CN105087651B - 一种抑制wipi2基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用 - Google Patents
一种抑制wipi2基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抑制WIPI2基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。本发明在HBV稳定表达的HepG2.2.15细胞中，大规模功能性地沉默人基因组中所有激酶基因和自噬基因，经过实验筛选出的WIPI2基因为可以抑制HBV分泌的阳性基因，并且进一步确定出阳性基因WIPI2的有效shRNA片段，本发明系统性阐明激酶以及宿主细胞自噬对HBV复制的影响，揭示了激酶信号和自噬调控网络在HBV－宿主－肝癌三者之间的关系，为新一代抗HBV治疗提供新药物靶点和理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制WIPI2基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒HBV基因组仅编码少数蛋白，但需要完成包括入侵、复制、组装和分泌复杂的病毒生活史，宿主细胞参与了HBV生活周期中各个阶段，HBV的感染过程严重依赖宿主蛋白和HBV蛋白的直接和间接相互作用，因此作用于宿主细胞因子为治疗HBV感染提供了靶点。
激酶是一类从高能供体分子(如ATP)转移磷酸基团到特定靶分子(底物)的酶,在细胞信号通路中起着重要的调控作用，参与了细胞地增殖，凋亡，代谢，转移等过程,激酶抑制剂已成为肿瘤治疗中最重要的一类靶向药物。近些年来，相继发现FAK,Src,PI3K等激酶参与HBV的感染过程，人的宿主细胞内共有784个激酶，目前仅发现少数激酶与HBV相关，大多数激酶蛋白在HBV感染过程中的作用尚不明确。
在宿主作用因子所参与的病毒感染过程中，自噬(Autophagy)与病毒感染及其引发的免疫反应密切相关。病毒具有较强的免疫原性，能导致机体产生抗病毒免疫应答，细胞自噬参与了多种病毒感染后产生的免疫反应，HBV病毒感染细胞后，诱导宿主细胞发生自噬，产生自噬小泡。因此，研究HBV与细胞自噬的相互作用，不仅有助于阐明HBV病毒感染的分子机制，更为寻找鉴定治疗HBV的药物靶点提供一个有效的突破口。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制WIPI2基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用，利用本发明所述抑制剂可以有效抑制目的基因WIPI2的表达，从而阻断了宿主激酶与HBV蛋白的作用，有效抑制了HBV细胞的生长。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种抑制WIPI2基因表达的抑制剂，它包括带有有效抑制WIPI2基因表达的shRNA序列的载体，所述shRNA序列为：
F：
GATCCGGGAGACCGTGCACATCTTCAAAGGTACCTTTGAAGATGTGCACGGTCTCTTTTTG；
R：
AATTCAAAAAGAGACCGTGCACATCTTCAAAGGTACCTTTGAAGATGTGCACGGTCTCCCG。
所述WIPI2基因包含有序列为GAGACCGTGCACATCTTCAAA的目的基因片段。
所述载体为pUCTP。
本发明还提供了所述的抑制WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。
将所述shRNA与载体连接后形成慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质粒经扩增后与包装辅助质粒共转染293T细胞，转染后培养并收集上清病毒液，通过超离心浓缩病毒，得到高滴度的慢病毒浓缩液，将所述病毒浓缩液感染带有HBV的宿主细胞。
所述扩增为：将所述慢病毒表达质粒转入GeneHogs化学感受态细菌，经PCR扩增选取阳性克隆后提取的质粒即为扩增后的慢病毒表达质粒。
转染后培养48-72h收集上清病毒粗液。
所述宿主细胞为HepG2.2.15细胞。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在HBV稳定表达的HepG2.2.15细胞中，大规模功能性地沉默人基因组中所有激酶基因和自噬基因，经过实验筛选出的WIPI2基因为可以抑制HBV分泌的阳性基因，并且确定出阳性基因WIPI2的有效shRNA片段，本发明系统性阐明激酶以及宿主细胞自噬对HBV复制的影响，揭示了激酶信号和自噬调控网络在HBV－宿主－肝癌三者之间的关系，为新一代抗HBV治疗提供新药物靶点和理论依据。
附图说明
图1是载体pUCTP的构建图谱；
图2是菌落PCR的电泳图谱，阳性克隆应扩增出170bp左右片段；Marker从上而下大小依次为：600bp/500bp/400bp(最亮)/300bp/200bp/100bp；
图3是酶切验证的电泳图谱，每个目的片段选取2个阳性克隆用KPNI酶切2.95Kb+7.5Kb产生片段；Marker从上而下依次为：10000bp/8000bp/6000bp/5000bp/(最亮)/4000bp/3000bp/2000bp/1500bp/1000bp/500bp；
