CN105316402A - 一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及应用；所述模型包括SEQ？ID？NO.？1-10中一个或多个RNA。本发明通过检测患者mRNA和lncRNA表达水平，可应用于临床判断三阴性患者预后及化疗敏感性。与其他已知与疗效相关的临床病理因素相比，本发明所述模型为一个独立的预测因素；所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。

Description

一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及应用

技术领域

本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及其应用。

背景技术

乳腺癌是全球发病率最高的女性恶性肿瘤，2008年全球乳腺癌新发病例138万，占女性癌症发病总数的23%；死亡人数高达46万，占女性癌症死亡人数的14%。在上海等大中城市，乳腺癌也已经连续20年位于女性恶性肿瘤第一位，严重危害广大妇女健康。据上海市疾控中心数据显示，2004年上海市区粗发病率达10万分之71。2001年Sorlie团队将乳腺癌基于其基因表达差异划分为腔面A、B型，人表皮生长因子受体2（HER2）阳性型，正常乳腺型和基底细胞型，该成果将乳腺癌研究推进至分子分型层面。当前已经公认乳腺癌为一种异质性疾病，专注于某一亚型的研究才能更加准确的阐明其生物学特性，实现精准的个体化治疗；通过免疫组化对雌激素受体（ER），孕激素受体（PR），HER2状态及Ki67检测，临床上也可将乳腺癌划分腔面A、B型，HER2阳性型，三阴性乳腺癌，并与基于基因表达差异有着高度的重合性；其中，三阴性乳腺癌为ER，PR,HER2表达全为阴性，约占所有乳腺癌的10%-20%。相比较于其他类型乳腺癌，上述三阴性乳腺在年轻患者中更为常见，其侵袭性更强，表现为更大的肿瘤，更高的分级，更多的淋巴结累及等。已有研究表明，三阴性乳腺癌可进一步划分为6个亚型，每个亚型都有各自独特的表达谱差异及不同的药物敏感性。由于三阴性乳腺癌存在着极大的异质性以及缺乏有效的治疗方法，目前其治疗依旧存在着许多挑战。目前临床治疗中，化疗是三阴性乳腺癌唯一的全身治疗方法；尽管相比较于其他亚型乳腺癌，三阴性乳腺癌患者接受新辅助治疗有着较高的缓解率，但是其依旧表现为更高的局部复发率和远处转移率；即使在三阴性乳腺癌内，不同患者对于化疗的敏感性及临床预后也存在着极大的差异；而目前缺乏有效的手段对此进行区分；因此，对于这群患者而言，研究高度敏感，特异的预后预测生物标记物将具有重要的临床意义。

目前，公认长链非编码RNA(lncRNA)是一类序列长度大于200nt的非编码RNA；已有研究证实lncRNA在基因调控及各种细胞代谢途径中起着重要的作用；而lncRNA在乳腺癌中的作用也被广泛的关注，一些新的理论机制也被提出。有研究表明，所述lncRNA在乳腺癌组织与配对的正常组织间有着明显的表达谱差异；通过对目标基因表达的调控，lncRNA能使得肿瘤呈现更加恶性的表型。Gupta团队发现一个lncRNA(HOTAIR)在乳腺癌原发灶和转移灶中表达都明显升高，并且其在原发灶中的表达水平是个强有效的转移和死亡的预测因子；另一个lncRNA（GAS5）也被证实在乳腺癌组织中特异性低表达，同时其在乳腺癌细胞系中高表达后能抑制凋亡及增值。近年来，越来越多的研究证实了lncRNA作为生物标记物预测肿瘤患者预后的可行性。

本发明人首先运用全转录组芯片技术筛选出候选的mRNA和lncRNA，首次构建了mRNA联合lncRNA的预测模型；该模型可对三阴性乳腺癌患者其预后进行预测并划分高低危人群，同时可预测患者对于紫杉化疗的敏感性从而减少过度治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型，确定了一种能在癌组织中检测的、有较高预测准确度的三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的分子标记物。

本发明的预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型，其特征在于，所述模型包括SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA。

本发明的另一个目的是提供所述的模型在预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性中的应用，包括：制备采用实时定量PCR、试剂、试剂盒或芯片预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的产品；

其中，

所述采用实时定量PCR预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的产品含有针对SEQ ID No. 1-10中一对或多对RNA特异性引物；

所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的试剂含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸；

所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的试剂盒含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸；

所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的芯片含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸；

所述芯片或试剂或试剂盒通过下述方法预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性，检测癌组织样品中SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA的表达水平，预测三阴性乳腺癌患者预后及对化疗的敏感性。

本发明还提供了所述的mRNA联合lncRNA模型构建与鉴定方法:

（1）提取获得的癌组织的RNA样本；

（2）纯化组织的RNA样本；

（3）RNA质量控制：用NanoDrop 2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量；

（4）采用全传录组芯片检测所述乳腺癌与癌旁组织，进行过滤，标化处理后，去除差异表达倍数不明显的探针，再利用生物信息学分析获得癌与癌旁组织差异表达的RNA，包括mRNA和lncRNA；对另组三阴性乳腺癌癌组织进行HTA2.0芯片检测，将该结果与上述癌组织结果组成训练集，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个差异表达RNA与患者无复发生存的关系，筛选其中差异表达以及与疾病RFS相关的RNA（如SEQ ID No. 1-10所示）；

（5）计算上述10个RNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者RFS的风险指数，根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，判断患者复发风险大小，并依该预测患者对于紫杉为基础化疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价；

（6）将上述所得的RNA模型及计算公式，在三阴性乳腺癌患者中进行验证：获取独立的另组三阴性患者的癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQ ID No. 1-10所示RNA的表达量，并利用GAPDH作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个RNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；判断每位患者的复发风险，同时预测其对紫杉为基础化疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对RNA模型的预测效能进行评价。

具体而言，本发明所述的mRNA联合lncRNA模型构建与鉴定方法的步骤为:

（1）收集三阴性乳腺癌患者的手术切除癌组织标本；

（2）提取获得的组织的RNA样本；

（3）纯化组织的RNA样本；

（4）RNA质量控制：用NanoDrop 2000光谱仪定量(NanoDrop Technologies, Waltham, MA)检测提取的总RNA的浓度及质量；

（5）将33对三阴性乳腺癌癌与癌旁组织进行全传录组芯片（Affymetrix 公司GeneChip® Human Transcriptome Array 2.0芯片）检测，通过过滤，标化处理等步骤后，将差异表达倍数不明显的探针去除，再利用生物信息学分析获得癌与癌旁组织差异表达的RNA(包括mRNA和lncRNA)；同时对另外132例三阴性乳腺癌癌组织进行HTA2.0芯片检测，将该结果与上述33例癌组织结果一同（共165例三阴性乳腺癌患者）组成训练集，和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个差异表达RNA与患者无复发生存（RFS）的关系，进而筛选出即在三阴性乳腺癌中差异表达，同时又与疾病RFS相关的RNA（如SEQ ID No. 1-10所示）；

（6）计算上述10个RNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者RFS的风险指数（Risk Score（RS））：其指数的计算公式如下：RS=B1*X1+…+B10*X10，其中，X为每个RNA在两分类方法中的赋值，B为每个RNA的权重系数；根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，进而判断患者复发风险大小，并可依该预测患者对于紫杉为基础化疗的敏感性；同时通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价；

（7）将上述所得的RNA模型及计算公式，在独立的另外119例三阴性乳腺癌患者中进行验证：招募119例三阴性患者组成独立的验证集，获取其癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQ ID No. 1-10所示RNA的表达量，并利用GAPDH作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个RNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；依此判断每位患者的复发风险，同时预测其对紫杉为基础化疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对RNA模型的预测效能进行评价。

本发明经过严格细致的研究，构建了一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型；在预测24个月的RFS中，所述mRNA模型和混合模型均呈现出较好预测效能，且明显优于常见的临床病理指标；同时该模型还可预测以紫杉为基础的化疗疗效；与其他已知与疗效相关的临床病理因素相比，所述模型为一个独立的预测因素。本发明所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。临床治疗中，在三阴性乳腺癌患者诊断明确后，即可通过对上述RNA的检测，快速判断患者复发危险度及对于化疗的敏感性，并跟据结果选择合适的治疗方案，实现个体化治疗。

