CN102218146B - 一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒，试剂盒中包括有特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体浓缩液和阴性对照的shRNA慢病毒表达质粒载体浓缩液，其中的shRNA具有序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的序列。该shRNA序列或由此得到的试剂通过某种方式进入到动物模型体内时，可以比以往任何手段更高效、特异、方便的抑制疾病相关蛋白的表达，使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的，因此，本发明的试剂盒可用于阿尔茨海默病动物模型的基因治疗。

Description

一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种shRNA基因试剂，特别是一种抑制caspase-3基因表达的shRNA，该shRNA基因试剂为一种以慢病毒为载体的抑制caspase-3基因表达的shRNA及相关辅助试剂，用于治疗阿尔茨海默病动物模型。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。它已在许多不同种属的生物体中被发现，并在生物体细胞之间进行传递，具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用。RNAi技术不仅能大大推进人类后基因组计划的发展，还能高通量地筛选药物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟新的途径。RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，将对医学生物学的发展产生深远的影响。虽然RNA干扰技术的研究历程较短，但其发展速度却超乎人们的想象。在过去的几年时间里，RNAi作为一种新基因疗法，被广泛的应用于病毒感染、癌症、显性遗传病等医学研究中，开辟了“基因治疗(gene-specific therapeutics)”的新理念，小发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)甚至被称为“治病药物”。目前，人们已经开始利用RNAi技术从基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能，可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因，使我们可以更好地研究生物体内基因调控的网络系统。现在RNAi技术已经能够成功治愈哺乳动物细胞、器官及活体的病变，预示着不久的将来，RNAi会成功用于人类疾病的治疗，使得shRNA的“治病药物”称号名副其实。

公知人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。目前的研究认为，细胞坏死是细胞接受刺激后的一种被动的细胞死亡方式，而细胞凋亡则是一种主动的程序性的细胞死亡方式，它是细胞的一种基本生物学现象，细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2基因家族、caspase基因家族、癌基因等，随着分子生物学技术的发展，对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚，而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如神经退行性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等。如果能应用RNA干扰技术特异性地阻抑凋亡相关基因的表达及其蛋白质水平，将可以有效沉默凋亡相关基因，帮助细胞减少凋亡，增进细胞活力。因此，对凋亡相关基因的RNA干扰研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，能有效地筛选药物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗神经退行性疾病等与细胞凋亡相关的疾病开辟新的途径。

目前RNAi技术作为一种主要的分子生物学研究手段，被广泛应用于特异性抑制基因的表达研究。RNAi的作用机制表明：双链RNA分子首先被细胞内RNA酶Dicer降解成21～23个碱基大小的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RNA—induced silencing complex，RISC)，RISC通过碱基配对定位到有同源序列的mRNA上，并在特定位置切割该mRNA，从而抑制该同源基因的表达。siRNA被认为是RNAi的主要效应物。虽然直接转染合成的siRNA能特异性抑制哺乳动物细胞内同源基因的表达，但是细胞内siRNA很容易被降解，不能实现稳定的RNAi。属于RAN聚合酶Ⅲ类的U6启动子可转录产生小发卡RNA，即转录产生一段含有RNA正义链、环（loop）和反义链的小发卡RNA。若向细胞中导入U6干扰质粒(由U6启动子与被干扰基因的发卡样短片段摸板组成)，则由此介导的RNA干扰可较好地克服以上缺点，质粒载体或病毒载体就能在细胞内长时间、稳定地生成siRNA。但质粒载体转染哺乳动物细胞的效率不如病毒载体，尤其是无法转染非分裂相细胞。病毒载体克服了质粒载体不能转染非分裂相细胞的缺点和不足，并能在哺乳动物各类细胞中稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。可以说，病毒载体的出现使RNAi技术经历了一次历史性的跨越。

