癌诊断和预测预后以及治疗疗效预测方面可能具有良好的应用前景。Li等(X Li,et al.(2010)Gut 59,579-585)检测了100例胃癌患者的癌组织标本中7种microRNA分子(miR-10b、miR-21、miR-223、miR-338、let-7a、miR-30a-5p和miR-126)的表达。通过计算每种microRNA分子的表达量，算出每例患者的危险评分。发现这7种microRNA分子的表达与患者的总体生存率和无病生存率明显相关。Ueda T等(TUeda,et al.(2010)The lancet oncology 11,136-146)用microRNA微阵列分析来自日本的两个独立的患者组的353份胃组织样本，发现Let-7g和miR-433的低表达、以及miR-214的高表达在所有存活的患者中与的转归相关，并和浸润深度、淋巴结转移和临床分期等临床协变量相互独立。以上证据均提示microRNA有希望成为胃癌进展和预后相关的肿瘤标志物。
循环miRNA由于其在循环中的稳定性、肿瘤特异性的表达谱、无创性和可重复性，被认为是潜在的肿瘤诊断和预后判断的标志物(PS Mitchell,et al.(2008)Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 105,10513-10518,X Chen,et al.(2008)Cell research 18,997-1006)。循环miRNA主要来源于肿瘤细胞，通过漏出或微囊泡介导的主动转运进入外周循环(H Valadi,et al.(2007)Nature cell biology 9,654-659)。据报道，有些miRNA在微囊泡中的含量远高于其来源的肿瘤细胞，提示miRNA可能选择性的在微囊泡中富集(H Valadi,et al.(2007)Nature cellbiology 9,654-659)。因此，循环中miRNA的表达谱和预测作用可能与肿瘤组织中有所区别。另外，由于循环miRNA来源于肿瘤中所有细胞而不是一部分细胞，而研究组织miRNA时仅需从一小块组织中分离，研究循环miRNA能够降低实体肿瘤异质性带来的影响。
已有大量的研究试图寻找能够作为胃癌标志物的循环miRNA(HS Liu,et al.(2014)World journal of gastroenterology:WJG 20,12007-12017)。然而，这些研究大多关注胃癌的早期诊断，仅有极少数的研究关注胃癌的复发和预后。既往研究报道，循环miR-21(S Komatsu,et al.(2013)Anticancer research 33,271-276,GJ Ma,et al.(2013)Asian Pacific journal of cancer prevention:APJCP 14,7551-7554),miR-200c(MValladares-Ayerbes,et al.(2012)Journal of translational medicine10,186),miR-146a,miR-148a(SY Kim,et al.(2013)The Journal of molecular diagnostics:JMD 15,661-669),miR-17-5p和miR-20a(M Wang,et al.(2012)Molecular medicine reports 5,1514-1520)与胃癌的预后、转移和治疗效果有关，但这几项研究样本量均较少，且缺乏验证，因此限制了应用的价值。另外，在前人关于miRNA模型和其他肿瘤的研究中，人们发现将多个miRNA综合建立模型与单个miRNA相比能够明显提高诊断或预测的准确性(J Zhou,etal.(2011)Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology 29,4781-4788,Z Hu,et al.(2010)Journal ofclinical oncology:official journal of the American Society of ClinicalOncology 28,1721-1726,J-X Zhang,et al.(2013)The lancet oncology 14,1295-1306)。虽然有几项miRNA模型早期诊断胃癌的研究已经取得了令人振奋的结果(MY Song,et al.(2012)PloS one 7,e33608,A Shiotani,et al.(2013)British journal ofcancer 109,2323-2330,C Zhu,et al.(2014)British journal of cancer,Y Yin,et al.(2012)International journal of molecular sciences13,12544-12555),但目前为止仍未见预测胃癌复发或预后的miRNA模型报道。
