CN114807142A

CN114807142A - 一种环状RNA-circ-Magi1及其应用

Info

Publication number: CN114807142A
Application number: CN202210582170.XA
Authority: CN
Inventors: 姬广聚; 刘群; 王会文; 杨智广; 毕友坤
Original assignee: Shenzhen Hongji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yuansheng Biotechnology Qingdao Co ltd
Priority date: 2022-05-26
Filing date: 2022-05-26
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-05-26
Also published as: WO2023227061A1; CN114807142B

Abstract

本发明提供一种环状RNA‑circ‑Magi1及其应用，属于环状RNA医用领域，环状RNA‑circ‑Magi1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示，还提供一种预防或治疗脑卒中的药物组合物、敲低或敲除或沉默环状RNA‑circ‑Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA‑circ‑Magi1表达的试剂在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用，环状RNA‑circ‑Magi1基因作为靶基因的应用，及预防或治疗脑卒中的方法。本发明为脑卒中的预防、治疗提供了新的思路。

Description

一种环状RNA-circ-Magi1及其应用

技术领域

本发明涉及环状RNA医用领域，具体涉及一种环状RNA-circ-Magi1，预防或治疗脑卒中的药物组合物，敲低或敲除或沉默环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用，环状RNA-circ-Magi1基因作为靶基因的应用，及预防或治疗脑卒中的方法。

背景技术

脑卒中(cerebral stroke，又称中风)是由于脑部血管破裂或血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的急性脑血管疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中具有高发病率，高死亡率，高致残率，高复发率等特点。脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因。

随着基因组学研究的日益深入，越来越多的非编码RNA被鉴定出来，它们在基因表达调控中的重要地位正在为人们所认知。环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA，它是一种在反向剪接过程中形成的共价闭合成环的非编码RNA。在真核生物中，环状RNA的表达非常丰富，在多种器官组织广泛存在，并表现出时空特异性及组织特异性，同时它还具有进化保守性。环状RNA不含5’帽子结构与3’多腺苷酸尾巴结构，在结构上是一个闭合的环，不易被核酸外切酶降解。因此，大多数环状RNA的半衰期超过48小时，而mRNA的平均半衰期仅为10小时。

有研究报道环状RNA广泛地参与到多种疾病的发生发展过程中，为疾病发生发展机制的阐明提供了理论支持，并为多种疾病的诊断与治疗提供了新的研究思路。环状RNA所具有的组织特异性、疾病特异性、时序特异性以及高稳定性等特点，使其在疾病诊断标记物方面表现出极佳的应用前景。

目前，由于脑卒中的突发性、紧急性、伤害性，亟需一种新的治疗方式。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种环状RNA-circ-Magi1，预防或治疗脑卒中的药物组合物，敲低或敲除或沉默环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用，环状RNA-circ-Magi1基因作为靶基因的应用，及预防或治疗脑卒中的方法。

解决方案

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种环状RNA-circ-Magi1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示，SEQ ID NO:1为人环状RNA-circ-Magi1，具体的为：

GCACAACCCGATCTCCCAGAGAAGGAGAAGTGCCTGGCGTGGACTATAACTTTCTGACTGTGAAGGAGTTCTTGGACCTCGAGCAGAGTGGGACTCTTCTGGAAGTCGGCACCTATGAAGGAAACTATTATGGGACACCCAAGCCTCCTAGCCAGCCAGTCAGTGGGAAAGTGATCACGACGGATGCCTTGCACAGCCTTCAGTCTGGCTCTAAGCAGTCGACCCCGAAGCGAACCAAGTCCTACAATGATATGCAAAATGCTGGCATAGTCCACGCGGAGAATGAGGAGGAGGATGACGTTCCTGAAATGAACAGCAGCTTTACAG(SEQ ID NO:1)。

第二方面，提供一种预防或治疗脑卒中的药物组合物，所述药物组合物包括敲低或敲除或沉默或突变环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂。

进一步地，所述敲低或敲除或沉默或突变环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂选自以下至少一种：

(a)敲低或敲除环状RNA-circ-Magi1的干扰RNA；

(b)含有所述(a)中任一干扰RNA的递送载体；

(c)miRNA；

(d)抗体；

(e)反义寡核苷酸；

(f)阻断剂；

(g)基因编辑系统。

进一步地，所述药物组合物包括敲低或敲除环状RNA-circ-Magi1的干扰RNA和含有所述干扰RNA的递送载体；可选地，所述干扰RNA包括siRNA和/或shRNA；

可选地，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒、蛋白颗粒、脂质体、囊泡、外泌体、质粒载体、病毒载体中的一种。可选地，还包括临床注射可用的转染试剂。

可选地，所述递送载体为病毒载体，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体中的一种；所述病毒载体包载有所述干扰RNA；

可选地，所述递送载体为外泌体，所述外泌体选自RVG修饰或具有神经特异性的外泌体，所述外泌体包载有所述干扰RNA，可选地，所述外泌体通过电转化法或化学转化法包载干扰RNA。

作为一种可行的实施例，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14所示；

可选地，所述shRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述shRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

作为一种优选实施例，所述递送载体为病毒载体，可选地，所述病毒载体包载有如SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

作为一种优选实施例，所述递送载体为外泌体，可选地，外泌体包载有SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