常用的病毒载体包括单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体(adeno-associated virus，AAV)和慢病毒载体。腺病毒是一种无包膜DNA缺陷病毒，属细小病毒科，是目前世界上动物病毒中最小的病毒，病毒颗粒直径只有20nm，呈二十面体，正负链各半。基因组DNA约有36kb，可编码14种蛋白，具有2个开放性阅读框架和反向末端重复序列，在病毒复制中有重要作用，是病毒的重要顺式顺序。慢病毒是一类反转录病毒的总称，包括多种灵长类慢病毒和非灵长类慢病毒。慢病毒载体则是一类重组反转录病毒载体，由慢病毒经过改造而成，具有更高的生物安全性和外源基因的表达效率。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同，主要由三种包含不同结构的质粒构成，分别是转移质粒、辅助质粒、包膜糖蛋白表达质粒。其中，转移质粒除包含我们感兴趣的外源基因外，同时还保留了病毒的LTR区和其他对病毒的整合复制起重要作用的元件。其中LTR区包含了慢病毒的启动子、增强子、包装信号、整合位点(attachment site，Att)等结构。包装序列能够使识别病毒RNA将其衣壳化并装配到病毒颗粒中，Att位点使病毒基因可以整合入宿主基因。同时转移质粒中还加入了内部启动子驱动外源基因转录。辅助质粒整合进入包装细胞后表达蛋白多聚体gag，编码病毒的衣壳蛋白及病毒的其他模序结构(matrix structure)，同时表达蛋白pol，pol蛋白具有反转录酶及整合酶的活性，负责对病毒载体基因的结构元件进行切割，促使载体基因整合入宿主细胞基因组中。

AAV和慢病毒载体的特点是能作用于非分裂相细胞，而且能与宿主细胞基因组发生整合。但当应用于整体动物时，AAV会被机体内本身存在的AAV抗体识别并发生免疫反应，从而削弱了AAV转导基因的效率。慢病毒载体则不存在这样的问题，与其他反转录病毒载体相比，主要具有如下优点：首先，慢病毒载体既可以感染分裂相细胞，又可以感染分裂缓慢或非分裂期的细胞，包括造血干细胞、神经干细胞、肝实质细胞等等；其次，由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因具有较强的转录后基因沉默作用，在体外细胞培养和体内移植实验中，由慢病毒载体携带导人的目的基因可以在宿主细胞中得到长期稳定的表达，免疫反应很小；再次，慢病毒载体可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和基因组中普遍存在的管家基因的启动子，应用组织特异性启动子和增强子来驱动慢病毒载体中的外源基因能够使其在特定的组织细胞中表达，为慢病毒载体介导的基因靶向治疗提供理论基础；最后，慢病毒载体经过改建后可以容纳约10kb左右的大片段外源基因，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具。

使用RNAi治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列具有同源性的siRNA，转录产生一段含有RNA正义链、环（loop）和反义链的shRNA。向细胞中导入U6干扰质粒形成shRNA，然后通过某种方式将shRNA转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的。其优势在于只抑制疾病相关蛋白的表达，而不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。shRNA可用于治疗任何由于基因发生突变或过度表达所引起的疾病，只要确定了与疾病相关的靶点，即靶基因，就可以通过shRNA特异性地使靶基因保持沉默。所以，寻找最适宜的shRNA，对于RNA干扰的广泛应用至关重要。

caspase基因家族是一类基因结构相似并参与细胞凋亡的基因。根据它们对细胞凋亡结果的不同分为两类，一类是抑制细胞凋亡的基因，另一类是促进细胞凋亡基因，其中caspase-3基因是促进细胞凋亡的基因，其过度表达能够加速与该凋亡基因相关的疾病细胞凋亡，因此对caspase-3 RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义。进一步研究表明，caspase-3不仅是起着凋亡的效应器作用, 还能直接与阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、脊椎小脑失调等疾病的致病蛋白质分子相互作用，参与致病机制。因此，高效、高选择性的caspase-3抑制剂可以为神经退行性疾病的治疗提供新途径。