因此，仍然有必要在II、III期胃癌患者的循环中发现有预测价值的microRNA标志物，通过多个microRNA标志物联合应用建立胃癌复发预测模型，从而快速、准确、低成本地预测复发高危患者，为术后个体化辅助化疗提供参考。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一个新的II、III期胃癌复发标志物；
本发明的第二个目的是提供一种II、III期胃癌复发预后预测方法；
本发明的第三个目的是提供一种用于预测II、III期胃癌复发的试剂盒，以克服现有技术存在的不足，满足临床应用的需要。
在第一方面，本发明所述的II、III期胃癌复发标志物，由血浆中多种核酸分子组成，每种所述的核酸分子，编码至少一个microRNA序列；
优选的，所述的多种核酸分子包含let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126和miR-16；
本发明还包含一个回归模型，所述的回归模型为：logitP_7miRNA classifier＝a0+a1*let-7e+a2*miR-125b+a3*miR-148a+a4*miR-21+a5*miR-222+a6*miR-26a+a7*miR-126；
其中：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的数值是以qRT-PCR检测结果的CT值减去内参miR-16的CT值得到；
系数为：
a0为2.408～2.448，优选2.427～2.429；
a1为0.073～0.113，优选0.092～0.094；
a2为-0.237～-0.197，优选-0.218～-0.216；
a3为0.235～0.275，优选0.254～0.256；
a4为-0.363～-0.323，优选-0.344～-0.342；
a5为-0.041～-0.012，优选-0.028～-0.026；
a6为-0.060～-0.030，优选-0.046～-0.044；
a7为-0.185～-0.145，优选-0.166～-0.164。
第二方面，所述的II、III期胃癌复发预后预测的方法，是包括采用所述的II、III期胃癌复发标志物、由肿瘤T分期、肿瘤N分期、肿瘤最大径长度和是否有脉管侵犯所组成的数据进行的；
优选的，所述方法，还包含两个回归模型：
(1)logitP_7miR+pathological factors index＝b0+b1*logitP_7miR+b2*N+b3*size+b4*T4+b5vascular invasion；
(2)logitP_7miR+pathological factors index(without N)＝c0+c1*logitP_7miR+c2*size+c3*T+c4*vascular_invasion；
其中：
logitP_7miR为logitP_7miRNA classifier的缩写，其数值以logitP_7miRNAclassifier公式计算得到。
N根据患者病理分期得到，无淋巴结转移定义为1，有淋巴结转移定义为2；
T根据患者病理分期得到，浸润浆膜层或更浅定义为1，突破浆膜层定义为2；
size根据患者病理报告得到，为肿瘤测量最大径，单位厘米；
vascular_invasion根据患者病理报告得到，有脉管侵犯定义为1，无脉管侵犯定义为0；
系数：
b0为-7.983至-7.943，优选-7.964至-7.962；
b1为1.071-1.111，优选1.090-1.092；
b2为2.328-2.368，优选2.347-2.349；
b3为0.361-0.391，优选0.375-0.377；
b4为0.886-0.926，优选0.905-0.907；
b5为0.765-0.805，优选0.784-0.786；
c0为-3.512至-3.472，优选-3.493至-3.491；
c1为0.964至1.104，优选0.983至0.985；
c2为0.336至0.365，优选0.350至0.352；
c3为0.818至0.858，优选0.837至0.839；
c4为1.159至1.199，优选1.178至1.180；
根据患者胃癌根治性手术及病理检测结果，若胃癌根治术中淋巴结清扫数目大于等于16个的患者优选logitP_7miR+pathological factors index，(即模型1)计算结果大于等于0.0192，可判定为高复发风险，结果小于0.0192，则判定为低复发风险。若胃癌根治术中淋巴结清扫数目小于16个的患者优选logitP_7miR+pathological factors index(without N)(即模型2)，计算结果大于等于-0.1914，则判定为高复发风险，结果小于-0.1914，则判定为低复发风险。
第三方面，本发明公开了一种用于预测II、III期胃癌复发的检测试剂盒，由血浆中多种核酸分子组成，每种核酸分子编码至少一个microRNA序列；