可选地，所述环状RNA-circ-Magi1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18所示，或如SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20所示。

进一步地，所述环状RNA-circ-Magi1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

可选地，所述脑卒中为缺血性脑中风、出血性脑中风和腔隙性脑中风中的一种或几种。

第三方面，提供一种敲低或敲除或沉默环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用；

可选地，所述环状RNA-circ-Magi1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

和/或，所述脑卒中为缺血性脑中风、出血性脑中风和腔隙性脑中风中的一种或几种。

第四方面，提供一种环状RNA-circ-Magi1基因作为靶基因在如下a1)-a4)中任一种中的应用：

a1)制备治疗或辅助治疗脑卒中的药物；

a2)筛选治疗或辅助治疗脑卒中的药物；

a3)制备抑制或阻止环状RNA-circ-Magi1表达的药物；

a4)制备敲低、敲除或沉默环状RNA-circ-Magi1基因的药物。

进一步地，所述环状RNA-circ-Magi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

第五方面，提供一种预防或治疗脑卒中的方法，包括向有需要的个体施用有效剂量的第五方面所述的预防或治疗脑卒中的药物组合物；

有益效果

(1)本发明通过qPCR检测方法，证实环状RNA circ-Magi1(以下可简称circ-Magi1)在小鼠海马神经元细胞系(HT22)中，经缺氧缺糖诱导circ-Magi1的表达，在氧气、糖的复通后进一步诱导了circ-Magi1的表达，即神经细胞中的circ-Magi1在缺氧缺糖条件下表达量明显增加；而环状RNA circ-Magi1在大鼠心肌细胞系(H9c2)在缺氧条件下无显著变化，表明缺氧缺糖诱导circ-Magi1表达具有神经特异性，可说明血液中环状RNA circ-Magi1的表达变化来源于神经细胞。在建立的小鼠MCAO动物模型中血液中circ-Magi1的表达量与脑缺血面积正相关，说明circ-Magi1的表达量与MCAO小鼠脑中风呈现正相关性，环状RNA circ-Magi1可以作为脑卒中生物标记物。

(2)本发明通过敲低或敲除circ-Magi1对脑卒中具有预防及治疗作用。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中环状RNAcirc-Magi1在小鼠各器官中的相对表达量情况；

图2是本发明实施例1中环状RNAcirc-Magi1在小鼠脑组织各部分的相对表达量情况；

图3是本发明实施例2HT22细胞系在缺氧缺糖及复氧、复糖过程中环状RNA circ-Magi1表达量情况；

图4是本发明实施例2H9c2细胞系在缺氧缺糖及复氧、复糖过程中环状RNA circ-Magi1相对表达量情况；

图5是本发明实施例3MACO模型小鼠术后24h神经行为学评分；

图6是本发明实施例3MCAO模型小鼠术后24h脑TTC染色结果；

图7是本发明实施例3MCAO模型小鼠术后24h脑TTC染色结果统计分析；

图8是本发明实施例4MCAO小鼠术后24h脑中环状RNAcirc-Magi1表达量情况；

图9是本发明实施例4MCAO小鼠术后24h血液中环状RNAcirc-Magi1的表达量变化；

图10是本发明实施例4MCAO小鼠术后24h血液中环状RNA circ-Magi1的表达量与脑缺血面积的关系；

图11是本发明实施例4对照组以及MCAO模型组血液以及血细胞中circ-Magi1的表达量情况；

图12是本发明实施例5测定病毒滴度的标准曲线；

图13是本发明实施例6的小鼠脑的核磁共振结果；其中，AAV-NC代表对照病毒，AVV-shRNA代表实验组病毒；

图14是本发明实施例6的小鼠脑切片的TTC染色结果；其中，AAV-NC代表对照病毒，AVV-shRNA代表实验组病毒；

图15是本发明实施例6对小鼠MCAO术后(脑卒中)行为学进行检测结果；其中，AAV-NC代表对照病毒，AVV-shRNA代表实验组病毒；

图16是本发明实施例6对小鼠MCAO术后(脑卒中)转棒实验检测结果；其中，AAV-NC代表对照病毒，AVV-shRNA代表实验组病毒；

图17是本发明实施例7制备的外泌体检测结果，其中，A为电镜图，B为粒径分析图；

图18是本发明实施例8的不同外泌体的荧光图谱，其中，Blank为未荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA，Control为荧光标记的对照siRNA-对照外泌体，RVG-Lamp2b为RVG-Lamp2b-siRNA外泌体(荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA)；

图19是本发明实施例8的MCAO手术后1/2/3天分别注射外泌体包载的siRNA-NC、siRNA的治疗策略图；

图20是本发明实施例8圆柱体实验中评价小鼠的神经的损伤程度的图；其中，NC对应健康鼠，293T-exo对应对照siRNA-对照外泌体，293T-exo-siRNA对应包载靶向RNA circ-Magi1的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体；

图21是本发明实施例8涂胶实验中评价小鼠的神经的损伤程度的图；其中，NC对应健康鼠，293T-exo对应对照siRNA-对照外泌体，293T-exo-siRNA对应包载靶向RNA circ-Magi1的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体。