由于阿尔茨海默病的发病机制尚不完全明确，治疗上也缺乏主动有效的干预手段，因此基因治疗已成为治疗包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病的研究靶点。基因治疗的关键技术之一是有效的siRNA序列设计和筛选。靶基因不同位点的siRNA作用效果差异很大，可能与siRNA的碱基分布、两端自由能大小等有关。关键技术之二是怎样将目的基因转入靶细胞并持续表达，这就需要选择有效安全的基因转染载体。目前基因转染载体主要分为非病毒载体和病毒载体，在众多的转染载体中，只有慢病毒载体能高效感染分裂期和非分裂期细胞，并把基因整合到靶细胞，实现基因的长期稳定表达。多数实验证明，慢病毒载体在体内应用免疫反应小，安全性较好，因此慢病毒载体是当前基因治疗载体研究的热点。用慢病毒载体介导caspase-3基因RNAi的体内外研究，显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中还没有适宜的治疗阿尔茨海默病的shRNA基因试剂的问题，提供一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒。

本发明提供的用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒是一种以慢病毒为载体的能有效抑制神经细胞caspase-3基因表达的shRNA药物。

本发明所提供的试剂盒中包括有：特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体浓缩液200μL，阴性对照的shRNA慢病毒表达质粒载体浓缩液200μL。

其中，所述的特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体由抑制caspase-3基因表达的siRNA构建，抑制caspase-3基因表达的siRNA由21个核苷酸组成，其序列为5’-GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3’。该基因序列的方向从左至右为5’ 端至3’ 端，自5’ 端的第1至第19位核苷酸为核糖核苷酸，第20至第21位核苷酸为脱氧核糖核苷酸。

所述特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体的构建方法是：设计上述特异性抑制caspase-3 siRNA序列，合成针对caspase-3基因的shRNA序列，其序列为：

正义链：5’-TGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATTCAAGAGATTCGGCTTTCCAGTCAGAC TCTTTTTTC-3’；

反义链：5’-TCGAGAAAAAAGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATCTCTTGAATTCGGCTTT CCAGTCAGACTCA-3’；

退火形成两端含酶切位点粘端的双链DNA，与经Hpa I和Xho I双酶切回收的pFU-GW-RNAi载体连接，以连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养，对克隆产物进行PCR鉴定、DNA测序，鉴定阳性克隆即为构建成功的特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体，用包装质粒pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。

本发明所提供的以慢病毒为载体的caspase-3 shRNA试剂盒可用于阿尔茨海默病动物模型的基因治疗。该shRNA序列或由此得到的试剂通过某种方式进入到动物模型体内时，可以比以往任何手段更高效、特异、方便的抑制疾病相关蛋白的表达，使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的，其优势在于不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。

本发明针对caspase-3基因序列设计合成出的shRNA，经QRT-PCR及免疫组织化学法检测，可以有效抑制caspase-3基因表达，从而显著降低神经细胞的凋亡和坏死，并在原代培养神经细胞上验证了设计合成并筛选出的以病毒为载体的caspase-3 shRNA对神经细胞凋亡的抑制作用。

本发明所提供的caspase-3 shRNA试剂盒不但可以用于阿尔茨海默病动物模型的基因治疗，也可以用于体外培养细胞的RNAi实验，或者用于体内实验。对动物脑神经细胞损伤和原代培养神经细胞损伤的抑制作用，可以降低损伤神经细胞的凋亡、坏死率、改善动物脑神经细胞的学习记忆功能损伤和降低阿尔茨海默相关标志蛋白的表达。

附图说明

图1为pGCsiL-GFP质粒载体图谱。

图2为pFU-GW-RNAi质粒载体图谱。

图3为酶切电泳图谱。

图4为琼脂糖凝胶电泳图片。

图5为pGC-LV 载体图谱。

图6为pHelper 1.0载体图谱。

图7为pHelper 2.0载体图谱。

图8为各组c-caspase-3蛋白表达情况。

具体实施方式

实施例1：特异性shRNA序列的设计合成。

根据caspase-3基因序列（NM_009810），应用Ambion公司的RNA干扰设计软件，设计caspase-3基因特异性siRNA序列为：

正义链：5’-GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3’

反义链：5’-TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC-3’。

并通过BLAST同源性分析，排除了非特异性抑制其他基因序列的可能。

caspase-3 siRNA及其阴性对照的序列为：

基因	物种	5’向3’顺序	GC%
				caspase-3 siRNA	mouse	GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA	52.63%
阴性对照 siRNA	mouse	GAACGTGACACGTTCGGAGAA	55.32%