在优选的实施方案中，所述的多种核酸分子包含let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126和miR-16。
最优选的，所述检测试剂盒还包含如下的回归模型：
logitP_7miRNA classifier＝a0+a1*let-7e+a2*miR-125b+a3*miR-148a+a4*miR-21+a5*miR-222+a6*miR-26a+a7*miR-126；
其中：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的数值是以qRT-PCR检测结果的CT值减去内参miR-16的CT值得到；
系数：
a0为2.408～2.448，优选2.427～2.429；
a1为0.073～0.113，优选0.092～0.094；
a2为-0.237～-0.197，优选-0.218～-0.216；
a3为0.235～0.275，优选0.254～0.256；
a4为-0.363～-0.323，优选-0.344～-0.342；
a5为-0.041～-0.012，优选-0.028～-0.026；
a6为-0.060～-0.030，优选-0.046～-0.044；
a7为-0.185～-0.145，优选-0.166～-0.164。
本发明还涉及一种用于预测II、III期胃癌复发的检测试剂盒，包括所述的由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物、回归模型(1)：logitP_7miRNA classifier＝a0+a1*let-7e+a2*miR-125b+a3*miR-148a+a4*miR-21+a5*miR-222+a6*miR-26a+a7*miR-126；
其中：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的数值是以qRT-PCR检测结果的CT值减去内参miR-16的CT值得到；
系数为：
a0为2.408～2.448，优选2.427～2.429；
a1为0.073～0.113，优选0.092～0.094；
a2为-0.237～-0.197，优选-0.218～-0.216；
a3为0.235～0.275，优选0.254～0.256；
a4为-0.363～-0.323，优选-0.344～-0.342；
a5为-0.041～-0.012，优选-0.028～-0.026；
a6为-0.060～-0.030，优选-0.046～-0.044；
a7为-0.185～-0.145，优选-0.166～-0.164和以下两个回归模型：
(1)logitP_7miR+pathological factors index＝b0+b1*logitP_7miR+b2*N+b3*size+b4*T4+b5vascular invasion；
(2)logitP_7miR+pathological factors index(without N)＝c0+c1*logitP_7miR+c2*size+c3*T+c4*vascular_invasion；
其中：
N根据患者病理分期得到，无淋巴结转移定义为1，有淋巴结转移定义为2；
T根据患者病理分期得到，浸润浆膜层或更浅定义为1，突破浆膜层定义为2；
size根据患者病理报告得到，为肿瘤测量最大径，单位厘米；
vascular_invasion根据患者病理报告得到，有脉管侵犯定义为1，无脉管侵犯定义为0；
系数：
b0为-7.983至-7.943，b1为1.071-1.111，b2为2.328-2.368，b3为0.361-0.391，b4为0.886-0.926，b5为0.765-0.805，c0为-3.512至-3.472，c1为0.964至1.104，c2为0.336至0.365，c3为0.818至0.858，c4为1.159至1.199；
logitP_7miR其数值是以数值是以logitP_7miRNAclassifier公式计算得到。
本发明的有益效果是：
本发明能够在II、III期胃癌患者的循环中发现有预测价值的microRNA标志物，通过多个microRNA标志物联合应用，建立胃癌复发预测模型，从而能够快速、准确、低成本地预测复发高危患者，为术后个体化辅助化疗提供参考；能够方便应用于临床，快速有效的在术前检测患者复发风险，检测外周血为非侵入性检查，创伤小，患者易于接受。血浆microRNA与临床病理因素结合能更好的预测复发，而且目前国际上尚无预测胃癌术后复发的模型，实体肿瘤具有异质性，循环microRNA相比组织取材能更全面的反映肿瘤的遗传学特征，本发明基于的研究样本量大，研究样本来自不同地域多中心，有独立验证组，结果可信。
附图说明
图1为获得标志物和预测新方法的分析流程图，