图22是本发明实施例9干扰RNA对HeLa细胞系中circ-Magi1表达量的影响；其中，阴性对照代表未转染siRNA的HeLa细胞系，对照siRNA代表转染对照siRNA的HeLa细胞系，siRNA1代表转染siRNA1的HeLa细胞系，siRNA2代表转染siRNA2的HeLa细胞系。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

以下，对本发明进行详述。

Magi1蛋白属于膜相关鸟苷激酶家族。它参与多聚蛋白复合物的组装过程，定位于细胞连接处，作为骨架蛋白在细胞连接建立、细胞形态维持和细胞信号转导中发挥作用。Magi1基因在转录过程中通过可变剪接形式，能够形成多种mRNA，进而编码多种亚型的Magi1。circ-Magi1是由Magi1基因exon3和exon4通过反向剪接形成的一种环状RNA分子。circ-Magi1的分子特性及生物学功能尚未见报道。

本发明涉及的核苷酸序列有：

人circ-Magi1序列(SEQ ID NO:1)：

GCACAACCCGATCTCCCAGAGAAGGAGAAGTGCCTGGCGTGGACTATAACTTTCTGACTGTGAAGGAGTTCTTGGACCTCGAGCAGAGTGGGACTCTTCTGGAAGTCGGCACCTATGAAGGAAACTATTATGGGACACCCAAGCCTCCTAGCCAGCCAGTCAGTGGGAAAGTGATCACGACGGATGCCTTGCACAGCCTTCAGTCTGGCTCTAAGCAGTCGACCCCGAAGCGAACCAAGTCCTACAATGATATGCAAAATGCTGGCATAGTCCACGCGGAGAATGAGGAGGAGGATGACGTTCCTGAAATGAACAGCAGCTTTACAG

人circ-Magi1 qPCR引物：

小鼠circ-Magi1序列(SEQ ID NO:4)：

GCACAACCCGGTCTCCCAGAGAAGGAGAAGTGCCTGGTGTGGATTACAGCTTTCTGACTGTGAAGGAGTTCTTGGACCTCGAGCAGAGCGGGACCCTGTTGGAAGTCGGCACCTATGAAGGAAACTATTATGGGACACCCAAACCTCCTAGCCAGCCAGTCAGTGGGAAAGTGATCACGACGGATGCCTTGCACAGCCTGCAGTCTGGCTCCAAGCAGTCGACCCCTAAGCGAACAAAGTCCTACAATGATATGCAAAATGCTGGCATAGTCCACCCGGAGAATGAGGAGGAGGAGGATGTCCCTGAAATGAACAGTAGCTTTACAG

小鼠circ-Magi1 qPCR引物：

其中，人、小鼠的circ-Magi1 qPCR引物采用人工合成的方法获得。

本发明所培养的细胞系为商购细胞系。例如，小鼠海马神经元细胞系(HT22)、大鼠心肌细胞系(H9c2)均为常规市售产品，可采用来源于ATCC细胞库的细胞系，

本发明采用的生物材料，如小鼠等均为商购，例如，C57BL雄性黑鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实施例1 circ-Magi1在小鼠脑组织中高表达

选取5只8周龄C57BL雄性黑鼠，断颈处死后取材心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、脑、膀胱、睾丸、骨骼肌、食管等组织器官，提取RNA，使用qPCR方法进行circ-Magi1表达检测(采用小鼠circ-Magi1 qPCR引物)，结果如图1所示，结果发现，circ-Magi1在脑组织(脑组织各部分的混合)中高表达。

通过进一步分析circ-Magi1在脑各部分的表达情况，再次断颈处死5只8周龄C57BL雄性黑鼠，取以下脑组织结构：脑皮层、海马区、脑干、小脑、丘脑、下丘脑、嗅球区。提取RNA，通过qPCR检测了circ-Magi1表达(采用小鼠circ-Magi1 qPCR引物)，结果如图2所示，发现在下丘脑和嗅球区表达较高，而在海马区表达较低。

实施例2小鼠神经细胞缺氧缺糖及复氧、复糖过程中circ-Magi1表达情况

小鼠海马神经元细胞系(HT22)细胞贴壁后，更换低糖培养基，置于1％O₂、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养24h，后更换为高糖培养基，置于5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养24h。分别检测缺氧缺糖1h、3h、6h、9h、12h、24h以及复氧3h、6h、12h和24h时的circ-Magi1的表达情况。如图3所示，缺氧、缺糖诱导circ-Magi1的表达，而氧气、糖的复通进一步诱导了circ-Magi1的表达(n＝3)。即神经细胞中的circ-Magi1 RNA在缺氧缺糖条件下表达量明显增加，在第12h时表达量开始翻倍，24h时表达量达到5倍，即在12h～24h的表达量能达到2～5倍，在复氧、复糖后进一步诱导增加。

并进一步研究了大鼠心肌细胞系H9c2在缺氧、缺糖条件下的表达，以验证circ-Magi1在心肌细胞系的表达情况，结果如图4所示，H9c2心肌细胞系中circ-Magi1在缺氧条件下的表达并无显著性变化，说明缺氧不会改变心肌细胞的circ-Magi1表达量。