附图说明

图1是本发明实施例一二中mRNA联合lncRNA模型以及其他临床病理信息等因素对于预测三阴性患者RFS的Time-dependent ROC曲线图，其中，结果明显显示相比较于其他预测因素，mRNA联合lncRNA模型具有更大的曲线下面积；注：mRNA panel：单纯mRNA模型；mRNA-lncRNA panel:mRNA联合lncRNA模型；Combined prognostic factors:常见临床病理因素联合；Size：肿瘤大小；Grade：肿瘤分级；Node：淋巴结阳性个数。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照制造试剂盒生产公司所建议的条件或按照常规实验条件，例如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New York; Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件。

实施例 1 ：建立预测模型

一. 实验对象：

本实施例的研究对象选择2011年1月至2012年12月间复旦大学附属肿瘤医院组织库保存的三阴性乳腺癌组织165例，构成训练集，同时包括35例与癌组织配对的癌旁组织。纳入及排除标准为：

(1) 新发女性乳腺癌患者；

(2) 单侧乳腺癌，且病理确诊为三阴性乳腺癌，浸润性导管癌；

(3) 确诊时无转移病灶；无其他肿瘤病史；

(4) 排除其他导管原位癌。

二. 实验方法

采集上述训练集165例患者的手术切除癌组织标本，同时包括35例与癌组织配对的癌旁组织标本；利用Qiagen公司的Rneasy Plus Mini Kit，按照试剂盒说明，抽提RNA样本。抽提后的RNA，利用NanoDrop 2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量；所提取的RNA样本冻存于-80℃的深低温冰箱中。

用美国Affymetrix公司的GeneChip Human Transcriptome Array 2.0 (HTA 2.0)芯片检测三阴性乳腺癌的转录组谱；该芯片可检测出超过285，000个转录本；按照Affymetrix HTA2.0芯片操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行全转录组表达谱的检测。

读取芯片数据后，将原始信号值小于1的都以1替代，以芯片内部参考基因表达为参照对结果进行标化处理；利用33对癌与癌旁组织芯片表达数据，通过Random Variance Model计算出各RNA在癌与癌旁差异表达情况；依此为基础，筛选出癌与癌旁差异表达的RNA。

将上述33例癌组织结果与另外132例癌组织检测结果一同，和患者的临床随访信息相关联，利用COX比例风险回归模型（BRB-Array Tools）计算每个RNA与RFS的相关性。

将筛选出来的RNA通过COX比例风险回归模型，构建预后预测模型，得出RS计算公式：X为每个RNA在两分类方法中的赋值，B为每个RNA的权重系数；RS=B1*X1+…+B10*X10.根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，进而判断患者复发风险大小。通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价。

三. 实验结果

共检测了训练集165例三阴性乳腺癌组织及35例三阴性乳腺癌癌旁组织。

筛选出的RNA基本信息如表1所示，其中包括了8个mRAN和2个lncRNA；

表 1.纳入模型的RNA基本信息

RNA 名

类型

差异倍数

差异 p 值

FDR

Log-rank p 值

权重系数 (B)

SEQ ID No. 1

ABCA8

mRNA

0.24

1.00E-07

9.82E-07

0.01314

0.939

SEQ ID No. 2

CHRDL1

mRNA

0.32

4.70E-06

2.24E-05

0.00076

-2.593

SEQ ID No. 3

ADH1B

mRNA

0.21

1.30E-05

5.30E-05

0.00747

0.517

SEQ ID No. 4

CDK1

mRNA

2.94

< 1E-07

< 1E-07

0.08444

-0.329

SEQ ID No. 5

CDC6

mRNA

2.58

< 1E-07

< 1E-07

0.05540

-0.071

SEQ ID No. 6

SQLE

mRNA

2.36

< 1E-07

< 1E-07

0.01340

0.02

SEQ ID No. 7

FCGR1A

mRNA

2.17

2.00E-07

1.73E-06

0.09257

1.146

SEQ ID No. 8

RSAD2

mRNA

2.19

1.34E-04

3.93E-04

0.04563

1.366

SEQ ID No. 9

SNRPEP4

lncRNA

1.6

1E-07

1.19E-06

0.03241

0.361

SEQ ID No. 10

HIST2H2BC

lncRNA

1.72

< 1E-07

< 1E-07

0.06776

0.277

；

根据得出的模型计算出每位患者的RS值，并利用Time-dependent ROC曲线选取最优界值点为0.22，将患者划分为高危（RF>0.22）和低危（RF<=0.22）；多因素回归分析，校正常见的临床病理指标（如肿瘤大小，分级，淋巴结）后，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的复发风险（HR=10.00,95%CI: 2.53-39.47，P=0.001）.同时Time-dependent ROC曲线评估预测的效用发现，模型相较于常见的临床病理指标及其只包含mRNA的预测模型都具有更好的预测效用(如图1所示)。

实施例 2 ：预测模型的验证

本发明进一步在119例独立的三阴性乳腺癌患者(验证集)中进行了验证。

一 ．实验对象：

本实施例的研究对象选择2009年1月至2010年12月间复旦大学附属肿瘤医院组织库保存的三阴性乳腺癌组织119例，构成验证集；纳入及排除标准为：

(5) 新发女性乳腺癌患者；

(6) 单侧乳腺癌，且病理确诊为三阴性乳腺癌，浸润性导管癌；

(7) 确诊时无转移病灶；无其他肿瘤病史；

(8) 排除其他导管原位癌。

二． 实验方法

采集上述119例患者的手术切除癌组织标本；利用Qiagen公司的Rneasy Plus Mini Kit，按照试剂盒说明，抽提RNA样本；抽提后的RNA，利用NanoDrop 2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量。所提取的RNA样本冻存于-80℃的深低温冰箱中。

将上述采集的RNA样本用Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit (Perfect Real Time),按照试剂盒操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行逆转录，获取cDNA。

根据SEQ ID No.1-10的RNA序列及GAPDH序列设计特异性引物，并使用Takara公司的SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)试剂盒，按照试剂盒操作说明所规定的标准操作步骤，利用实时定量PCR技术检测如SEQ ID No.1-10所示的RNA在所获取的cDNA中的表达量；之后根据GAPDH的表达量，采用-ΔΔCt的方法对所有RNA的表达情况进行校正。根据每个RNA在所有119例组织中表达的中位值，将RNA在各组织内的表达划分为高低表达，并分别赋值为1和0。

将已经完成赋值的RNA表达量，带入上述实施例1中创建的模型内，计算验证集中每位患者的复发风险；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价。

三． 实验结果

通过相关分析，本发明确定了芯片检测与实时定量PCR检测的趋势的一致性；根据上述实施例1的模型计算出每位患者的RS值，并采用实施例1的最优界值点，将患者划分为高危（RF>0.22）和低危（RF<=0.22）；在验证集中，多因素回归分析，校正常见的临床病理指标（如肿瘤大小，分级，淋巴结）后，结果也显示模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的复发风险（HR=5.73,95%CI: 1.17-29.40，P=0.037）；同时Time-dependent ROC曲线评估预测的效用发现，模型相较于常见的临床病理指标及其只包含mRNA的预测模型都具有更好的预测效用(如图1所示)；因此，本发明在独立的119例三阴性患者人群中验证所述的mRNA联合lncRNA模型预测的有效性。

实施例 3 对于紫杉类药物为基础的化疗敏感性的预测作用

本发明进一步测试mRNA联合lncRNA模型是否能够预测紫杉类药物为基础的化疗敏感性。在训练集和验证集中分别进行了交互作用分析；交互作用分析的原理在于若是两项因素间存在着交互作用，则说明二者间存在着依赖关系，其中一个因素的变化能够预测另一项因素的变化情况；结果如表二所示，无论是在训练集中还是在验证集中，是否接受含紫杉类药物的化疗与模型间都存在在明显的交互作用；结果表明，本发明所述的模型对于紫杉为基础化疗与RFS的关系，模型是可预测的。