图4表明携带目的基因WIPI2的慢病毒载体在293T细胞中成功组装；
图5是筛选结果Z-score散点统计图；
图6是5个阳性基因对应的沉默效率；
图7是5个阳性基因对应的HBV分泌抑制率；
图8表明含有WIPI2的病毒上清液成功转染目的细胞HepG22.2.15。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
本发明的技术方案包括以下实验步骤：
1、高通量制备人激酶组RNAi慢病毒文库
首先完成784个激酶基因和308个自噬基因(这些基因的基因序列在NCBI中均已公布)的慢病毒文库构建工作，针对每个基因，设计8条shRNA，编号A-H，以保证每个基因至少有1-2条shRNA有效抑制其表达。
高通量慢病毒包装时，将A-D质粒混合，E-H混合，分别包装，因此每基因针对2个病毒，分别包含4条shRNA序列；
(1)慢病毒文库质粒构建
A.shRNA引物设计与合成(以WIPI2为例)
B.载体构建图谱如图1所示，选用的载体为pUCTP。
C.shRNA引物退火
D.连接至慢病毒载体pUCTP
a)连接体系：
24℃×2h
b)转化：取5ul连接产物转化GeneHogs化学感受态细菌。
c)菌落PCR的电泳图谱如图2所示。
E.酶切验证的电泳图谱如图3所示。
(2)慢病毒文库包装(以WIPI2为例)
1)混合质粒包装：
慢病毒表达质粒与包装辅助质粒共转染293T细胞
a、293T细胞的准备：转染前一天，胰酶消化处于对数生长期生长状态良好的293T细胞，以合适比例接种至96孔板中。
b、细胞接种24h后，按transfection reagent的说明书进行转染操作。对于1个孔，所需加入的DNA的总量为0.1.25μg(包含慢病毒表达质粒及3D LV packaging Mix)，转染试剂3D transfection reagent为0.25μl，稀释病毒液所用的无血清DMEM培养基的体积为4μl×2。在病毒包装过程中，把A-D shRNA慢病毒质粒混合，E-H混合分别进行包装病毒，因此每个基因对应两个混合病毒。
c、转染图片如图4所示，证明携带目的基因WIPI2的慢病毒载体在293T细胞中成功组装。
2)病毒液的收集：转染后48h及72h分别收集上清病毒粗液，并于-80℃保持。
2、初筛—慢病毒文库感染HepG2.2.15细胞，ELISA检测细胞上清中HBV的含量
筛选前，预先进行高通量RNAi条件摸索和ELISA检测条件确定。在96孔板中，使用含784个激酶基因和308个自噬基因的慢病毒文库感染可以分泌HBV病毒的HepG2.2.15细胞，并且为了保证筛选实验的可靠性分别在三块板中设置同样的重复。感染120个小时后，ELISA检测上清中HBV病毒分泌量，同时MTS检测细胞活性，从而得以计算出单位细胞HBV分泌相对值，并计算出每个孔的z-score值，z-score绝对值大于1.96则表示，在统计学意义上该基因沉默后可显著影响HBV的分泌。
1)慢病毒感染
A.目的细胞的培养：目的细胞培养于1640+10％FBS+1％Pen-Strep+1％NEAA中。
B.细胞准备：指数期生长、状态良好的目的细胞生长至70％～80％密度时，传代，并以合适的比例接种于96孔板内，使得第二天细胞密度达10％左右。
C.细胞接种后第二天，用shRNA慢病毒文库进行感染。
2)MTT检测
感染后96h后，各孔内(包含blank)加入MTS混合液10ul/100ul培养基。37℃孵育0.5-4h后去，酶标仪检测A590。
3)ELISA检测
A.使用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)为上海科华生物股份有限公司生产，产品编号为YBS00192010；
B.操作按使用说明；
C.配置工作浓度洗涤液(以纯化水做25倍稀释，待用)；
D.加入75ul待测样本(也即稀释1倍的细胞上清液)；
E.用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育60分钟；
F.取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本的孔中加入50ul酶结合物；
G.手工轻轻震荡10秒；
H.用封片纸覆盖反应板后，置于37℃孵育30分钟；
I.取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次；
J.洗涤结束后立刻在所有孔内加入A，B显色液各50ul；
K.手工轻轻震荡10秒；
L.封片纸覆盖后，37℃孵育30分钟；
M.在所有孔内加入50ul终止液，震荡反应板5秒，使之充分混匀；
N.用酶标仪读书，波长450nm。
如图5所示，初筛实验中共得到77个RNAi pool，这77个RNAi pool的z-score值均大于1.96，共针对73个基因。基因沉默后的单位细胞HBV分泌相对值与阴性对照组单位细胞HBV分泌相对值的比值，即Ratio to Ctr。
3、初筛验证—针对初筛所有阳性基因，ELISA检测进行二次重复在96孔板中筛选时，每个基因用上述病毒进行感染，且采用3孔平行。感染后120小时，对上清液进行ELISA检测(代表上清中HBV的滴度)，同时对细胞活性进行MTS检测(代表或细胞数量)