根据pGCsiL-GFP载体（图1）多克隆位点，在shRNA片段两端设计相应Age I 和Eco R I酶切位点，确定caspase-3基因特异性shRNA序列为：

正义链：5’-TGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATTCAAGAGATTCGGCTTTCCAGTCAGAC TCTTTTTTC-3’；

反义链：5’-TCGAGAAAAAAGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATCTCTTGAATTCGGCTTT CCAGTCAGACTCA-3’；

阴性对照shRNA序列为：

正义链：5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGA ATTTTTG-3’；

反义链：5’-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTC GGAGAA-3’。

引物退火形成带粘性末端的双链，将上述合成的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温。

实施例2：RNA干扰慢病毒质粒载体的构建。

1、shRNA质粒载体的构建

经Hpa I和Xho I双酶切回收pFU-GW-RNAi载体（图2）以使其线性化，酶切反应体系为：

纯化的DNA质粒(1μg/μL)	2μL
		10×buffer	5μL
100×BSA	0.5μL
		Hpa I (10 U/μL)	1μL
Xho I(10 U/μL)	1μL
		H2O	40.5μL
总计	50μL

将上述混合的反应物置于37℃，1 h，酶切反应结果见图3。

2、感受态制备：

用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态细胞：

1）从在37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个DH5α单菌落，转到一个含有100mL LB或SOB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养3h（旋转摇床，300转/min）；

2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50mL聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；

3）于4℃，以4000转/min离心10min，回收细胞；

4）倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；

5）以10mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上；

6）于4℃，以4000转/min离心10min，回收细胞；

7）倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；

8）每50mL初始培养物用2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

将大肠杆菌DH5α感受态细胞分装成小份，放于-70℃冻存。

3、克隆制备：

1）连接

按照以下连接反应体系：

于16 ℃连接过夜，将caspase-3 shRNA插入pFU-GW-RNAi载体中；

2）转化

（1）用冷却的无菌吸头从感受态细胞悬液中各取200μL转移到无菌的微量离心管中，每管加2μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；

（2）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90s，不要摇动试管；

（3）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l～2min；

（4）每管加800μL SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏；

（5）将150μL已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性（100ug/mL）的LB琼脂培养基上；

（6）将平板置于室温直至液体被吸收；

（7）倒置平皿，于37℃培养，16h。

4、阳性克隆的PCR鉴定、DNA测序：

PCR反应体系：

试剂	体积（μL）
		10×buffer	2
dNTPs (2.5mM)	0.8
		Primer（﹢）	0.4
Primer（﹣）	0.4
		Taq polymerase	0.2
Template	1
		ddH2O	补足20

PCR引物：

上游5’-GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3’；下游：5’-GAGGCCAGATCTTGGGTG-3’；

在PCR仪中，按以下循环条件进行反应：

琼脂糖凝胶电泳结果见图4，PCR条带大小：

连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：343bp (从载体中切掉15bp)；

没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：299 bp；

挑选阳性克隆菌落，使用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，进行DNA测序，结果如下：

CTTCTTCGTCGACATAGAGGCTTATGTGCGATAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTGAGTCTGACTGGAATGCCGAATCCCTTTTGTTTTCTTAACCGGATCCCTTCGGAGGGCTCTCCAGCTTGACGATGATTGTGCTAAAATTCTGTCGCAATATCAATGCGACCACGTCCGCATGGCGGTTGACGCCCCCAAAACCCGACTCCGGCCCTCAACGCTCCCGAATGCGGATCCGTGCGCTCTTGACACCGACGCAGCGGCCATATCCACTTGGACTGCTTTGCGCATTTCTCTTAGCATACATATCCCCCTCTATGAGGACAACCAATTGCAATCGGACGTTATTATCGGATTGATGGCTGCACGGCCTGATCCATTAAGGATTGCATCGAATTGCCTTACAGACGGCCCAGACTTATCCCAGACTGATGCCCCGCAAGCGACGGTGCTGATTACGTCTGAGAGTCATTACCTTCATCTCATCCACACGTTCGATACAGTCTGTAAAAAATACATCTTTCAGTCGTGAGCAGAGTGTCTATTTGAGAGGATGTTTGCTGCATCATCGGACACATCCCTGGTGTGCTCGAAGCGGCTATTAGGCAGCCGCCATCGTCCAAATAGCTTCTGCTCGGTCGAAACACATGCACTCGCTCTCCTAGATCATATGTCAGACCAGAGGACAACTTGCGATTATCAGGCGTTAGGTCTCTTTTTGATCAGCAGCGTACCATCTTTCTGCCGCGTCAACACATGTGATCTGATGCTCCTGGTTCGCTGGCTAGCAAAGGAAAGAATCGGAAAAATTGGTCGCATGTGTTCTAGAAGCTCCAATTCCACTTCCTTCTGCTGATGAAGATGACCG