结果表明缺氧缺糖诱导circ-Magi1表达具有神经特异性，可说明血液中的circ-Magi1的表达量变化来源于神经细胞。

实施例3小鼠MCAO(middle cerebral artery occlusion)动物模型建立

取8周龄C57BL雄性黑鼠，对照组3只，8只进行MCAO小鼠手术：颈部正中切一道2cm的切口，分离出右侧颈总动脉(CCA)并结扎，继续向上分离出颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，分别结扎ECA的近心端和远心端，用血管夹夹闭ICA，在ECA结扎的两条线中间剪一小口，将线栓从小口插入，剪断ECA并转置，继续将线刷插入ICA约9mm。1h之后将线栓取出，缝合小鼠颈部切口。

对上述MCAO小鼠手术24h后进行行为学评分，结果如图5所示，MACO动物模型小鼠发生明显的行为障碍，表明MCAO动物模型建模成功。

通过TTC染色鉴定MCAO模型小鼠的脑梗死程度。

TTC染色过程如下：脑断头法处死动物后迅速取脑(10min内)，置于0-4℃的PBS溶液中转移，-20℃冰箱冷冻30min。除去小脑、嗅球和低位脑干。切取冠状位脑片,厚度为2mm，将脑片放入2％红四氮唑溶液中37℃避光水浴30min，每5min轻微晃动容器，使其充分染色。取出脑片用PBS溶液洗涤3-5min，可马上拍照，用10％中性甲醛固定脑片6h。选择每一切片的尾侧面进行拍照分析，结果如图6所示。测量每片的梗死面积和总面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积，各层的梗死体积之和即为总的梗死体积，结果如图7所示。

结果表明MCAO模型的梗死体积占总面积约28％，显著高于对照组，模型成功。

实施例4 MCAO动物模型小鼠脑中circ-Magi1表达情况分析

通过qPCR分析健康鼠、MCAO动物模型小鼠术后24h脑中circ-Magi1的表达情况，分别对健康鼠左右脑、MCAO鼠左脑、MCAO鼠损伤区域、MCAO鼠损伤边界区域进行了检测，结果如图8所示，结果发现circ-Magi1的表达在脑中风病灶区有所降低，而在边界区的表达升高。

环状RNA具有高稳定性的生物学特性，通过检测健康鼠、MCAO动物模型小鼠术后24h血液中RNAcirc-Magi1的表达情况，结果如图9，发现MCAO动物模型小鼠血液中circ-Magi1表达显著升高。通过检测小鼠梗死面积与RNA circ-Magi1表达量的关系，结果如图10所示，结果表明，RNAcirc-Magi1在血液中的表达量与MCAO小鼠脑中风程度呈现正相关性，R²＝0.8824(如图10所示)。

并进一步分析了健康鼠、MCAO动物模型术后24h小鼠血浆和血细胞中circ-Magi1的表达情况，结果如图11，发现MCAO动物模型小鼠相对健康鼠的血细胞中circ-Magi1表达不变，MCAO动物模型小鼠血液中RNAcirc-Magi1表达量明显高于健康鼠，表明血液中circ-Magi1的表达变化来源于血浆中游离于细胞之外的circ-Magi1。

实施例5 shRNA载体制备：

所选用的干扰载体pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP载体(购自ATCC)。分别制备对照病毒载体和靶向环状敲低或敲除环状RNAcirc-Magi1的实验组病毒载体。

1)对照病毒载体中的siRNA-NC序列和shRNA-NC序列如下：

siRNA-NC序列(SEQ ID NO:10)：TTCTCCGAACGTGTCACGTAA

shRNA-NC序列：

shRNA-NC正义链(SEQ ID NO:11):

GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC

shRNA-NC反义链(SEQ ID NO:12):

AATTGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGAATTACGTGACACGTTCGGAGAACG

上述的shRNA-NC正义链、反义链(SEQ ID NO:11、12)由生工生物公司合成，将两条链混合加入水和buffer进行退火(反应体系按buffer说明书进行)，形成带有酶切位点粘性末端的双链片段。

2)实验组病毒载体中的靶向环状敲低或敲除环状RNA circ-Magi1的siRNA 序列和shRNA1序列：

siRNA序列(SEQ ID NO:7)：GCTTTACAGGCACAACCCG

shRNA1序列：

shRNA1正义链(SEQ ID NO:8):

AATTCGCTTTACAGGCACAACCCGTTCAAGAGACGGGTTGTGCCTGTAAAGCTTTTTTG

shRNA1正义链(SEQ ID NO:9):

GATCCAAAAAAGCTTTACAGGCACAACCCGTCTCTTGAACGGGTTGTGCCTGTAAAGCG

上述的shRNA1正义链、反义链(SEQ ID NO:8、9)由生工生物公司合成，将两条链混合加入水和buffer进行退火(反应体系按buffer说明书进行)，形成带有酶切位点粘性末端的双链片段。

3)将上述1)、2)中的双链片段(即干扰片段)分别与pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP载体通过酶切法连接，分别转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，进行测序验证，靶向环状敲低或敲除环状RNA circ-Magi1的shRNA1的测序结果比对分析如下：