表二：模型与是否含紫杉类药物化疗间的交互作用分析

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

<120> 一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及应用

<130> 20150331

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5825

<212> DNA

<213> ABCA8

<400> 1

ataacctcca ctctgaaagc agtcttcaca gaaacttttc acagaagtca aatagttaaa 60

gcaaattcta gatacatggt agagaccagg agaaaatatg aataactttc ttctaaacaa 120

ggagctcagt ggataaacca tacctctaga ttccttgctt ccattttccc agaaacaaga 180

tgaggaagag aaagatcagt gtgtgtcaac aaacttgggc cttattatgc aagaactttc 240

ttaaaaaatg gagaatgaaa agagagtcct taatggaatg gctgaattca ttgctcctac 300

tactttgttt gtatatatat cctcatagtc atcaagtaaa tgatttttct tcactgctta 360

ccatggacct gggacgggta gatacattta atgaatccag attttctgtt gtatacacac 420

ctgtcaccaa cacgacccaa cagataatga ataaagtagc ctctactccc ttcctggcag 480

gtaaagaggt cttgggactg ccagatgagg aaagtattaa agaattcaca gcaaattatc 540

ctgaagaaat agtaagagtc acctttacta atacatactc atatcatttg aagttcttgc 600

taggacatgg aatgccagca aagaaggagc acaaggacca tacagctcat tgttatgaaa 660

caaatgaaga tgtttactgt gaagtttcag tattttggaa ggaaggtttt gtggctcttc 720

aagctgccat taatgctgct attatagaaa tcacaacaaa tcactcagtg atggaggagc 780

tgatgtcagt tactggaaaa aatatgaaga tgcattcctt cattggtcaa tcaggagtta 840

taactgattt gtaccttttt tcctgcatta tttcattttc ctcattcatt tactatgcat 900

ctgttaatgt cacaagagag aggaaaagga tgaaggcctt gatgacaatg atgggtcttc 960

gggattcagc gttctggctc tcctggggtt tgctctatgc tggtttcatc ttcattatgg 1020

cccttttctt ggcacttgtt ataagatcta cccagtttat cattttgtct ggcttcatgg 1080

tagtcttcag cctctttctc ctgtatggat tatctttggt agctttggct ttcttaatga 1140

gcatcttggt aaagaaatct ttcctcaccg gcctggtcgt gttcctcctc actgtctttt 1200

gggggtgtct ggggttcaca tcactgtaca gacaccttcc tgcatccttg gagtggattt 1260

taagcttgct tagtcccttt gccttcatgc ttggaatggc ccagctttta cacttggact 1320

atgatttgaa ttctaatgca tttcctcatc catcggacgg ctcaaatctc attgtagcaa 1380

caaatttcat gttggcattt gacacttgcc tctatctggc attggcgatt tactttgaaa 1440

aaattttgcc aaatgaatat ggacatcgac gtccaccttt gtttttcctg aagtcctcat 1500

tttggtctca aacacaaaag actgatcacg tggcccttga agatgaaatg gatgccgatc 1560

cttcatttca tgactctttt gaacaagcgc ctccagaatt ccaagggaaa gaagccatca 1620

gaatcagaaa tgttacaaaa gaatataaag gaaagcctga taaaatagaa gccttgaaag 1680

atctggtatt tgacatttac gaaggccaaa tcactgcaat acttggtcac agtggagctg 1740

gaaagtcaac actgctaaac attcttagtg ggttgtctgt tcccaccaaa ggttcagtca 1800

ccatctataa caataagctt tcagaaatgg ctgacctaga aaatctcagc aagctgaccg 1860

gagtttgtcc acaatccaat gtgcaatttg acttcctcac tgtaagagaa aacctcagac 1920

tctttgctaa aataaaaggg attctgccac aagaagtgga taaagagata caaagggttc 1980

tgctggaatt ggaaatgaaa aatattcagg atgttcttgc tcaaaactta agtggtggac 2040

agaaaagaaa gctaaccttt gggattgcca ttttaggaga tcctcagatt ttcctgttgg 2100

atgaaccaac tgctggattg gatccctttt caagacacca agtatggaac cttctgaaag 2160

aacgcaaaac agaccgcgtg atcctcttca gtacccagtt catggatgag gccgacatcc 2220

tggcggacag gaaagtattt ctctcccaag ggaagctaaa gtgcgcgggc tcttctttgt 2280

ttctaaagaa gaaatggggg attggatatc acttaagctt gcagttaaat gaaatatgtg 2340

ttgaggaaaa cataacatca cttgttaaac agcacatccc tgatgccaaa ttatcagcca 2400

aaagcgaagg aaaacttatt tatacattac ccttagaaag aacaaataaa tttccagaac 2460

tttacaagga tcttgatagc tatcctgacc taggaattga gaattatggt gtttccatga 2520

caactttgaa tgaagtattc ctgaagctag aaggaaaatc tacaattaat gaatcggaca 2580

ttgctatttt gggagaagta caagcggaaa aagctgacga cactgaaagg cttgttgaga 2640

tggaacaagt cctctcttca cttaacaaga tgagaaagac aataggtggt gtggctctct 2700

ggcgacagca aatctgcgca attgcaaggg ttcgcttgtt aaagttaaag catgaaagaa 2760

aagctctttt agcactgcta ttaattctaa tggctggatt ttgccctctt cttgtggagt 2820

ataccatggt gaaaatatat caaaacagtt acacctggga actttctcct catttgtatt 2880

tccttgctcc tggacaacaa ccacatgacc ctctcactca actactgatc atcaataaaa 2940

caggggcaag cattgatgac tttatacagt ctgtggagca ccagaacata gctttagaag 3000

tggatgcatt tggaactaga aatggcacag atgacccatc ttataatgga gccatcacag 3060

tgtgttgtaa tgaaaagaat tacagctttt cgttagcatg caatgccaaa agattgaatt 3120

gcttcccagt tcttatggac attgttagta atgggctact tggaatggtt aaaccatcag 3180

tacatatccg aactgaaaga agtacatttt tggagaatgg acaggacaat ccaatcggat 3240

tcctggcata tatcatgttc tggctggttt taacatcgag ttgcccacct tacattgcca 3300

tgagcagcat cgatgattat aagaacagag ctcggtccca gctacggatt tccggactct 3360

ccccttctgc ttactggttt gggcaggcgc tggtggatgt ttccctgtac ttcttggtct 3420

tcgtttttat atatttaatg agctacattt caaacttcga agacatgcta cttacaataa 3480

ttcatattat tcaaatccca tgtgctgttg gttattcctt ttccctcatc ttcatgacat 3540

acgtgatttc cttcatcttt cgcaagggga gaaaaaatag tggcatttgg tcattttgtt 3600

tctatgttgt cactgtattc tctgtggctg gatttgcgtt cagtatcttc gaaagtgata 3660

ttccatttat cttcactttt ttaataccac ctgccacaat gattggctgt ttgttcttat 3720

cttctcatct tctcttttct tctctctttt ctgaagaacg aatggatgta cagccatttc 3780

tggtattcct aattcctttc cttcatttta tcatttttct ttttactctt cgatgtctgg 3840

aatggaagtt tggaaagaaa tcaatgagaa aggatccttt ctttagtagt gatgtgtgtc 3900

aaaatccaga agaaccagaa ggagaggatg aagatgttca gatggaaaga gtgagaacag 3960

caaatgcctt gaattctact aattttgatg agaagccagt catcattgcc agctgtctac 4020

gcaaggagta tgcagggaag aggaaaggct gtttttccaa gaggaagaat aagatagcca 4080

cgagaaatgt ctccttctgt gttagaaaag gtgaagtttt aggattatta ggacacaatg 4140

gagctggtaa aagcacatcc attaaggtga taactggaga cacaaaacca actgctggac 4200