根据生物学意义Ratio to Ctr，将z-score绝对值大于1.96，同时满足Ratio toCtr值大于1.5或小于0.7定义为阳性RNAi pool，即primary high-throughput screeninghit，共51个RNAi pool,48个基因。
如初筛条件一样，对筛选实验中的51个阳性RNAi pool进行了重复，即初筛验证。根据Ratio to Ctr计算，得到了38个RNAi pool(74.5％)得到重复,共35个基因。数据分析时将Ratio to control分级，抑制率为0.2-0.7为一级,0.7-1.5为二级,大于1.5为三级。两次重复的抑制率若在同一个等级，则认为两次重复结果一致。基因列表1如下。
表1 筛选的阳性基因
| No | Gene symbol | Ratio to Ctr(初筛) | Ratio to Ctr(重复) | Functional |
| 1 | PIP5K1B | 3.461 | 2.195 | Kinase |
| 2 | BIRC6 | 2.946 | 1.677 | Autophagy |
| 3 | TNK1 | 2.012 | 1.759 | Kinase |
| 4 | DNAJB9 | 1.770 | 1.591 | Autophagy |
| 5 | LIMK1 | 1.718 | 1.500 | Kinase |
| 6 | ULK2 | 1.683 | 1.682 | Kinase；Autophagy |
| 7 | PSKH2 | 1.578 | 1.529 | Kinase |
| 8 | PPP1R15A | 1.554 | 1.529 | Autophagy |
| 9 | IRAK2 | 1.532 | 2.275 | Kinase |
| 10 | CHMP4B | 0.656 | 0.585 | Autophagy |
| 11 | IBTK | 0.659 | 0.666 | Kinase |
| 12 | EPHB2 | 0.603 | 0.509 | Kinase |
| 13 | DCLK2 | 0.593 | 0.344 | Kinase |
| 14 | POLR2A | 0.562 | 0.404 | Autophagy |
| 15 | MYLK4 | 0.545 | 0.694 | Kinase |
| 16 | CSNK1A1L | 0.530 | 0.285 | Kinase |
| 17 | PIK3C3 | 0.529 | 0.407 | Kinase；Autophagy |
| 18 | DSPP | 0.524 | 0.468 | Autophagy |
| 19 | MARK1 | 0.469 | 0.521 | Kinase；Autophagy |
| 20 | CDKN1A | 0.462 | 0.435 | Kinase；Autophagy |
| 21 | MYT1 | 0.447 | 0.565 | Kinase |
| 22 | IKBKB | 0.443 | 0.527 | Kinase；Autophagy |
| 23 | PKD1 | 0.422 | 0.493 | Kinase |
| 24 | POC1A | 0.419 | 0.455 | Autophagy |
| 25 | TP53INP1 | 0.419 | 0.410 | Autophagy |
| 26 | PLK4 | 0.416 | 0.393 | Kinase；Autophagy |
| 27 | SGK3 | 0.407 | 0.572 | Kinase；Autophagy |
| 28 | TTN | 0.404 | 0.426 | Kinase |
| 29 | ROS1 | 0.373 | 0.577 | Kinase |
| 30 | PIK3CG | 0.348 | 0.405 | Kinase；Autophagy |
| 31 | WIPI2 | 0.353 | 0.467 | Autophagy |
| 32 | RAB5C | 0.341 | 0.601 | Autophagy |
| 33 | WIPI2 | 0.287 | 0.439 | Autophagy |
| 34 | AKT2 | 0.255 | 0.267 | Kinase；Autophagy |
| 35 | LRRK1 | 0.239 | 0.368 | Kinase |
4、数据统计分析
根据每个基因RNAi和对照NC的“单位细胞HBV分泌相对值”的比较来确定基因在knockdown后HepG22.2.15分泌HBV的能力变化；单位细胞HBV分泌相对值＝ELISA检测值/MTS检测值；
数据统计：将每个样本的单位细胞HBV分泌相对值换算为log2(sample value)，根据Z score值计算出每个样本的Z score值Robust Z-score＝x-median(sample)/MAD(sample)*1.4826，X为每个样本单位细胞HBV分泌相对值的log2，然后选取Z-sore绝对值大于1.96的最为阳性基因进行验证。