测序结果表明：测序结果与目的序列一致，则该目的质粒构建成功。

质粒抽提

测序成功之后，根据项目要求安排菌液扩增，进行质粒抽提纯化，质粒抽提的方案按照抽提试剂盒的说明书为准。抽提的质粒经QC验证合格之后用于转染细胞。

实施例6腺相关病毒包载shRNA制备

细胞株和菌株

包装细胞株：AAV-293细胞(购自ATCC)，腺相关病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株：大肠杆菌菌株Stbl3(购自兰博利德)，用于扩增腺相关病毒载体和辅助包装载体质粒。

腺相关病毒包装系统(三质粒系统)：pAAV-RC(购自Addgene)、pHelper(购自Addgene)和穿梭质粒(实施例6制得的携带shRNA-NC片段或shRNA1片段的目的质粒)。

腺相关病毒包装

细胞培养：将AAV-293细胞传代到100mm平皿中用于转染。操作完毕后置于37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中。

转染：细胞培养密度达到约80～90％的汇合率即可进行转染。脂质体转染：OptiMEM需在37℃水浴中预热，Lipofiter^TM转染试剂(购自汉恒生物)需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：

换液：转染后6h更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基。

细胞收集：转染后72h，将含AAV颗粒的细胞用细胞刮轻轻刮下，收集于15mL离心管中，150×g离心3min收集细胞，去除培养上清，用PBS洗一次，最后再用300μLPBS重悬细胞。

细胞破碎：准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000×g，5min，去除细胞碎片，收集含AAV颗粒的裂解上清，分别得到对照病毒(记为AVV-NC，其包载对照shRNA-NC，shRNA-NC的正义链、反义链如SEQ ID NO:8、9所示)和靶向环状敲低或敲除环状RNA circ-Magi1的实验组病毒(记为AVV-shRNA，其包载靶向环状敲低或敲除环状RNA circ-Magi1shRNA1，shRNA1的正义链、反义链如SEQ ID NO:8、9所示)。

腺相关病毒纯化

全能核酸酶处理：每1mL病毒粗提物中加入0.1μL Benonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒DNA。600×g，4℃，离心10min，取上清。

柱纯化(根据Biomiga腺相关病毒纯化试剂盒V1469-01纯化)：

将柱纯化得到的4mL AAV病毒样品液体，加入到超滤管中，1400×g离心30min，得到约1mL AAV。收集最终得到的纯化后的病毒，于﹣80℃保存。

腺相关病毒质量检测

腺相关病毒的质量控制要点包括无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测。

无菌检测

检测方法：取10uL病毒加入96孔板的Hela细胞进行验证，培养24h后显微镜镜检；QC标准：培养基需澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，无任何细菌及真菌污染。

支原体检测

检测方法：取10uL病毒，96℃水浴15min后于超净台中配置PCR反应体系。PCR反应后电泳确定是否含有支原体污染。

QC标准：PCR胶图无支原体明显条带。

滴度检测

采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)，SYBRGreen法来检测AAV基因组含量，从而测定AAV滴度。荧光定量PCR中采用的引物序列(WPRE或者ITR，引物序列如SEQ ID NO:21～24所示)如下：

实验步骤：

1)使用DNase I及蛋白酶K消化AAV病毒样品；

2)稀释标准品质粒，设置标准品的拷贝梯度为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰配置qPCR反应体系，每个样品和标准品设计3个复孔，按QPCR试剂盒进行体系配置，进行QPCR反应，以每组AAV标准品的Ct均值为纵坐标Y，其对应的拷贝数的对数为横坐标X，绘制标准曲线，结果如图12，公式y＝-2.851x+32.296,R²＝0.9957；

3)待测样品滴度计算。将待测AAV样品Ct均值，代入标准曲线公式，计算所加入AAV模板拷贝数X，再换算成滴度。换算公式为：AAV病毒滴度＝10^x×40000(稀释倍数)vg/mL

结果如下：

实验组病毒AVV-shRNA滴度＝1.2×10^12vg/mL。

对照病毒AAV-NC滴度＝1.6×10^12vg/mL。

实施例7 AAV包载shRNA敲低/敲除circ-Magi1对脑卒中预防/治疗作用。

给药剂量：病毒滴度为1.3×10¹²μg/ml，健康小鼠侧脑室注射5μl。

健康小鼠脑室注射实施例7制备的病毒载体AAV-NC(对照组)或AAV-shRNA(治疗组)给药3周后进行MCAO手术，3天后进行核磁共振检测，结果如图13所示，结果显示，敲低/敲除circ-Magi1的MCAO小鼠的损伤面积明显减少，说明敲低/敲除circ-Magi1对脑卒中预防/治疗作用，说明AAV-shRNA在敲低/敲除circ-Magi1时对脑卒中具有预防/治疗作用。

之后解剖小鼠切片进行TTC染色。

染色步骤：取脑。5％水合氯醛150μl麻醉后直接取脑，保持大脑的完整性。-20度冰箱中速冻20分钟左右，便于切片。切片：每隔2mm切一片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。将切片置于TTC中，浓度为2％。锡箔纸盖住后，放入37C温箱15～30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。也可以用将脑片放入多孔板，再滴入TTC，覆以圆形盖玻片使均匀染色。取出切片后观察拍照。