aagtgctact gaaagggagc ggtggagggg atgccctgga gttcctgggg tactgccctc 4260

aggagaacgc gctgtggccc aacctgacag tgaggcagca cctggaggtg tacgccgccg 4320

tgaaagggct gaggaaaggg gatgctgagg ttgccatcac acggttagtg gatgcgctca 4380

agctgcagga ccagctgaag tctcccgtga agaccttgtc agagggaata aagagaaagc 4440

tgtgctttgt cctgagcata ctggggaacc cgtcagtggt gcttctggat gagccgtcga 4500

ccgggatgga ccccgagggg cagcagcaaa tgtggcaggc catccgggcc acctttagaa 4560

acacggaaag gggtgccctc ctaaccaccc actacatggc agaggctgag gccgtgtgtg 4620

accgagtggc catcatggta tctgggaggt tgagatgtat cggttccatc caacacctga 4680

aaagcaaatt tggcaaagat tacctgctgg agatgaaggt gaagaacctg gcacaagtgg 4740

agcccctcca tgcagagatc ctgaggcttt tcccccaggc tgctcggcag gaaaggtact 4800

cctctctgat ggtttataag ttgccagtgg aagatgtgca acctttagcc caagctttct 4860

tcaaattaga gaaggttaaa cagagctttg acctagagga gtacagcctc tcacagtcta 4920

ccctggagca ggttttcctg gagctctcca aggagcagga gctgggtgat tttgaggagg 4980

attttgatcc ctcagtgaag tggaagctcc tcccccagga agagccttaa aaccccaaat 5040

tctgtgttcc tgtttaaacc cgtggttttt tttaaataca tttattttta tagcagcaat 5100

gttctatttt tagaaactat attataagta cagaaatggt tctccgtgtg gtgggaggag 5160

gaggttcggg tgctgggtaa gtgccatgtc agtgtggaca gaggcatttg actaagccaa 5220

cctcctctca cagcctctgt atctctgcag gccatactgg ttccattgtt ctgtataata 5280

ctgaataaat aaatttactt ttacatgatc gtataagttt ctagataaga taaacaaatt 5340

ttgtttaaat ttttttaata aaaatcttaa aacacttttt ttctaaccta gactgagaaa 5400

ttcatgttta cttttctagg tgtatgatac tttgtaaagt tgatactttc ctaagaattt 5460

aacatgtcat atttttgaaa tagatttaag tgtgcttctt attgctaaaa atactaaatg 5520

tcatgggtca tagtatctga tatcaatatc gttgataaca tatccacagg taacaccatg 5580

atgtaggcat aaatggaaaa caaaaaccct actatttcaa atatattgta cttttttatt 5640

tctgtaagcc aactgtgtgc cattttcact ggacttttaa atctagactt tagtgatgtc 5700

tacattgtaa atgatctttt gtggatattt gtcacttggt ttcagaaagt tcacaaatgt 5760

agcaacagct cacatgactg agtaggtaga aaatgtgaaa taaatctcat atatatagtt 5820

ttgaa 5825

<210> 2

<211> 3943

<212> DNA

<213> CHRDL1

<400> 2

actctagctc tcgccacaac ctgccagccc cagacctcgg acgagagcgc cccggggagc 60

tcggagcgcg tgcacgcgtg gcagacggag aaggccagtg cccaggttag tgagcagtgc 120

ccggcgcccg cttccctcac ctccttttcc agcctttgca cagcttgaag gttctgtcac 180

cttttgcagt ggtccaaatg agaaaaaagt ggaaaatggg aggcatgaaa tacatctttt 240

cgttgttgtt ctttcttttg ctagaaggag gcaaaacaga gcaagtaaaa cattcagaga 300

catattgcat gtttcaagac aagaagtaca gagtgggtga gagatggcat ccttacctgg 360

aaccttatgg gttggtttac tgcgtgaact gcatctgctc agagaatggg aatgtgcttt 420

gcagccgagt cagatgtcca aatgttcatt gcctttctcc tgtgcatatt cctcatctgt 480

gctgccctcg ctgcccagac tccttacccc cagtgaacaa taaggtgacc agcaagtctt 540

gcgagtacaa tgggacaact taccaacatg gagagctgtt cgtagctgaa gggctctttc 600

agaatcggca acccaatcaa tgcacccagt gcagctgttc ggagggaaac gtgtattgtg 660

gtctcaagac ttgccccaaa ttaacctgtg ccttcccagt ctctgttcca gattcctgct 720

gccgggtatg cagaggagat ggagaactgt catgggaaca ttctgatggt gatatcttcc 780

ggcaacctgc caacagagaa gcaagacatt cttaccaccg ctctcactat gatcctccac 840

caagccgaca ggctggaggt ctgtcccgct ttcctggggc cagaagtcac cggggagctc 900

ttatggattc ccagcaagca tcaggaacca ttgtgcaaat tgtcatcaat aacaaacaca 960

agcatggaca agtgtgtgtt tccaatggaa agacctattc tcatggcgag tcctggcacc 1020

caaacctccg ggcatttggc attgtggagt gtgtgctatg tacttgtaat gtcaccaagc 1080

aagagtgtaa gaaaatccac tgccccaatc gatacccctg caagtatcct caaaaaatag 1140

acggaaaatg ctgcaaggtg tgtccaggta aaaaagcaaa agaacttcca ggccaaagct 1200

ttgacaataa aggctacttc tgcggggaag aaacgatgcc tgtgtatgag tctgtattca 1260

tggaggatgg ggagacaacc agaaaaatag cactggagac tgagagacca cctcaggtag 1320

aggtccacgt ttggactatt cgaaagggca ttctccagca cttccatatt gagaagatct 1380

ccaagaggat gtttgaggag cttcctcact tcaagctggt gaccagaaca accctgagcc 1440

agtggaagat cttcaccgaa ggagaagctc agatcagcca gatgtgttca agtcgtgtat 1500

gcagaacaga gcttgaagat ttagtcaagg ttttgtacct ggagagatct gaaaagggcc 1560

actgttaggc aagacagaca gtattggata gggtaaagca agaaaactca agctgcagct 1620

ggactgcagg cttattttgc ttaagtcaac agtgccctaa aactccaaac tcaaatgcag 1680

tcaattattc acgccatgca cagcataatt tgctcctttg tgtggagtgg tgtgtcagcc 1740

cttgaacatc tcctccaaag agactagaag agtcttaaat tatatgtggg aggaggaggg 1800

atagaacatc acaacactgc tctagtttct tggagaatca catttcttta caggttaaag 1860

acaaacaaga ccccagggtt tttatctaga aagttattca agtgaaagaa agagaaggga 1920

attgcttagt aggagttctg cagtatagaa caattacttg tatgaaatta tacctttgaa 1980

ttttagaatg tcatgtgttc ttttaaaaaa attagctccc catcctccct cctcactccc 2040

tccctccctc cttctctctc tctctctctc tccctccctc tctcacagac acacacacac 2100

acacacacac acacacacac acgcacgtcc acactcacat taaacgaaag ctttatttga 2160

agcaaagcta gccaagattc tacgttactt ttcccttgac tggatcccaa gtagcttgga 2220

agtttttgtg cccaggagag taaataactg tgaacaagag gctctgccct taggtctttg 2280

tggctgttta agtcaccaac aatagagtca gggtaaagaa taaaaacact ttcatagcct 2340

cattcattca cttagaagtg gtaataattt ttccctaatg ataccacttt tcttttcccc 2400

ctgtacctat gggacttcca gaaagaagtt aaattgagta aaatcatcag aaactgaatc 2460

catgtaagaa aaaataattg ttgaagaaag aagttgatag aattcaaaaa ggccatcttt 2520

ttgctttcac atcaataaaa tttaccaagt aatagatcag tactcactaa tatttttgag 2580

accatagttg tctggtcaga aaaattatat taaattagta aattctagaa gctctttaaa 2640

agggaagttt tccttcttct ccaattatag gagttgattt ttactttgca aagtggctcg 2700

gtcctcatga gcatctgcat gttgactctt cagttaagaa aattgttgtt catttaggga 2760