PSC1861   TGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATTCAAGAGATTCGGCTTTCCAGTCAGACTCTTTTTTC

琼脂糖凝胶电泳结果可见一条约200bp的小片断和一条小于500bp的载体片断。测序结果表明，慢病毒载体质粒序列正确。

实施例3：慢病毒包装。

慢病毒包装系统由三种质粒载体pGC-LV（图5）、pHelper 1.0（图6），pHelper 2.0（图7）组成，对三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按 Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

慢病毒包装细胞293T为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10%FBS)，37℃、5%CO₂培养箱内培养，贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

1、病毒载体DNA液的制备：

以质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒（pGC-LV、pHelper 1.0、pHelper 2.0） DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间。

2、细胞转染：

1）转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.0×10⁷细胞/20mL，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5%CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；

2）转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；

3）向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5mL，在室温下温育5分钟；

4）将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4mL Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟；

5）把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合；

6）混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物；

7）将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃， 5%CO₂细胞培养箱中培养；

8）培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20mL的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去；

9）每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25mL，于37℃、5%CO₂培养箱内继续培养48h。

3、病毒的收获及浓缩：

1）收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液；

2）于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；

3）以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中；

4）把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19mL），盖上盖子，将过滤杯插到滤过液收集管中；

5）组合好后，做好平衡，放在转头上；

6）在 4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积，通常需要的时间为10～15min；

7）离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；

8）将过滤杯倒扣在样品收集杯上；

9）离心力不超过1000g，时间为2min，过高转速会导致样品损失，把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液；

10）将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。

取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

实施例4：慢病毒滴度的测定（逐孔稀释法测定）。

1）滴度检测前一天，对293T细胞传代，96孔板每个孔中加4×10⁴个细胞，体积100μL。

2）次日，准备7～10个无菌EP管，在每个管中加入90μL新鲜完全培养基（DMEM +10% FBS，高糖）。

3）取待测定的病毒原液10μL加入到第一个管中，混匀后，取10μL加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

4）选取所需的细胞孔，吸去90μL培养基。按照病毒浓度梯度依次加入稀释好的病毒溶液，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

5）48h后，每孔加入新鲜培养基100μL。小心操作，不要吹起细胞。

6）4d后，观察荧光表达情况。正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。数出最后两个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数。将得到的数值各自除以相应的稀释倍数就得到了病毒原液的滴度值。

7）病毒滴度计算

第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1μL；

第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 μL；

第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μL；

依次类推……

第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μL；

第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μL；

在加入1E-6μL病毒原液的孔中观察到1个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有1个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，就是1/(1E-6)=1E+6，单位为TU/μL，也就等于1E+9TU/mL。

实施例5：阿尔茨海默病动物模型的shRNA治疗。

本实施例采用成熟的铝中毒阿尔茨海默病动物模型制备方法，并对造模动物进行以慢病毒为载体的shRNA治疗。从动物行为学改变(Morris水迷宫实验、旷场实验、跳台实验)、神经细胞凋亡率、海马细胞线粒体膜电位的变化、凋亡相关c-cas3蛋白表达量的测定以及阿尔茨海默病动物的标志蛋白APP、Tau蛋白表达变化来反映阿尔茨海默病动物治疗前后的效果。