5、阳性片段验证—针对阳性基因，每个基因分别独立包装8个shRNA慢病毒，ELISA检测筛选有效片段
针对初筛验证中的阳性RNAi pool，选取基因沉默后抑制单位细胞HBV分泌相对值大于30％的RNAi pool,分别独立包装4个shRNA片段慢病毒感染HepG2.2.15细胞，同时在三块96孔板中设置同样的重复。感染120个小时后，ELISA检测上清中HBV病毒分泌量，同时MTS检测细胞活性，得以计算出单位细胞HBV分泌相对值，从而筛选出阳性基因WIPI2的有效shRNA片段。结果如图6和7所示。
WIPI2基因包含有序列为GAGACCGTGCACATCTTCAAA(SEQ ID No:17)的目的基因片段，其引物序列是：
F：
GATCCGGGAGACCGTGCACATCTTCAAAGGTACCTTTGAAGATGTGCACGGTCTCTTTTTG(SEQ IDNo:1)；
R：
AATTCAAAAAGAGACCGTGCACATCTTCAAAGGTACCTTTGAAGATGTGCACGGTCTCCCG(SEQ IDNo:2)。
本发明筛选出WIPI2基因的有效shRNA片段后，使用有效shRNA片段感染HepG2.2.15细胞96小时后，收取细胞RNA样品，qPCR检测目的基因的knockdown效果。结果显示WIPI2的有效shRNA片段可以有效地抑制目的基因表达，沉默效果达60％以上。
本发明以HepG2.2.15为HBV研究模式细胞，以ELISA和MTT为检测手段，使用人激酶和自噬相关基因RNAi慢病毒文库共1092个基因，经过初筛，初筛重复验证后，共筛选出35个(3.2％)宿主基因参与HBV感染的调控。进一步利用生物信息学分别对35个阳性基因进行分析，并经过shRNA短片独立包装病毒感染和qPCR验证，WIPI2基因均筛选出有效的shRNA片段，发现其中WIPI2基因与HBV基因组蛋白有密切联系。这个基因与HBV的相关性均未曾被报道过。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛市市立医院
<120> 一种抑制WIPI2基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用
<130>
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatccgggag accgtgcaca tcttcaaagg tacctttgaa gatgtgcacg gtctcttttt 60
g 61
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aattcaaaaa gagaccgtgc acatcttcaa aggtaccttt gaagatgtgc acggtctccc 60
g 61
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatccgggct gtcaatcaac aacgacaagg taccttgtcg ttgttgattg acagcttttt 60
g 61
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
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aattcaaaaa gctgtcaatc aacaacgaca aggtaccttg tcgttgttga ttgacagccc 60
g 61
<210> 5
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<212> DNA
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<400> 5
gatccgggct aaaggtttgc cactttaagg taccttaaag tggcaaacct ttagcttttt 60
g 61
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<213> 人工序列
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g 61
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<211> 61
<212> DNA
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g 61
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<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gatccgggat acggaagatg tgtgcattgg taccaatgca cacatcttcc gtatcttttt 60
g 61
<210> 16
<211> 61
<212> DNA
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<400> 16