ggtggatatt ctgatgaaga tctttatcct aaaccttcct actatccttg tcttattcat 2820

caagcagata ttttagtcaa gaattccaga gaaggctgct cctaaaatgt ctacttgcag 2880

cccaatacca gagcataaac tatccattct ggggtctggc tttagaaatc atctttgtgg 2940

gaagacctaa ttcttcacag caaggatctc aggcatgcct tctagatttg ttccctctga 3000

ggggcaggaa tgaactgtag aaatgtttta aggacccaga aaccccatat gtctcattcc 3060

atgactatag gtgagagaat tctttcctaa gagggtttga taccaatagg ggaaaatgta 3120

aaatgttcag tctttatgac aacctggcat aaaggagtca attcttatga aagagacaca 3180

agggccttat ggccagggtt tcttgggaca agactctcac cagcacatca cacacgttct 3240

ccttggaaga gagaagcagt acatcccggt tgagaggtca caaagcatta gtttgtgtgt 3300

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ggtaaagggg ggaaggtgtt 3360

atgcggctgc tccctccgtc ccagaggtgg cagtgattcc ataatgtgga gactagtaac 3420

tagatcctaa ggcaaagagg tgtttctcct tctggatgat tcatcccaaa gccttcccac 3480

ccaggtgttc tctgaaagct tagccttaag agaacacgca gagagtttcc ctagatatac 3540

tcctgcctcc aggtgctggg acacaccttt gcaaaatgct gtgggaagca ggagctgggg 3600

agctgtgtta agtcaaagta gaaaccctcc agtgtttggt gttgtgtaga gaataggaca 3660

tagggtaaag aggccaagct gcctgtagtt agtagagaag aatggatgtg gttcttcttg 3720

tgtatttatt tgtatcataa acacttggaa caacaaagac cataagcatc atttagcagt 3780

tgtagccatt ttctagttaa ctcatgtaaa caagtaagag taacataaca gtattaccct 3840

ttcactgttc tcacaggaca tgtacctaat tatggtactt atttatgtag tcactgtatt 3900

tctggatttt taaattaata aaaaagttaa ttttgaaaaa tca 3943

<210> 3

<211> 2682

<212> DNA

<213> ADH1B

<400> 3

aatatatctg ctttatgcac tcaagcagag aagaaatcca caaagactca cagtctgctg 60

gtgggcagag aagacagaaa cgacatgagc acagcaggaa aagtaatcaa atgcaaagca 120

gctgtgctat gggaggtaaa gaaacccttt tccattgagg atgtggaggt tgcacctcct 180

aaggcttatg aagttcgcat taagatggtg gctgtaggaa tctgtcacac agatgaccac 240

gtggttagtg gcaacctggt gacccccctt cctgtgattt taggccatga ggcagccggc 300

atcgtggaga gtgttggaga aggggtgact acagtcaaac caggtgataa agtcatcccg 360

ctctttactc ctcagtgtgg aaaatgcaga gtttgtaaaa acccggagag caactactgc 420

ttgaaaaatg atctaggcaa tcctcggggg accctgcagg atggcaccag gaggttcacc 480

tgcaggggga agcccattca ccacttcctt ggcaccagca ccttctccca gtacacggtg 540

gtggatgaga atgcagtggc caaaattgat gcagcctcgc ccctggagaa agtctgcctc 600

attggctgtg gattctcgac tggttatggg tctgcagtta acgttgccaa ggtcacccca 660

ggctctacct gtgctgtgtt tggcctggga ggggtcggcc tatctgctgt tatgggctgt 720

aaagcagctg gagcagccag aatcattgcg gtggacatca acaaggacaa atttgcaaag 780

gccaaagagt tgggtgccac tgaatgcatc aaccctcaag actacaagaa acccattcag 840

gaagtgctaa aggaaatgac tgatggaggt gtggattttt cgtttgaagt catcggtcgg 900

cttgacacca tgatggcttc cctgttatgt tgtcatgagg catgtggcac aagcgtcatc 960

gtaggggtac ctcctgcttc ccagaacctc tcaataaacc ctatgctgct actgactgga 1020

cgcacctgga agggggctgt ttatggtggc tttaagagta aagaaggtat cccaaaactt 1080

gtggctgatt ttatggctaa gaagttttca ctggatgcgt taataaccca tgttttacct 1140

tttgaaaaaa taaatgaagg atttgacctg cttcactctg ggaaaagtat ccgtaccgtc 1200

ctgacgtttt gaggcaatag agatgccttc ccctgtagca gtcttcagcc tcctctaccc 1260

tacaagatct ggagcaacag ctaggaaata tcattaattc agctcttcag agatgttatc 1320

aataaattac acatgggggc tttccaaaga aatggaaatt gatgggaaat tatttttcag 1380

gaaaatttaa aattcaagtg agaagtaaat aaagtgttga acatcagctg gggaattgaa 1440

gccaacaaac cttccttctt aaccattcta ctgtgtcacc tttgccattg aggaaaaata 1500

ttcctgtgac ttcttgcatt tttggtatct tcataatctt tagtcatcga atcccagtgg 1560

aggggaccct tttacttgcc ctgaacatac acatgctggg ccattgtgat tgaagtcttc 1620

taactctgtc tcagttttca ctgtcgacat tttccttttt ctaataaaaa tgtaccaaat 1680

ccctggggta aaagctaggg taaggtaaag gatagactca catttacaag tagtgaaggt 1740

ccaagagttc taaatacagg aaatttctta ggaactcaaa taaaatgccc cacattttac 1800

tacagtaaat ggcagtgttt ttatgacttt tatactattt ctttatggtc gatatacaat 1860

tgatttttta aaataatagc agatttcttg cttcatatga caaagcctca attactaatt 1920

gtaaaaactg aactattccc agaatcatgt tcaaaaaatc tgtaattttt gctgatgaaa 1980

gtgcttcatt gactaaacag tattagtttg tggctataaa tgattattta gatgatgact 2040

gaaaatgtgt ataaagtaat taaaagtaat atggtggctt taagtgtaga gatgggatgg 2100

caaatgctgt gaatgcagaa tgtaaaattg gtaactaaga aatggcacaa acaccttaag 2160

caatatattt tcctagtaga tatatatata cacatacata tatacacata tacaaatgta 2220

tatttttgca aaattgtttt caatctagaa cttttctatt aactaccatg tcttaaaatc 2280

aagtctataa tcctagcatt agtttaatat tttgaatatg taaagacctg tgttaatgct 2340

ttgttaatgc ttttcccact ctcatttgtt aatgctttcc cactctcagg ggaaggattt 2400

gcattttgag ctttatctct aaatgtgaca tgcaaagatt attcctggta aaggaggtag 2460

ctgtctccaa aaatgctatt gttgcaatat ctacattcta tttcatatta tgaaagacct 2520

tagacataaa gtaaaatagt ttatcattta ctgtgtgatc ttcagtaagt ctctcaggct 2580

ctctgagctt gttcatcctt tgttttgaaa aaattactca accaatccat tacagcttaa 2640

ccaagattaa atgggatgat gttaatgaaa gagcttcgcc aa 2682

<210> 4

<211> 1913

<212> DNA

<213> CDK1

<400> 4

agcgcggtga gtttgaaact gctcgcactt ggcttcaaag ctggctcttg gaaattgagc 60

ggagagcgac gcggttgttg tagctgccgc tgcggccgcc gcggaataat aagccgggat 120

ctaccatacc cattgactaa ctatggaaga ttataccaaa atagagaaaa ttggagaagg 180

tacctatgga gttgtgtata agggtagaca caaaactaca ggtcaagtgg tagccatgaa 240

aaaaatcaga ctagaaagtg aagaggaagg ggttcctagt actgcaattc gggaaatttc 300

tctattaaag gaacttcgtc atccaaatat agtcagtctt caggatgtgc ttatgcagga 360

ttccaggtta tatctcatct ttgagtttct ttccatggat ctgaagaaat acttggattc 420

tatccctcct ggtcagtaca tggattcttc acttgttaag agttatttat accaaatcct 480