图2为miRNA classifier和7miR+pathological factors index的ROC和K-M曲线。其中：第一行为训练集，第二行为验证集，第三行为合并集数据，第一列为7miRNAclassifier的ROC曲线，第二列为7miRNA classifier的K-M曲线，第三列为7miR+pathological factors index的ROC曲线，第四列为7miR+pathological factors index的K-M曲线。
图3为ROC曲线比较，即7miRNA classifier，7miR+pathological factors index与临床病理因素比较。
图4为根据病理分期分层的ROC和K-M曲线，第一行为II期患者数据，第二行为III期患者数据，第一列为7miRNA classifier的ROC曲线，第二列为7miRNA classifier的K-M曲线，第三列为7miR+pathological factors index的ROC曲线，第四列为7miR+pathological factors index的K-M曲线。
图5为IIA期患者的ROC和K-M曲线，第一行为ROC曲线，第二行为K-M曲线，第一列为7miRNA classifier的数据，第二列为7miR+pathological factors index的数据。
图6为不含淋巴结分期的模型的ROC和K-M曲线，第一行为训练集，第二行为验证集，第三行为合并集数据，第一列为ROC曲线，第二列为K-M曲线。
具体实施方式
本发明将从以下详细描述中变得更为明。
本发明原理如下：
如图1所示，为获得本发明II、III期胃癌复发标志物，II、III期胃癌复发预后预测的新方法的分析流程图。
纳入407例临床样本共来源于三个临床中心；应用ABI miRNA microarray芯片检测5对II期复发和III期不复发的胃癌患者血浆miRNA差异表达；应用Taqman Low DensityArray(TLDA)检测58个II、III期胃癌患者中候选差异miRNA和候选参照的表达；应用qRT-PCR检测训练集170例患者血浆差异miRNA表达，综合临床病理因素，通过Logistic回归建立模型，在验证集169例患者中进行验证，并通过ROC曲线分析、生存分析、分层分析等方法分析模型预测效能。
纳入患者标准见表1，各阶段纳入患者的特征见表2。
首先，本发明使用Taqman Array Gene Signature Cards(Human A+B CardSetv3)对10例来自复旦大学附属肿瘤医院的性别年龄匹配的胃癌患者(5例II期复发患者，5例III期不复发患者)进行血浆miRNA筛选，确定25个候选miRNA，7个候选qRT-PCR参照，在复旦大学附属肿瘤医院58例性别、年龄、分期频率匹配的患者血浆通过Taqman LowDensityArray(TLDA)进行验证。
发现集中根据最佳参照miR-16选择11个候选miRNA继续在训练集中通过qRT-PCR进行检测，并对每个miRNA与是否复发进行单因素logistic回归分析，发现其中7个miRNA有统计学意义。继而对这7个miRNA进行多因素logistic分析，单因素和多因素分析的结果以及通过曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)描述的预测准确性见表3。
通过多因素逐步logistic回归建立模型预测胃癌复发的风险。复发的可能性通过以上单因素有意义的7个miRNA预测，即logitP_7miRNA classifier纳入let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126。当将所有预测胃癌复发单因素有意义的临床病理因素都纳入时，如上建立的7个miRNA组成的预测模型仍为独立预测因子。7miRNA预测模型和临床病理因素的单因素和多因素分析的结果以及通过AUC描述的预测准确性见表4。通过以上多因素logistic回归结果，进一步建立了含miRNA的综合预测模型,即logitP_7miR+pathological factors纳入logitP_7miR，N,size,T,vascular invasion。7miRNAclassifier和7miR+pathological factors index预测模型的预测效能通过ROC曲线分析评价，见图2。曲线的切点定义为约登指数最大的点，即灵敏度+特异度-1数值最大。7miRNAclassifier和7miR+pathological factors index预测模型的切点分别为0.0304和0.0192.根据模型的切点，将患者区分为高危组和低危组。
定义可疑值范围以增加模型的灵敏度和特异度，分别为-0.4963到0.1089和-0.5910到0.1801。与预期相符，两个模型中预测的高危患者都出现了更高的复发比例，见表4。在生存分析中，7miRNA classifier和7miR+pathological factors index预测模型中高危患者的DFS及OS较低危患者均显著缩短，见图2及表4.