1、实验动物及造模。

健康3月龄雄性昆明小鼠32只，体重25～30g，活动能力相近，由山西医科大学动物中心提供。在动物室适应性喂养一周后，按体重随机分为4组，每组8只，即空白对照组（生理盐水4μL），Al+RNAi阴性对照组（0.5%AlCl₃·6H₂O 3μL+阴性对照慢病毒载体浓缩液1μL），染铝组（0.5%AlCl₃·6H₂O 3μL+生理盐水1μL），Al+RNAi病毒组（0.5%AlCl₃·6H₂O 3μL+特异性抑制caspase-3基因的慢病毒载体浓缩液1μL）。小鼠腹腔注射5 %水合氯醛（0.006mL/g）麻醉，固定于小鼠脑立体定位仪上，调节定位仪使动物头部左右对称，前后囟处于同一水平面上，沿颅顶正中剪开头皮暴露颅骨，根据脑立体定位图谱确定侧脑室（前囟后0.58mm，向右旁开1.3mm，深度2.2mm）位置，用微型电钻在此位置上方颅骨相应部位开一小孔（孔径约1.0mm）。将微量进样器置于微量注射泵并注入侧脑室，注射剂量为4μL，2min注射完毕，连续染毒5天。隔天腹腔注射青霉素以抗感染。观察记录动物一般情况，将实验前3天体重下降大于6g的动物排除实验。整个染毒期间，动物室以自然节律采光，温度19～23℃，湿度40％～60％，清洁，安静。

2、Morris水迷宫实验检测治疗前后对动物神经行为能力的影响。

为了检测动物模型的造模效果及shRNA治疗试剂盒对动物神经行为能力的影响，在染毒结束后进行Morris水迷宫实验（Morris water maze，MWM）。Morris水迷宫由白色圆柱形水池和一可移动位置和调节高度的透明有机玻璃站台组成。圆形水池直径为100cm，高75cm，平台高度50cm，直径10cm，池壁由白色金属板组成。池内水深30cm，平台低于水面lcm，水温22±2℃。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹。实验期间迷宫外参照物保持不变。

定位航行实验（place navigation）：小鼠连续接受4天训练，每天4次，每次间隔20min，记录小鼠分别从四个不同象限入水点入水找到平台所需的时间，即逃避到平台上的潜伏期 （escaping latency）。4次潜伏期成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计。如果小鼠在60s内未找到平台，其潜伏期按60s计算。

空间搜索实验（spatial probe test）：实验第5天撤除平台，从任一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录60s内小鼠的游泳轨迹，观察分析小鼠停留目标象限的时间。

在定位导航实验中，染铝组和Al+RNAi阴性对照组较空白对照组的逃避潜伏期增加 （P<0.05），Al+RNAi病毒组较染铝组的逃避潜伏期减少（P<0.05）；在空间搜索实验中，染铝组第三象限停留时间显著缩短（P<0.05），阴性对照组和RNAi病毒组无显著差别（P＞0.05），见表1。

3、旷场实验检测治疗前后对动物神经自主反应能力的影响。

为了检测动物模型的造模效果及shRNA治疗试剂盒对动物神经自主反应能力的影响，在染毒结束后进行旷场实验检测。实验装置为木制旷场（100cm×100cm×30cm），箱底划分成25 个20cm×20cm方格，沿四壁格称为外周格，其余为中央格。将试验小鼠放置在中央格，观察 5min内跨格次数、中央格停留时间、直立次数、修饰次数。

旷场试验中，与空白对照组比较，染铝组的中央格停留时间增加（P<0.05），跨格次数、直立次数、修饰次数减少（P<0.05），Al+RNAi阴性对照组中央格停留时间增加（P<0.05），直立次数、修饰次数减少（P<0.05），Al+RNAi病毒组与染铝组的各项指标之间的差异均有统计学意义（P<0.05），结果见表2。