结果如图14所示，与核磁结果一致，即敲低circ-Magi1对脑卒中有预防/治疗作用。

行为学实验：按照mNSS体系评分方法对上述小鼠进行行为学测试。

mNSS体系的设计原理评分越低表示功能越健全，0分表示功能完全健全。测试指标及打分如下：

mNSS(modified neurological severity score)评分标准如下。

行为学结果如图15所示：1天至28天对照组及治疗组行为学评分均有下降，显示出脑卒中后都有一定的恢复能力，治疗组第14天后评分显著低于对照组，有约25％左右的降低，表明治疗组行为学恢复能力显著增强。

转棒实验：使用小鼠转棒仪(型号：XR-6C)测量动物在转动圆轮上的停留时间的实验。常用于疲劳、脑损伤、运动协调、中枢神经抑制和骨骼肌松弛等研究。将小鼠置于直径3cm的旋转杆上，转速设置为20r/min，记录小鼠从转棒开始转动至掉落转棒所经历的时间，先对小鼠进行2天适应学习，第三天检测。

实验结果：结果如图16，表明：可以看到第三天治疗组小鼠在转棒上的的时间(约150s)显著高于对照组50s左右的滞留时间，提示治疗后小鼠运动能力增强。

实施例8：外泌体包载shRNA敲低/敲除circ-Magi1对脑卒中预防/治疗作用。

siRNA序列：

外泌体包载的靶向circMagi1的siRNA序列：

靶向circMagi1的siRNA正义链(SEQ ID NO:13)GCUUUACAGGCACAACCCGTT

靶向circMagi1的siRNA反义链(SEQ ID NO:14)CGGGUUGUGCCUGUAAAGCTT

外泌体包载的对照siRNA-序列：

对照siRNA的正义链(SEQ ID NO:15)UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

对照siRNA的反义链(SEQ ID NO:16)ACGUGACACGUUCGGAGAATT

上述siRNA由生工生物合成。

293T细胞(购自ATCC)，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

RVG-Lamp-2b质粒(购自addgene)，其携带的RVG是狂犬病毒的一个糖蛋白基因，具有嗜神经特定。

策略：先将RVG-Lamp2b质粒转染进293T细胞，48h之后收集上清提取外泌体，外泌体中就含有能够在脑中驻留的信号RVG，然后将能够敲低RNA circ-Magi1的siRNA电转到外泌体中，从而实现外泌体入脑敲低脑中的circ-Magi1。

外泌体提取：

RVG-Lamp2b外泌体：293T转染Lamp-2b-RVG质粒的48h之后，收集上清。500g离心5min，收集上清。2000g离心10min，收集上清。10000g离心20min，收集上清。然后100000g离心1h 40min，收集沉淀，将沉淀用PBS清洗一次，再次100000g离心1h 40min，收集沉淀，用适量PBS重悬，获得RVG-Lamp2b外泌体，置于-80℃备用。

对照外泌体：293T细胞培养48h后，收集上清。500g离心5min，收集上清。2000g离心10min，收集上清。10000g离心20min，收集上清。然后100000g离心1h 40min，收集沉淀，将沉淀用PBS清洗一次，再次100000g离心1h 40min，收集沉淀，用适量PBS重悬，获得对照外泌体，置于-80℃备用。

外泌体鉴定：

采用以下二种方法对RVG-Lamp2b外泌体进行鉴定。

(1)对外泌体进行负染色后，使用透射电镜观察其形态。实验中，将用于负染色的铜网真空除静电2min。取5μl稀释后的样品滴加于铜网表面，用滤纸吸去多余的样品。滴加4μl醋酸双氧铀染料染1min，用滤纸吸净残留染料，二次滴加4μl染液，1min后吸弃，常温干燥后电镜观察。

(2)使用动态光散射对外泌体进行粒径分析。以纯水和PBS作为对照，取10μl稀释后样品加入检测管中进行检测。

结果如图17所示，结果显示：A，电镜显示符合外泌体形态；B，粒径分析显示外泌体主要富集在80-135nm，符合外泌体直径。

siRNA电转外泌体方法：

将20μg的外泌体和20μg的siRNA混匀，加入到1cm的电转杯中，PBS补齐到400μl，电转条件：400V，125μF，脉冲两次，间隔5s。

外泌体的标记和体内生物学分布

(1)外泌体用400μl PBS重悬后，加入1ml的Diluent C缓冲液并混匀。

(2)将4μl PKH-67染料加入1ml的Diluent C缓冲液，充分混匀。

(3)将步骤(1)中液体加入(2)中，混匀后室温避光孵育4-10min。

(4)加入2ml 0.5％的BSA/PBS溶液终止染色。

(5)将标记后的外泌体使用SW40转子于4℃、100,000g超速离心70min，弃上清，400μl PBS重悬后，尾静脉注射到小鼠体内。

(6)尾静脉注射20μg外泌体，24、48、72h后，使用小动物活体成像仪观察小鼠各器官外泌体的驻留情况。

按上述方法分别得到：

未荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体：未荧光标记的RVG-Lamp2b外泌体包载靶向circMagi1的siRNA(其正义链、反义链如SEQ ID NO:13、14所示)的外泌体；

荧光标记的对照siRNA-对照外泌体：荧光标记的对照外泌体包载对照siRNA(其正义链、反义链如SEQ ID NO:15、16所示)的外泌体；

荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体：荧光标记的RVG-Lamp2b外泌体包载靶向circMagi1的siRNA(其正义链、反义链如SEQ ID NO:13、14所示)的外泌体。