为了验证7miRNA classifier和7miR+pathological factors两个预测模型预测胃癌患者复发及预后的能力，在另一个独立的队列中检测这7个miRNA的表达，并计算7miRNA classifier和7miR+pathological factors两个模型。训练集中获得的参数和切点直接运用于验证集中以此预测胃癌患者复发的风险。两模型仍较准确，且高危组均呈现更高的复发率，图2。当把训练集和验证集的患者合并之后，结果仍相似。7miRNA classifier和7miR+pathological factors两个预测模型均有较好的预测准确性，预测的高危患者均复发率较高，DFS和OS较短。
为了研究7miRNA classifier是否为预后的独立预后因素，首先对DFS进行了单因素COX分析，在训练集、验证集和合并集中，7miRNA classifier均与DFS显著相关。纳入所有单因素有意义的临床病理因素，继续分析了多因素COX回归。结果发现，当纳入所有有意义的因素后，除7miRNA classifier在验证集中仅有边界统计学意义外两模型在其他集合对DFS和OS均为独立危险因素，见表5。7miRNAclassifier模型与任意单个miRNA或有意义的临床病理因素相比预测效能均更好，详见表3及图3。加入7miRNA classifier与单纯的合并临床病理因素相比亦能增加预测效能。因此，7miRNAclassifier能够在传统预后因子的基础上增加预测的价值。
为了探究7miRNA classifier和7miR+pathological factors index能否在II期和III期内预测复发，用合并集的数据进行了分层分析。对于7miR+pathological factors模型，AUC在II期患者和III期患者中没有统计学差异。7miRNA classifier模型对于II期患者比对III期患者更准确，图4，表6。
值得注意的是，两个模型在IIA期患者中都有较高的准确性。其中7miRNAclassifier的AUC为0.892(95％CI:0.765-1.000),灵敏度为0.833,特异度为0.839,诊断准确度为0.838,阳性预测值为0.500,阴性预测值为0.963。对于7miR+pathological factors模型，AUC为0.867(95％CI:0.721-1.000),灵敏度为0.400,特异度为1.000,准确度为0.914,阳性预测值为1.000,阴性预测值为0.909。见图5及表7。DFS生存分析表明，两模型预测的高危人群DFS显著缩短。7miRNA classifier预测10人复发，其中复发5人；预测27人不复发，其中复发1人；7miR+pathological factors index预测2人复发，全部发生复发；预测33人不复发，其中3人复发，如图5可见两个模型都达到了较高的预测效能。OS的分析结果类似，高危人群OS显著缩短，log-rank P均<0.001。
考虑到有些低复发率地区相当一部分患者未能接受标准的D2淋巴结清扫术，在这些患者中，由于清扫的淋巴结数目少于16个，TNM分期中的N分期可能不准，导致预测预后的情况不准确。因此，进一步建立了另一个包含7miRNA classifier和除N分期以外的临床病理因素的复发预测模型，以此对未能接受D2淋巴结清扫术的胃癌患者提供预测复发及预后的建议。在对包含7miRNA classifier和除N分期以外的临床病理因素进行多因素logistic回归后，建立如下模型：logitP_7miR+pathological factors(without N)包含logitP_7miR，size，T，vascular_invasion.在训练集、验证集和合并集中，该模型均表现出较高的判断复发的准确性，图6，各集合灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度见表8。最佳切点为-0.1914，切点区分的高危组较低危组相比预后更差。
表1.患者入组条件
表2.纳入患者的临床病理特征
缩写:TLDA:TaqMan Low DensityArray；DFS:disease free survival；OS:overall survival.