acaggggatt gtgttttgtc actctagaag agttcttcac agagacttaa aacctcaaaa 540

tctcttgatt gatgacaaag gaacaattaa actggctgat tttggccttg ccagagcttt 600

tggaatacct atcagagtat atacacatga ggtagtaaca ctctggtaca gatctccaga 660

agtattgctg gggtcagctc gttactcaac tccagttgac atttggagta taggcaccat 720

atttgctgaa ctagcaacta agaaaccact tttccatggg gattcagaaa ttgatcaact 780

cttcaggatt ttcagagctt tgggcactcc caataatgaa gtgtggccag aagtggaatc 840

tttacaggac tataagaata catttcccaa atggaaacca ggaagcctag catcccatgt 900

caaaaacttg gatgaaaatg gcttggattt gctctcgaaa atgttaatct atgatccagc 960

caaacgaatt tctggcaaaa tggcactgaa tcatccatat tttaatgatt tggacaatca 1020

gattaagaag atgtagcttt ctgacaaaaa gtttccatat gttatatcaa cagatagttg 1080

tgtttttatt gttaactctt gtctattttt gtcttatata tatttctttg ttatcaaact 1140

tcagctgtac ttcgtcttct aatttcaaaa atataactta aaaatgtaaa tattctatat 1200

gaatttaaat ataattctgt aaatgtgtgt aggtctcact gtaacaacta tttgttacta 1260

taataaaact ataatattga tgtcaggaat caggaaaaaa tttgagttgg cttaaatcat 1320

ctcagtcctt atggcagttt tattttcctg tagttggaac tactaaaatt taggaaaatg 1380

ctaagttcaa gtttcgtaat gctttgaagt atttttatgc tctgaatgtt taaatgttct 1440

catcagtttc ttgccatgtt gttaactata caacctggct aaagatgaat atttttctac 1500

tggtatttta atttttgacc taaatgttta agcattcgga atgagaaaac tatacagatt 1560

tgagaaatga tgctaaattt ataggagttt tcagtaactt aaaaagctaa catgagagca 1620

tgccaaaatt tgctaagtct tacaaagatc aagggctgtc cgcaacaggg aagaacagtt 1680

ttgaaaattt atgaactatc ttatttttag gtaggttttg aaagcttttt gtctaagtga 1740

attcttatgc cttggtcaga gtaataactg aaggagttgc ttatcttggc tttcgagtct 1800

gagtttaaaa ctacacattt tgacatagtg tttattagca gccatctaaa aaggctctaa 1860

tgtatattta actaaaatta ctagctttgg gaattaaact gtttaacaaa taa 1913

<210> 5

<211> 3053

<212> DNA

<213> CDC6

<400> 5

gagcgcggct ggagtttgct gctgccgctg tgcagtttgt tcaggggctt gtggtggtga 60

gtccgagagg ctgcgtgtga gagacgtgag aaggatcctg cactgaggag gtggaaagaa 120

gaggattgct cgaggaggcc tggggtctgt gaggcagcgg agctgggtga aggctgcggg 180

ttccggcgag gcctgagctg tgctgtcgtc atgcctcaaa cccgatccca ggcacaggct 240

acaatcagtt ttccaaaaag gaagctgtct cgggcattga acaaagctaa aaactccagt 300

gatgccaaac tagaaccaac aaatgtccaa accgtaacct gttctcctcg tgtaaaagcc 360

ctgcctctca gccccaggaa acgtctgggc gatgacaacc tatgcaacac tccccattta 420

cctccttgtt ctccaccaaa gcaaggcaag aaagagaatg gtccccctca ctcacataca 480

cttaagggac gaagattggt atttgacaat cagctgacaa ttaagtctcc tagcaaaaga 540

gaactagcca aagttcacca aaacaaaata ctttcttcag ttagaaaaag tcaagagatc 600

acaacaaatt ctgagcagag atgtccactg aagaaagaat ctgcatgtgt gagactattc 660

aagcaagaag gcacttgcta ccagcaagca aagctggtcc tgaacacagc tgtcccagat 720

cggctgcctg ccagggaaag ggagatggat gtcatcagga atttcttgag ggaacacatc 780

tgtgggaaaa aagctggaag cctttacctt tctggtgctc ctggaactgg aaaaactgcc 840

tgcttaagcc ggattctgca agacctcaag aaggaactga aaggctttaa aactatcatg 900

ctgaattgca tgtccttgag gactgcccag gctgtattcc cagctattgc tcaggagatt 960

tgtcaggaag aggtatccag gccagctggg aaggacatga tgaggaaatt ggaaaaacat 1020

atgactgcag agaagggccc catgattgtg ttggtattgg acgagatgga tcaactggac 1080

agcaaaggcc aggatgtatt gtacacgcta tttgaatggc catggctaag caattctcac 1140

ttggtgctga ttggtattgc taataccctg gatctcacag atagaattct acctaggctt 1200

caagctagag aaaaatgtaa gccacagctg ttgaacttcc caccttatac cagaaatcag 1260

atagtcacta ttttgcaaga tcgacttaat caggtatcta gagatcaggt tctggacaat 1320

gctgcagttc aattctgtgc ccgcaaagtc tctgctgttt caggagatgt tcgcaaagca 1380

ctggatgttt gcaggagagc tattgaaatt gtagagtcag atgtcaaaag ccagactatt 1440

ctcaaaccac tgtctgaatg taaatcacct tctgagcctc tgattcccaa gagggttggt 1500

cttattcaca tatcccaagt catctcagaa gttgatggta acaggatgac cttgagccaa 1560

gaaggagcac aagattcctt ccctcttcag cagaagatct tggtttgctc tttgatgctc 1620

ttgatcaggc agttgaaaat caaagaggtc actctgggga agttatatga agcctacagt 1680

aaagtctgtc gcaaacagca ggtggcggct gtggaccagt cagagtgttt gtcactttca 1740

gggctcttgg aagccagggg cattttagga ttaaagagaa acaaggaaac ccgtttgaca 1800

aaggtgtttt tcaagattga agagaaagaa atagaacatg ctctgaaaga taaagcttta 1860

attggaaata tcttagctac tggattgcct taaattcttc tcttacaccc cacccgaaag 1920

tattcagctg gcatttagag agctacagtc ttcattttag tgctttacac attcgggcct 1980

gaaaacaaat atgacctttt ttacttgaag ccaatgaatt ttaatctata gattctttaa 2040

tattagcaca gaataatatc tttgggtctt actattttta cccataaaag tgaccaggta 2100

gacccttttt aattacattc actacttcta ccacttgtgt atctctagcc aatgtgcttg 2160

caagtgtaca gatctgtgta gaggaatgtg tgtatattta cctcttcgtt tgctcaaaca 2220

tgagtgggta tttttttgtt tgtttttttt gttgttgttg tttttgaggc gcgtctcacc 2280

ctgttgccca ggctggagtg caatggcgcg ttctctgctc actacagcac ccgcttccca 2340

ggttgaagtg attctcttgc ctcagcctcc cgagtagctg ggattacagg tgcccaccac 2400

cgcgcccagc taatttttta atttttagta gagacagggt tttaccatgt tggccaggct 2460

ggtcttgaac tcctgaccct caagtgatct gcccaccttg gcctccctaa gtgctgggat 2520

tataggcgtg agccaccatg ctcagccatt aaggtatttt gttaagaact ttaagtttag 2580

ggtaagaaga atgaaaatga tccagaaaaa tgcaagcaag tccacatgga gatttggagg 2640

acactggtta aagaatttat ttctttgtat agtatactat gttcatggtg cagatactac 2700

aacattgtgg cattttagac tcgttgagtt tcttgggcac tcccaagggc gttggggtca 2760

taaggagact ataactctac agattgtgaa tatatttatt ttcaagttgc attctttgtc 2820

tttttaagca atcagatttc aagagagctc aagctttcag aagtcaatgt gaaaattcct 2880

tcctaggctg tcccacagtc tttgctgccc ttagatgaag ccacttgttt caagatgact 2940