4、跳台实验检测治疗前后对动物学习记忆能力的影响。

为了检测动物模型的造模效果及shRNA治疗试剂盒对动物学习记忆能力的影响，在染毒结束后进行跳台实验检测。经多组比较的单因素方差分析可得，与空白对照组相比，染铝组的潜伏期（LT）缩短（P<0.05）、错误次数（EN）增加（P<0.05），Al+RNAi阴性对照组的LT缩短（P<0.05）、EN的差别无统计学意义（P>0.05），与染铝组相比，Al+RNAi病毒组LT增加（P<0.05)，EN减少（P<0.05），（见表3)。

5、流式细胞术检测法检测治疗前后对动物神经细胞死亡的影响。

为了检测shRNA治疗试剂盒对阿尔茨海默病动物模型神经细胞的影响，在染毒结束后进行了流式细胞术检测。断头取脑，分离一侧小鼠海马和皮质，皮质用于蛋白的测定，剪碎海马，用0.25%胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，于4℃、1000r/min离心5min。用PBS洗2次，加入Annexin-V（20μg/mL）5μL，避光反应15min后，加入400μL Binding Buffer。立即用FACSscan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照。

与空白对照组相比，染铝组和Al+RNAi阴性对照组的凋亡率显著升高，差别有统计学意义（P< 0.05）；而Al+RNAi病毒组与染铝组相比，凋亡率显著降低（P<0.05），见表4。

6、Rhodamine 123荧光标记法检测治疗前后海马细胞线粒体膜电位的变化。

为了检测shRNA治疗试剂盒对阿尔茨海默病动物模型的神经细胞功能的影响，在染毒结束后进行了海马神经细胞线粒体膜电位的检测。断头取脑，分离一侧小鼠海马和皮质，皮质用于蛋白的测定，剪碎海马，用0.25%胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，用细胞培养液终止消化，于4℃、1000r/min离心5min，再加入1mL的细胞培养液（该培养液按照1mg/mL的剂量加入5μL罗丹明），使其终浓度为0.2mg/mL，37℃避光孵育30min，然后以1000r/min离心 5min，弃上清，用PBS清洗一次，然后加入适量PBS吹打均匀即可，用流式细胞仪检测平均荧光强度，最大激发波长为507nm，最大发射波长为529nm。

与空白对照组相比，染铝组荧光强度减弱（P<0.05），荧光强度峰值向左移，Al+RNAi病毒组荧光强度较染铝组增强（P<0.05），荧光强度峰值向右移；Al+RNAi阴性对照组（4.48±0.66）与染铝组比较未见明显变化（P>0.05），见表5。

7、Western blot 法检测治疗前后 c-cas3蛋白表达量的改变。

将冷冻的脑组织加入细胞裂解液（0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris/HCl，pH=7.6，1mmol/L EDTA，pH=8.0，100μg/mL PMSF，2μg/mL Leupeptin），冰上超声破碎细胞，于4℃，12 000r/min离心15min，取上清，用BCA试剂盒进行总蛋白定量，调蛋白浓度一致，与等体积的2×上样buffer混匀，沸水浴煮沸10min。根据浓度确定上样体积。每孔上样25μg，10%的SDS-PAGE 分离样品，80V电压电泳2h左右。湿式转膜，恒流400mA，40min将蛋白转至PVDF膜上，用5%的牛奶封闭液37℃封闭3h，将膜置于一抗稀释液（1/1000）中，4℃过夜，PBST洗4次，15min/次，将膜置于生物素化二抗稀释液（1/2000）中，37℃孵育2h，PBST洗4次，15min/次，将膜置于辣根酶标记生物亲和素稀释液（1/2000）中，37℃孵育2h，PBST洗4次，15min/次，将清洗后的膜与化学发光（ECL）检测试剂（用量为0.20mL/cm²）共同孵育1min，曝光 1min～10min不等，获得蛋白条带。采用捷达801系列凝胶电泳图像分析系统对Western blot 检测的样本c-cas3蛋白和β-Actin内参的结果进行定量分析，然后计算待测蛋白与β-Actin光密度（OD）的比值，比较两组ODc-cas3/ODβ-Actin值的大小。