本实施例使用未荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA、荧光标记的对照siRNA-对照外泌体、以及荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA进行在体示踪，24小时后结果如图18所示，结果表明，可见未标记的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体无红色荧光，荧光标记的对照siRNA-对照外泌体有红色荧光，组织分布在脑、肝脏、肾脏、膀胱中都有分布；荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA显示只在脑中有分布。这提示我们使用荧光标记的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体包载的siRNA对精确递送药物最优。

治疗实验

采用RVG-Lamp2b外泌体包载的siRNA治疗脑卒中：给药方式：MCAO模型之后尾静脉注射每天一次，注射3天，每次20μg。

治疗鼠：MCAO模型鼠手术后1/2/3天分别注射包载靶向circMagi1的siRNA(其正义链、反义链如SEQ ID NO:13、14所示)的RVG-Lamp2b-siRNA外泌体，-1/4/7天后进行行为学检测，治疗策略如图19所示，敲低/敲除circ-Magi1对脑卒中预防/治疗作用。

对照鼠：MCAO模型鼠手术后1/2/3天分别注射包载对照siRNA(其正义链、反义链如SEQ ID NO:15、16所示)的RVG-Lamp2b-对照siRNA外泌体，-1/4/7天后进行行为学检测。

圆柱体实验：小鼠放在底面直径15cm的透明圆柱体内，观察小鼠20次内各侧前置触壁占比，评价神经的损伤程度，结果如图20所示，结果表明，MCAO对照鼠患处碰壁次数明显增多，治疗组患处碰壁次数明显减少，且有显著性。

涂胶实验：将小鼠前肢用圆形胶布粘住，评估小鼠挣脱时间。结果如图21所示，治疗鼠相较于MCAO模型对照鼠挣脱时间明显减少，反应出动作协调性更好，脑卒中恢复更好。

实施例9靶向人源Circ-Magi1的siRNA敲低HeLa细胞中Circ-Magi1

靶向人源Circ-Magi1的siRNA1正义链(SEQ ID NO:17)：

GACTCTTCTGGAAGTCGGCACCTATTT

靶向人源Circ-Magi1的siRNA1反义链(SEQ ID NO:18)：

ATAGGTGCCGACTTCCAGAAGAGTCTT

靶向人源Circ-Magi1的siRNA2正义链(SEQ ID NO:19)：

ACTCTTCTGGAAGTCGGCACCTATGTT

靶向人源Circ-Magi1的siRNA2反义链(SEQ ID NO:20)：

CATAGGTGCCGACTTCCAGAAGAGTTT

对照siRNA的正义链(SEQ ID NO:15)UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

对照siRNA的反义链(SEQ ID NO:16)ACGUGACACGUUCGGAGAATT

以上siRNA由生工生物公司合成，并经过退火程序备用。

HeLa细胞系来自ATCC，使用10％胎牛血清，HDMEM培养。

使用Lipofetamin2000(赛默飞)试剂分别在HeLa细胞系转染siRNA1(正、反义链分别如SEQ ID NO:17、18)、siRNA2(正、反义链分别如SEQ ID NO:19、20)、对照siRNA(正、反义链分别如SEQ ID NO:15、16)，使用HDMEM(含10％胎牛血清)培养48小时后使用trizol(赛默飞)试剂盒分别提取RNA，使用反转录试剂盒(Takara)反转录，使用实施例1的引物h-circ-Magi1(F)(SEQ ID NO:2)、h-circ-Magi1(R)(SEQ ID NO:3)进行qPCR检测，分别检测未转染siRNA(阴性对照)、转染对照siRNA、转染siRNA1、转染siRNA2的HeLa细胞系中的Circ-Magi1的表达水平，结果见图22。结果表明，siRNA1，siRNA2成功降低了HeLa细胞系中circ-Magi1表达量，降低约50％左右，具有显著性，对照siRNA组相对于阴性对照组无显著变化。说明siRNA1，siRNA2能够敲除/敲低的circ-Magi1表达，为脑卒中的治疗提供了可行性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市弘际生物科技有限责任公司

<120> 一种环状RNA- circ-Magi1及其应用

<130> 1050-210328F同

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 327

<212> DNA/RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(327)

<400> 1

gcacaacccg atctcccaga gaaggagaag tgcctggcgt ggactataac tttctgactg 60

tgaaggagtt cttggacctc gagcagagtg ggactcttct ggaagtcggc acctatgaag 120

gaaactatta tgggacaccc aagcctccta gccagccagt cagtgggaaa gtgatcacga 180

cggatgcctt gcacagcctt cagtctggct ctaagcagtc gaccccgaag cgaaccaagt 240

cctacaatga tatgcaaaat gctggcatag tccacgcgga gaatgaggag gaggatgacg 300

ttcctgaaat gaacagcagc tttacag 327

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> h-circ-Magi1 (F)引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 2

tctgctcgag gtccaagaac 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> h-circ-Magi1 (R)引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 3

cagcagcttt acaggcacaa cc 22

<210> 4

<211> 327

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(327)