aattcaaaaa gatacggaag atgtgtgcat tggtaccaat gcacacatct tccgtatccc 60
g 61
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagaccgtgc acatcttcaa a 21
Claims (7)
1.一种抑制 WIPI2 基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝 的药物中的应用，抑制WIPI2 基因表达的抑制剂包括带有有效抑制 WIPI2 基因表 达的 shRNA 序列的载体，所述 shRNA 序列为 ：
F ：GATCCGGGAGACCGTGCACATCTTCAAAGGTACCTTTGAAGATGTGCACGGTCTCTTTTTG ；
R ：AATTCAAAAAGAGACCGTGCACATCTTCAAAGGTACCTTTGAAGATGTGCACGGTCTCCCG。
2.根据权利要求 1所述的抑制 WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用，其特征在于：将所述 shRNA 与载体连接后形成慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质 粒经扩增后与包装辅助质粒共转染 293T 细胞，转染后培养并收集上清病毒液，通过超离心 浓缩病毒，得到高滴度的慢病毒浓缩液，将所述病毒浓缩液感染带有 HBV 的宿主细胞。
3.根据权利要求 2所述的抑制 WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于 ：所述扩增为 ：将所述慢病毒表达质粒转入 GeneHogs 化学感受态细菌， 经 PCR 扩增选取阳性克隆后提取的质粒即为扩增后的慢病毒表达质粒。
4.根据权利要求 2所述的抑制 WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于 ：转染后培养 48-72h 收集上清病毒粗液。
5.根据权利要求 2所述的抑制 WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于 ：所述宿主细胞为 HepG2.2.15 细胞。
6.根据权利要求 1所述的抑制 WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用，其特征在于：所述 WIPI2 基因包含有序列为 GAGACCGTGCACATCTTCAAA 的目的基因片段。
7.根据权利要求 1所述的抑制 WIPI2基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用，其特征在于：所述载体为 pUCTP。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102218146A (zh) * | 2011-04-27 | 2011-10-19 | 山西医科大学 | 一种用于治疗阿尔茨海默病动物模型的shRNA试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Autophagy in immunity and inflammation;Beth Levine et al.;《Nature》;20110120;第469卷(第7330期);第323-335页 * |
| Mammalian Atg18 (WIPI2) localizes to omegasome-anchored phagophores and positively regulates LC3 lipidation;Hannah E.J.Polson et al.;《Autophagy》;20100516;第6卷(第4期);摘要，第507页左栏第4段，第516页右栏最后1段至第517页左栏第3段 * |
| Viruses and the Autophagy Machinery;Marlène Dreux et al.;《Cell Cycle》;20100401;第9卷(第7期);第1295-1307页 * |
| WIPI-dependent autophagy during neutrophil differentiation of NB4 acute promyelocytic leukemia cells;D Brigger et al.;《Cell Death and Disease》;20140703;第5卷;e1315，摘要，第5页左栏最后1段-右栏第1段，第8页左栏最后1段 * |
| 乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响;王娟 等;《微生物学报》;20101204;第50卷(第12期);第1651-1656页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105087651A (zh) | 2015-11-25 |
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