表3.建模组单因素及多因素logistic回归结果
缩写:AUC:area under the curve；OR:odds ratio.
表4.训练集及验证集中两模型预测复发及预后效能
缩写:AUC:area under the curve；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.
继表4.训练集及验证集中两模型预测复发及预后效能
缩写:AUC:area under the curve；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.
表5. DFS多因素COX分析
Abbreviations:HR:harzard ratio.
续表5. DFS多因素COX分析
表6.模型预测效能的分层分析
Abbreviations:AUC:area under the curve；PPV:positive predictive value；NPV:negative predictive value；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.
继表6.模型预测效能的分层分析
Abbreviations:AUC(area under the curve):曲线下面积；PPV(positivepredictive value)：阳性预测值；NPV(negative predictive value)：阴性预测值；OR(odds ratio)：比数比；HR(harzard ratio)：危险比.
表7.模型在IIA期患者中的预测效能
缩写:AUC:area under the curve；OR:odds ratio；HR:harzard ratio.
续表7.模型在IIA期患者中的预测效能
表8.无N分期模型的预测效能
缩写:AUC(area under the curve):曲线下面积；OR(odds ratio)：比数比；HR(harzard ratio)：危险比.
续表8.无N分期模型的预测效能
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物及一种II、III期胃癌复发预后预测的新方法。
使用试剂盒和新方法预测II、III期胃癌患者术后3年是否复发的具体步骤如下：
1.血浆样本制备
1)采集外周血4mL(采血时间一般为早晨),迅速转入EDTA抗凝管中(不超过30分钟),涡旋或用移液器混匀。
2)离心机820g,4摄氏度,离心10分钟。此步骤在1小时(室温条件下)或2小时(4摄氏度条件下)内需完成。
3)吸约1mL上清转至洁净的1.5mL离心管中,16000g,4摄氏度,离心10分钟,将所有杂质沉淀下来,小心吸取上清到新的离心管中,置于.80摄氏度冰箱保存备用。
2. RNA抽提
mirVanaTM PARISTM Kit(Applied Biosystem,p/n AMl556)提取总RNA,NanoDrop1000Spectrophotometer测定总RNA浓度。方法如下:
1)在2×变性液中添加375μl β-巯基乙醇,混匀后放置备用；在miRNA WashSolution 1中添加21mL无水乙醇,混匀后放置备用；在Wash Solution2/3中添加40mL无水乙醇,混匀后放置备用。
2)取适量的血浆(芯片检测800μl，TLDA检测400μl，qRT-PCR检测150μl),加入等量的2×变性液,涡旋混匀,冰上放置5分钟。
3)添加与总体积等量的酚/氯仿,涡旋混匀30-60秒,室温,最高转速离心5分钟。
4)小心吸取上清到新的1.5mL离心管中,添加1.25倍体积的无水乙醇,涡旋混匀。
5)将洁净的离心柱放置到洁净的收集管中,吸取上一步的液体到柱子中,10000g,室温离心30秒,弃流过液,将离心柱重新放置到收集管中。重复该步骤,直到所有的液体过柱。
6)吸取350μlmiRNA Wash Solmion 1到离心柱中,10000g,室温离心15秒,弃流过液,将离心柱重新放置到收集管中。
7)混合l0μlDNaseI stocksolution和70μlBufferRDDQIAGEN(#79254)80μl加到离心柱中的膜上,25℃放置15min。
8)吸取350μlmiRNAWash Solution 1到离心柱中,10000g,室温离心15秒,弃流过液,将离心柱重新放置到收集管中。
9)500μl Wash Solution 2/3过柱两次,空柱离心1分钟。将离心柱放置到新的收集管中,柱中心加入50μl 95℃预热的Elution Solution或nuclease-free水,室温最高转速离心20-30秒,收集管中的液体即为提取的总RNA,可放置在-70摄氏度保存。
3.实时荧光定量RT-PCR
3.1 RT反应
1)参照Taqman microRNA RT反应试剂盒说明书,每个样本用150μl血浆提取产物(50μl)上样,反应步骤如下:
2)加入各反应成分后稍作离心混匀,执行如下程序:
3.2 Real-time PCR
1)参照Taqman MicroRNA assays(Applied Biosystems)反应试剂盒说明书在Applied Biosystems 7900HT Fast Real.Time PCR System实时荧光定量PCR仪上进行,反应体系和条件如下:
2)加入各反应成分并充分混匀后稍作离心,在Applied Biosystems 7900HTFastReal-Time PCR System实时荧光定量PCR仪上执行如下程序:
共进行45个循环。
3)60℃时进行荧光数据采集,吸收波长:490nm；释放波长:530nm。Ct值由AppliedBiosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System控制分析软件经过二次衍生法计算而得。
4)获得qRT-PCR读数后使用内参miR-16进行矫正。
4.由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物的计算：let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的数值以miR-16为内参得到的delta CT值。计算公式：
logitP_7miRNA classifier
＝2.438+0.093*let-7e-0.217*miR-125b+0.255*miR-148a-0.343*miR-21-0.027*miR-222-0.045*miR-26a-0.165*miR-126；如编号b9患者，let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126的qRT-PCR检测CT值分别为30.9426,32.199,28.3145,20.2609,26.4205,26.6194和25.412，miR-16的CT值为19.8339，故以上delta CT值分别为11.1087，12.3651，8.4806，0.427，6.5866，6.7855和5.5781，代入以上公式计算得到logitP_7miRNA classifier＝1.40，大于切点0.0304，预测为高复发风险，复发风险为0.80。
5.基于血浆microRNA标志物和临床病理因素的II、III期胃癌复发预后预测：该患者淋巴结清扫数目大于16，故患者复发风险预测值计算采用如下公式：logitP_7miR+pathological factors index＝-7.953+1.091*logitP_7miR+2.348*N+0.376*size+0.906*T+0.785*vascular invasion，其中N根据患者病理分期得到，无淋巴结转移定义为1，有淋巴结转移定义为2；T根据患者病理分期得到，浸润浆膜层或更浅定义为1，突破浆膜层定义为2；size根据患者病理报告得到，为肿瘤测量最大径，单位厘米；vascular_invasion根据患者病理报告得到，有脉管侵犯定义为1，无脉管侵犯定义为0。logitP_7miR为logitP_7miR为logitP_7miRNA classifier缩写，其数值是以logitP_7miRNAclassifier公式计算得到。
该患者病理分期T3N0M0,肿瘤最大径为9cm，无脉管侵犯，故公式中T为2，N为1，vascular_invasion为0，size为9，代入以上公式，计算logitP_7miR+pathologicalfactors index＝0.19，结果大于0.0192，预测为高复发风险，复发风险估计为55％。
Claims (2)
1.由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物，其特征在于，由血浆中多种核酸分子组成，每种所述的核酸分子，编码至少一个microRNA序列；
所述的多种核酸分子为let-7e,miR-125b,miR-148a,miR-21,miR-222,miR-26a,miR-126和miR-16。
2.一种用于预测II、III期胃癌复发的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的由血浆microRNA组成的II、III期胃癌复发标志物。
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| A five-microRNA panel in plasma was identified as potential biomarker for early detection of gastric cancer;Zhu等;《BRITISH JOURNAL OF CANCER》;20140304;第2291页结果部分 |
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| 循环miRNAs作为胃癌诊断潜在生物标志物的筛选;康美云等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20150315;参见对比文件1第77页续附表1，第2页第3段 |
| 微小核糖核酸在胃癌中的研究进展;杨绍广;《海南医学》;20120229;第23卷(第3期);第119页右栏第1段 |
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