Western blot结果见图8，与空白对照组相比，染铝组c-cas3蛋白表达显著增高（P＜0.05），Al+RNAi组（0.19±0.09）无统计学差别（P＞0.05），但与染铝组相比，Al+RNAi病毒组c-cas3蛋白表达明显降低（P＜0.05 ），而Al+RNAi阴性对照组未见明显作用（P＞0.05）。详细数据见表6。

8、Western blot法检测治疗前后AD标志蛋白 APP、Tau 的表达变化。

1）配制12%的分离胶和5%的积层胶，根据浓度确定上样体积。每孔上样25μg，以80V 电压恒压跑胶，当蛋白跑过积层胶时加压为120V，恒压直至蛋白跑至胶的底部；2）将跑好的胶取下，400mA电流作用38min转移蛋白至0.45μm PVDF膜上；3）用丽春红染色观察移至PVDF膜上的蛋白条带，0.02mol/L PBST洗膜，5min×2次；4）用封闭液37℃封闭120min；5）加入抗体稀释液稀释的一抗（浓度均为1:10000），4℃过夜，0.02mol/L PBST洗膜，15min×4次；6）加入抗体稀释液稀释的生物素化二抗（浓度均为1:1000），37℃2h，0.02mol/L PBST洗膜，15min×4次；7）加入0.02mol/L PBST稀释的辣根酶标记链亲和素（1:1000），37℃2h，0.02mol/L PBST洗膜，15min×4次；8）用ECL进行化学发光，在使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用；9）用镊子取出膜，打在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥，将膜完全浸入并与发光工作液（0.125mL发光工作液/cm²）充分接触，根据室温孵育15min，准备立即压片曝光；10）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干工作液，但勿洗去发光液；11）在X光胶片盒内铺一张面积大于膜的保鲜膜，将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和褶皱，用胶带将其固定在暗盒内；12）在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟，然后显影冲洗；13）扫描仪扫描，采用捷达801系列凝胶电泳图像分析系统对Western-blot结果进行分析，然后计算待测蛋白与β-actin光密度（IOD）的比值，比较各组间IOD样本/IODβ-actin的大小。具体结果见表7。

结果显示：同与空白对照组比较，1mM染铝组APP、Tau蛋白的表达有显著升高（P＜0.05）；但是1mM染铝组APP、Tau蛋白的表达与Al+RNAi阴性对照组未见明显差异（P＞0.05）。同1mM染铝组相比较，Al+RNAi病毒组APP、Tau蛋白的表达有显著性下降（P＜0.05）。 APP、Tau表达量测定结果表明，siRNA可以显著抑制阿尔茨海默相关标志蛋白APP、Tau蛋白的表达，参考转染后的神经行为检测结果，该shRNA基因治疗试剂盒可以显著抑制阿尔茨海默病的发生及进展。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 山西医科大学

 

<120>一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的 shRNA 试剂盒

 

<160> 2

 

<170> Patentin version 3.2

 

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

 

<220>

<223> 抑制caspase-3基因表达的shRNA序列的正义链

 

<400> 1

tgagtctgac tggaaagccg aattcaagag attcggcttt ccagtcagac tcttttttc                 59

 

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial sequence

 

<220>

<223> 抑制caspase-3基因表达的shRNA序列的反义链

 

<400> 2

tcgagaaaaa agagtctgac tggaaagccg aatctcttga attcggcttt ccagtcagac tca            63

 

Claims (2)

1.一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒，其特征是所述的试剂盒中包括有特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体浓缩液和阴性对照的shRNA慢病毒表达质粒载体浓缩液，所述的特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体中，shRNA的序列为：

正义链：5’-TGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATTCAAGAGATTCGGCTTTCCAGTCAGAC TCTTTTTTC-3’；

反义链：5’-TCGAGAAAAAAGAGTCTGACTGGAAAGCCGAATCTCTTGAATTCGGCTTT CCAGTCAGACTCA-3’。

2.根据权利要求1所述的用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒，其特征是所述的特异性抑制caspase-3基因的shRNA慢病毒表达质粒载体根据抑制caspase-3基因表达的siRNA来设计合成，该抑制caspase-3基因表达的siRNA的序列为5’-GAGTCTGACTGGAAAGC CGAA-3’。

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