actttggggt tgggttttca tctaaacaca tttttccagt cttattagat aaattagtcc 3000

atatggttgg ttaatcaaga gccttctggg tttggtttgg tggcattaaa tgg 3053

<210> 6

<211> 2989

<212> DNA

<213> SQLE

<400> 6

gtctgggccg agcccgccca gctggctgag acgcgtggag cctggcggcg agtgggggcg 60

tgcgacggtt actctggtta ctggggccgc gccgcgctgg cgagagccgc cgcccgcgag 120

ggatgctggt gaggaagccg tcgggagccg ccgccgccat ctgagggagg taccctggaa 180

accacctttt atcggtgggg aagtgcagtc gcggtgggcg gctctggggg ccagcgaaac 240

gggaggcctc taaatcttta ggttggggct gcattgccct ggagccgcac tcttgagtcc 300

gaggccatct tttgttggag aaggcgtcgg cgttggcgtt ttcccgaggt tgggctgtac 360

agtgtctccg tccgcggaaa aagaagcctc tgaacccgcg ccggcccgca gcccccgtgc 420

cttccggccg ctgctcgccg tcgccagagg ctaggccacg tttcccccag tgccgaggtg 480

tttctgtgac cctccctcca ctcccattcc cttctgaaag ggcacctgct cttggtgaga 540

aaagaaatta tagcacgaag agccagtatc agaagagtat ccatcacccg cagcaaccgc 600

tcagggaaca ccatcaaaaa agaaaaaaag ggaatatctg gatttcctgg gcgaggagga 660

gcgagtctgc tcgggagctg ttccagcagg cgatttttaa atactgcttt ctacgcccta 720

tacaacttgg cttcacatac ttttacacta actttatatg atttttaaaa actggtctga 780

tcggacttct cgtcctggga cactgtttac tggagtctgg ccggctctcc gtgctcctct 840

tggtacctca ttttggggag aaccttaaac ccactcgagc agataatctc cgccttgacc 900

ggtgccacca aagaagcctt ggaaccatgt ggacttttct gggcattgcc actttcacct 960

atttttataa gaagttcggg gacttcatca ctttggccaa cagggaggtc ctgttgtgcg 1020

tgctggtgtt cctctcgctg ggcctggtgc tctcctaccg ctgtcgccac cgaaacgggg 1080

gtctcctcgg gcgccagcag agcggctccc agttcgccct cttctcggat attctctcag 1140

gcctgccttt cattggcttc ttctgggcca aatccccccc tgaatcagaa aataaggagc 1200

agctcgaggc caggaggcgc agaaaaggaa ccaatatttc agaaacaagc ttaataggaa 1260

cagctgcctg tacatcaaca tcttctcaga atgacccaga agttatcatc gtgggagctg 1320

gcgtgcttgg ctctgctttg gcagctgtgc tttccagaga tggaagaaag gtgacagtca 1380

ttgagagaga cttaaaagag cctgacagaa tagttggaga attcctgcag ccgggtggtt 1440

atcatgttct caaagacctt ggtcttggag atacagtgga aggtcttgat gcccaggttg 1500

taaatggtta catgattcat gatcaggaaa gcaaatcaga ggttcagatt ccttaccctc 1560

tgtcagaaaa caatcaagtg cagagtggaa gagctttcca tcacggaaga ttcatcatga 1620

gtctccggaa agcagctatg gcagagccca atgcaaagtt tattgaaggt gttgtgttac 1680

agttattaga ggaagatgat gttgtgatgg gagttcagta caaggataaa gagactggag 1740

atatcaagga actccatgct ccactgactg ttgttgcaga tgggcttttc tccaagttca 1800

ggaaaagcct ggtctccaat aaagtttctg tatcatctca ttttgttggc tttcttatga 1860

agaatgcacc acagtttaaa gcaaatcatg ctgaacttat tttagctaac ccgagtccag 1920

ttctcatcta ccagatttca tccagtgaaa ctcgagtact tgttgacatt agaggagaaa 1980

tgccaaggaa tttaagagaa tacatggttg aaaaaattta cccacaaata cctgatcacc 2040

tgaaagaacc attcttagaa gccactgaca attctcatct gaggtccatg ccagcaagct 2100

tccttcctcc ttcatcagtg aagaaacgag gtgttcttct tttgggagac gcatataata 2160

tgaggcatcc acttactggt ggaggaatga ctgttgcttt taaagatata aaactatgga 2220

gaaaactgct aaagggtatc cctgaccttt atgatgatgc agctattttc gaggccaaaa 2280

aatcatttta ctgggcaaga aaaacatctc attcctttgt cgtgaatatc cttgctcagg 2340

ctctttatga attattttct gccacagatg attccctgca tcaactaaga aaagcctgtt 2400

ttctttattt caaacttggt ggcgaatgtg ttgcgggtcc tgttgggctg ctttctgtat 2460

tgtctcctaa ccctctagtt ttaattggac acttctttgc tgttgcaatc tatgccgtgt 2520

atttttgctt taagtcagaa ccttggatta caaaacctcg agcccttctc agtagtggtg 2580

ctgtattgta caaagcgtgt tctgtaatat ttcctctaat ttactcagaa atgaagtata 2640

tggttcatta agcttaaagg ggaaccattt gtgaatgaat atttggaact taccaagtcc 2700

taagagactt ttggaagagg atatatatag catagtacca taccacttat aaagtggaaa 2760

ctcttggacc aagatttgga ttaatttgtt tttgaagttt tttgtatata aatatgtaaa 2820

tacatgcttt aatttgcaat ttaaaatgaa ggggttaaat aagttagaca tttaaaagaa 2880

atgattgtta ccataaatta gtgctaatgc tgaggagaac tacagttttt cttttgaatt 2940

tagtatttga gatgagttgt tgggacatgc aaataaaatg aagaatgaa 2989

<210> 7

<211> 2176

<212> DNA

<213> FCGR1A

<400> 7

aatatcttgc atgttacaga tttcactgct cccaccagct tggagacaac atgtggttct 60

tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca aaggcagtga 120

tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc ttgcactgtg 180

aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc acagccactc 240

agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt ggtgaataca 300

ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc cacagaggct 360

ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg gccttgaggt 420

gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat ggcaaagcct 480

ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata agtcacaatg 540

gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga atatctgtca 600

ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc ccactcctgg 660

aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg cctggtttgc 720

agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac acatcctctg 780

aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc gaggctgcca 840

cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg cttggcctcc 900

agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga ataatgtttt 960

tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag aaaaagtggg 1020

atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc cttcaagaag 1080

acagacattt agaagaagag ctgaaatgtc aggaacaaaa agaagaacag ctgcaggaag 1140

gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtagcagcg gctcagtggg tggccatcga 1200