<400> 4

gcacaacccg gtctcccaga gaaggagaag tgcctggtgt ggattacagc tttctgactg 60

tgaaggagtt cttggacctc gagcagagcg ggaccctgtt ggaagtcggc acctatgaag 120

gaaactatta tgggacaccc aaacctccta gccagccagt cagtgggaaa gtgatcacga 180

cggatgcctt gcacagcctg cagtctggct ccaagcagtc gacccctaag cgaacaaagt 240

cctacaatga tatgcaaaat gctggcatag tccacccgga gaatgaggag gaggaggatg 300

tccctgaaat gaacagtagc tttacag 327

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m-circ-Magi1 (F)引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 5

tctgctcgag gtccaagaac 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> m-circ-Magi1 (R)引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 6

cagtagcttt acaggcacaa cc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 病毒载体中的靶向环状敲低或敲除circ-Magi1的siRNA序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<400> 7

gctttacagg cacaacccg 19

<210> 8

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 病毒载体中的靶向环状敲低或敲除circ-Magi1的shRNA序列的正义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(59)

<400> 8

aattcgcttt acaggcacaa cccgttcaag agacgggttg tgcctgtaaa gcttttttg 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 病毒载体中的靶向环状敲低或敲除circ-Magi1的shRNA序列的反义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(59)

<400> 9

gatccaaaaa agctttacag gcacaacccg tctcttgaac gggttgtgcc tgtaaagcg 59

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>

artificial sequence

<220>

<223> 对照病毒载体中的 siRNA-NC 序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 10

ttctccgaac gtgtcacgta a 21

<210> 11

<211> 64

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 对照病毒载体中的 shRNA-NC 的正义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(64)

<400> 11

gatccgttct ccgaacgtgt cacgtaattc aagagattac gtgacacgtt cggagaattt 60

tttc 64

<210> 12

<211> 64

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 对照病毒载体中的 shRNA-NC 的反义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(64)

<400> 12

aattgaaaaa attctccgaa cgtgtcacgt aatctcttga attacgtgac acgttcggag 60

aacg 64

<210> 13

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 外泌体包载的靶向circMagi1的siRNA正义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 13

gcuuuacagg cacaacccgt t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 外泌体包载的靶向circMagi1的siRNA反义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 14

cggguugugc cuguaaagct t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 外泌体包载的对照siRNA正义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 15

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 外泌体包载的对照siRNA反义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 16

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 17

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 靶向人源Circ-Magi1的siRNA1正义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<400> 17

gactcttctg gaagtcggca cctattt 27

<210> 18

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 靶向人源Circ-Magi1的siRNA1反义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<400> 18

ataggtgccg acttccagaa gagtctt 27

<210> 19

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 靶向人源Circ-Magi1的siRNA2正义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<400> 19

actcttctgg aagtcggcac ctatgtt 27

<210> 20

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 靶向人源Circ-Magi1的siRNA2反义链

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<400> 20

cataggtgcc gacttccaga agagttt 27

<210> 21

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物WPRE-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 21

acgctatgtg gatacgctgc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物WPRE-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 22

cgggccacaa ctcctcataa 20

<210> 23

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物ITR-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<400> 23

cggcctcagt gagcga 16

<210> 24

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> 引物ITR-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<400> 24

aggaacccct agtgatg 17

Claims

1.一种环状RNA-circ-Magi1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示。

2.一种预防或治疗脑卒中的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括敲低或敲除或沉默或突变环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂。

3.根据权利要求2所述的预防或治疗脑卒中的药物组合物，其特征在于，所述试剂选自以下至少一种：

(a)敲低或敲除环状RNA-circ-Magi1的干扰RNA；

(b)含有所述(a)中任一干扰RNA的递送载体；

(c)miRNA；

(d)抗体；

(e)反义寡核苷酸；

(f)阻断剂；

(g)基因编辑系统。

4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于，其包括敲低或敲除环状RNA-circ-Magi1的干扰RNA和含有所述干扰RNA的递送载体；可选地，所述干扰RNA包括siRNA和/或shRNA；

可选地，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒、蛋白颗粒、脂质体、囊泡、外泌体、质粒载体、病毒载体中的一种，可选地，还包括临床注射可用的转染试剂；

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:7、或SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14所示；可选地，所述shRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述shRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

可选地，所述递送载体为病毒载体，所述病毒载体包载有如SEQ ID NO:8和/或SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列；

可选地，所述递送载体为外泌体，外泌体包载有SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:17和/或SEQ ID NO:18所示，或如SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20所示；

和/或，所述环状RNA-circ-Magi1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

7.一种敲低或敲除或沉默环状RNA-circ-Magi1的试剂、或降低或抑制环状RNA-circ-Magi1表达的试剂在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用；

8.一种环状RNA-circ-Magi1基因作为靶基因在如下a1)-a4)中任一种中的应用：

a1)制备治疗或辅助治疗脑卒中的药物；

a2)筛选治疗或辅助治疗脑卒中的药物；

a3)制备抑制或阻止环状RNA-circ-Magi1表达的药物；

a4)制备敲低、敲除或沉默环状RNA-circ-Magi1基因的药物。

9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述环状RNA-circ-Magi1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

10.一种预防或治疗脑卒中的方法，其特征在于，包括向有需要的个体施用有效剂量的权利要求2至6任一所述的预防或治疗脑卒中的药物组合物；