tctggaccgt cccctgccca cttgctcccc gtgagcactg cgtacaaaca tccaaaagtt 1260

caacaacacc agaactgtgt gtctcatggt atgtaactct taaagcaaat aaatgaactg 1320

acttcaactg ggatacattt ggaaatgtgg tcatcaaaga tgacttgaaa tgaggcctac 1380

tctaaagaat tcttgaaaaa cttacaagtc aagcctagcc tgataatcct attacatagt 1440

ttgaaaaata gtattttatt tctcagaaca aggtaaaaag gtgagtgggt gcatatgtac 1500

agaagattaa gacagagaaa cagacagaaa gagacacaca cacagccagg agtgggtaga 1560

tttcagggag acaagaggga atagtataga caataaggaa ggaaatagta cttacaaatg 1620

actcctaagg gactgtgaga ctgagagggc tcacgcctct gtgttcagga tacttagttc 1680

atggcttttc tctttgactt tactaaaaga gaatgtctcc atacgcgttc taggcataca 1740

agggggtaac tcatgatgag aaatggatgt gttattcttg ccctctcttt tgaggctctc 1800

tcataacccc tctatttcta gagacaacaa aaatgctgcc agtcctaggc ccctgccctg 1860

taggaaggca gaatgtaact gttctgtttg tttaacgatt aagtccaaat ctccaagtgc 1920

ggcactgcaa agagacgctt caagtgggga gaagcggcga taccatagag tccagatctt 1980

gcctccagag atttgcttta ccttcctgat tttctggtta ctaattagct tcaggatacg 2040

ctgctctcat acttgggctg tagtttggag acaaaatatt ttcctgccac tgtgtaacat 2100

agctgaggta aaaactgaac tatgtaaatg actctactaa aagtttaggg aaaaaaaaca 2160

ggaggagtat gacaca 2176

<210> 8

<211> 3512

<212> DNA

<213> RSAD2

<400> 8

aactcagctg agtgttagtc aaagaaggtg tgtcctgctc cccaatgaca ggttgctcag 60

agactgctga tttccatccc tatataaaga gagtccctgg catacagaga ctgctctgct 120

ccaggcatct gccacaatgt gggtgcttac acctgctgct tttgctggga agctcttgag 180

tgtgttcagg caacctctga gctctctgtg gaggagcctg gtcccgctgt tctgctggct 240

gagggcaacc ttctggctgc tagctaccaa gaggagaaag cagcagctgg tcctgagagg 300

gccagatgag accaaagagg aggaagagga ccctcctctg cccaccaccc caaccagcgt 360

caactatcac ttcactcgcc agtgcaacta caaatgcggc ttctgtttcc acacagccaa 420

aacatccttt gtgctgcccc ttgaggaagc aaagagagga ttgcttttgc ttaaggaagc 480

tggtatggag aagatcaact tttcaggtgg agagccattt cttcaagacc ggggagaata 540

cctgggcaag ttggtgaggt tctgcaaagt agagttgcgg ctgcccagcg tgagcatcgt 600

gagcaatgga agcctgatcc gggagaggtg gttccagaat tatggtgagt atttggacat 660

tctcgctatc tcctgtgaca gctttgacga ggaagtcaat gtccttattg gccgtggcca 720

aggaaagaag aaccatgtgg aaaaccttca aaagctgagg aggtggtgta gggattatag 780

agtcgctttc aagataaatt ctgtcattaa tcgtttcaac gtggaagagg acatgacgga 840

acagatcaaa gcactaaacc ctgtccgctg gaaagtgttc cagtgcctct taattgaggg 900

tgagaattgt ggagaagatg ctctaagaga agcagaaaga tttgttattg gtgatgaaga 960

atttgaaaga ttcttggagc gccacaaaga agtgtcctgc ttggtgcctg aatctaacca 1020

gaagatgaaa gactcctacc ttattctgga tgaatatatg cgctttctga actgtagaaa 1080

gggacggaag gacccttcca agtccatcct ggatgttggt gtagaagaag ctataaaatt 1140

cagtggattt gatgaaaaga tgtttctgaa gcgaggagga aaatacatat ggagtaaggc 1200

tgatctgaag ctggattggt agagcggaaa gtggaacgag acttcaacac accagtggga 1260

aaactcctag agtaactgcc attgtctgca atactatccc gttggtattt cccagtggct 1320

gaaaacctga ttttctgctg cacgtggcat ctgattacct gtggtcactg aacacacgaa 1380

taacttggat agcaaatcct gagacaatgg aaaaccatta actttacttc attggcttat 1440

aaccttgttg ttattgaaac agcacttctg tttttgagtt tgttttagct aaaaagaagg 1500

aatacacaca ggaataatga ccccaaaaat gcttagataa ggcccctata cacaggacct 1560

gacatttagc tcaatgatgc gtttgtaaga aataagctct agtgatatct gtgggggcaa 1620

aatttaattt ggatttgatt ttttaaaaca atgtttactg cgatttctat atttccattt 1680

tgaaactatt tcttgttcca ggtttgttca tttgacagag tcagtatttt ttgccaaata 1740

tccagataac cagttttcac atctgagaca ttacaaagta tctgcctcaa ttatttctgc 1800

tggttataat gctttttttt ttttgccttt atgccattgc agtcttgtac tttttactgt 1860

gatgtacaga aatagtcaac agatgtttcc aagaacatat gatatgataa tcctaccaat 1920

tttcaagaag tctctagaaa gagataacac atggaaagac ggtgtggtgc agcccagccc 1980

acggtggctg ttccatgaat gctggctacc tatgtgtgtg gtacctgttg tgtccctttc 2040

tcttcaaaga tcctgagcaa aacaaagata cgctttccat ttgatgatgg agttgacatg 2100

gaggcagtgc ttgcattgct ttgttcgcct atcatctggc cacatgaggc tgtcaagcaa 2160

aagaatagga gtgtagttga gtagctggtt ggccctacat ctctgagaag tgacggcaca 2220

ctgggttggc ataagatatc ctaaaatcac gctggaacct tgggcaagga agaatgtgag 2280

caagagtaga gagagtgcct ggatttcatg tcagtgaagc caagtcacca tatcatattt 2340

ttgaatgaac tctgagtcag ttgaaatagg gtaccatcta ggtcagttta agaagagtca 2400

gctcagagaa agcaagcata agggaaaatg tcacgtaaac tagatcaggg aacaaaatcc 2460

tctccttgtg gaaatatccc atgcagtttg ttgatacaac ttagtatctt attgcctaaa 2520

aaaaaatttc ttatcattgt ttcaaaaaag caaaatcatg gaaaattttt gttgtccagg 2580

caaataaaag gtcattttaa tttagctgca atttcagtgt tcctcactag gtggcattta 2640

aatgtcgcct gatgtcatta agcaccatcc aaaaagtctg cttcataatc tattttcaag 2700

acttggtgat tctgaaagtt ttggtttttg tgactttgtt tctcaggaaa aaaaatattc 2760

ctacttaaat tttaagtcta taattcaatt taaatatgtg tgtgtctcat ccaggatagg 2820

ataggttgtc ttctattttc cattttacct atttactttt tttgtaagaa aagagaaaaa 2880

tgaattctaa agatgttccc catgggtttt gattgtgtct aagctatgat gaccttcata 2940

taatcagcat aaacataaaa caaatttttt acttaacatg agtgcacttt actaatcctc 3000

atggcacagt ggctcacgcc tgtaatccca gcacttggga ggacaatgtg ggtggatcac 3060

gaggtcagga gttcgagaac agcctggcca acatggtgaa accccgtctc cactaaaaat 3120

acaaaaatta gccaggcatg gtggcgtaca cttgtaattc cagctactca agaggctgag 3180

gcaggaggat tgcttgaacc ctgaaggcag aggttacaga gccaagatag cgccactgca 3240

ctccagcctg gatgacagag caagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagcaaga 3300

gagttcaact aagaaaggtc acatatgtga aagcccaagg acactgtttg atatacagca 3360

ggtattcaat cagtgttatt tgaaaccaaa tctgaatttg aagtttgaat cttctgagtt 3420

ggaatgaatt tttttctagc tgagggaaac tgtatttttc tttccccaaa gaggaatgta 3480

atgtaaagtg aaataaaact ataagctatg tt 3512

<210> 9

<211> 279

<212> DNA

<213> SNRPEP4

<400> 9

atggcgtacc gtggccaggg ccagaaagtg cagaaggtta tggtgcagcc catcagcctc 60

atcttcagat acttacaaaa tagatcgcgg attcaggtgt ggctctatga gcaagtgaat 120

atgcggatag aaggctgtat cattggtttt gatgagtata tgaaccttgt attagatgat 180

gcagaagaga ttcattctaa aacaaagtca agaaaacaac tgggtcggat catgctaaaa 240

ggaggtaata ttactctgct gcaaagtgtc tccaactag 279

<210> 10

<211> 580

<212> DNA

<213> HIST2H2BC

<400> 10

tgcctgagcc tgcaaagttc gcgccggctc ccaagaaggg ctccaagaaa gccgtcacca 60

aagcccagaa gaaagacggc aagaagcgca agcgcagccg caaggagagc tactccatct 120

acgtgtacaa ggtgctgaag cgggtccacc ccgacaccgg catctggtgc aaggccatgg 180

gcatcatgaa ctccttcctc aacgacatct tcgagcgcat cgcgggagag gcgtcccgcc 240

tggcgcacta caacaagcgc tccaccatca cgtcccggag atccagacgg ccgtgcgcct 300

gctgctgccc ggcgagctgg ccaagcacgc cgtgtccgag ggcaccaagg cggtcaccaa 360

gtacgccagc tccaagtgag tccctgccgg gacctggcgc tcgctcgctc cctccctccc 420

tccctccgcg ggtcgccggc tgctttgtct ccaaaggctc ttttcagggc catttaacca 480

cctcagttaa agaatctttc ttgtgttgtc agtcccagtt gatgtttttg gcttcacgtc 540

tggttaactt taggagagca cacaacacca agcacagata 580

Claims (10)

1.一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型，其特征在于，所述模型包括SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA。

2.权利要求1所述的mRNA联合lncRNA模型构建与鉴定方法如下:

（1）提取获得的癌组织的RNA样本；

（2）纯化组织的RNA样本；

（3）RNA质量控制：用NanoDrop 2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量；

（4）采用全传录组芯片检测所述乳腺癌与癌旁组织，进行过滤，标化处理后，去除差异表达倍数不明显的探针，再利用生物信息学分析获得癌与癌旁组织差异表达的RNA，包括mRNA和lncRNA；对另组三阴性乳腺癌癌组织进行HTA2.0芯片检测，将该结果与上述癌组织结果组成训练集，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个差异表达RNA与患者无复发生存的关系，筛选其中差异表达以及与疾病RFS相关的RNA（如SEQ ID No. 1-10所示）；

（5）计算上述10个RNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者RFS的风险指数，根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，判断患者复发风险大小，并依该预测患者对于紫杉为基础化疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价；

（6）将上述所得的RNA模型及计算公式，在三阴性乳腺癌患者中进行验证：获取独立的另组三阴性患者的癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQ ID No. 1-10所示RNA的表达量，并利用GAPDH作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个RNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；判断每位患者的复发风险，同时预测其对紫杉为基础化疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对RNA模型的预测效能进行评价。

3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，风险指数的计算公式：RS=B1*X1+…+B10*X10；其中，X为每个RNA在两分类方法中的赋值，B为每个RNA的权重系数。

4.权利要求1所述模型在制备预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的芯片或试剂或试剂盒中的应用。

5.权利要求1所述模型在制备采用实时定量PCR预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的产品中的应用。

6.按权利要求5所述的应用，其特征在于，所述采用实时定量PCR预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的产品含有针对SEQ ID No. 1-10中一对或多对RNA特异性引物。

7.按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的试剂含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸。

8.按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的试剂盒含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸。

9.按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的芯片含有针对SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸。

10.按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述芯片或试剂或试剂盒通过下述方法预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性，检测癌组织样品中SEQ ID No. 1-10中一个或多个RNA的表达水平，预测三阴性乳腺癌患者预后及对化疗的敏感性。