CN108715882A - 通过有丝分裂阻滞诱导的细胞叠套结构模型及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过有丝分裂阻滞诱导的细胞叠套结构模型及其制备方法。本发明方法包括:通过化学药物或遗传学方法阻滞有丝分裂中期,从而制得CIC细胞模型。本发明首次提出通过靶向阻滞有丝分裂诱导CIC细胞模型。该细胞模型的建立并不存在处理方式的局限性,无论化学药物还是遗传学方法都能实现该模型的建立,为研究CIC的形成机制以及生理、病理学意义提供了稳定可靠的模型。既能在正常上皮细胞中实现有丝分裂阻滞诱导CIC结构,又能在肿瘤细胞中建立CIC细胞模型。本发明通过使用肿瘤靶向药物靶向阻滞有丝分裂中期同样能实现CIC细胞模型的建立,表明该模型可作为肿瘤治疗研究的体外模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种通过有丝分裂阻滞诱导的细胞叠套结构模型及其制备方法。
背景技术
细胞叠套结构(cell-in-cell结构或CIC结构)是指一个或多个活细胞位于另一个细胞内部所构成的一种独特的细胞叠套样结构,这种独特的细胞与细胞间直接相互作用是一个产生生物学效应的复杂过程。临床组织样本的研究表明,cell-in-cell结构常见于人类肿瘤组织中,如乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌等,而鲜见于上皮组织或正常组织,提示该现象与人类肿瘤密切相关。同质细胞cell-in-cell结构形成后,内、外部细胞的命运是多元化的,但最主要的是内部细胞在其靶细胞(外部细胞)中死亡,这种死亡过程不依赖于caspase3的激活,没有典型的细胞凋亡特征,而依赖于外侧细胞自噬信号通路的激活和溶酶体降解。有别于细胞凋亡、自噬及坏死等自主性细胞死亡方式,cell-in-cell是一个内化活细胞并导致内部细胞死亡的过程,因此,cell-in-cell现象被认为是介导细胞非自主性死亡的新途径。探究并解析cell-in-cell结构形成的始动因素及调控机制,利用cell-in-cell介导的细胞死亡,很可能有助于控制甚至抑制肿瘤的发生和发展。
以往研究报道,科学家通过剥离自然贴壁生长的乳腺上皮细胞使其在悬浮状态培养,即脱离细胞外基质,诱导体外培养环境下cell-in-cell结构的形成,进一步探究cell-in-cell的形成机制及其生物学意义。然而,这种悬浮培养环境的诱导cell-in-cell结构的方式直接忽略了细胞外基质的作用,悬浮状态下很可能影响细胞层表面受体的天然构象和生物活性,不能很合理地模拟细胞正常生长的内环境。缺乏有利的细胞模型是探究cell-in-cell生物学意义的瓶颈,什么是cell-in-cell的始动因素以及cell-in-cell结构如何调控肿瘤的发生和发展仍然是个谜。因此,一种能在自然状态下靶向调控诱导cell-in-cell结构的细胞模型对研究该结构的生物学功能至关重要。
另外,值得注意的是,cell-in-cell现象少见于贴壁状态下的正常细胞,很难从细胞中获得cell-in-cell结构。缺乏自然状态下能靶向调控的细胞模型正是研究cell-in-cell的生理学及病理学意义,以及利用cell-in-cell结构研究肿瘤靶向药物所面临的关键技术问题之一。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种可以在自然贴壁状态下通过有丝分裂阻滞诱导从而获得cell-in-cell结构的细胞模型。
第一方面,本发明要求保护一种制备cell-in-cell细胞模型的方法。
本发明所提供的制备cell-in-cell细胞模型的方法,可包括如下步骤:通过靶向阻滞靶细胞的有丝分裂中期,从而制备得到cell-in-cell细胞模型。
进一步地,所述靶向阻滞靶细胞的有丝分裂中期可通过如下(A1)或/和(A2)来实现:
(A1)通过化学药物干扰所述靶细胞的有丝分裂中期实现;
(A2)通过遗传学方法干扰所述靶细胞中有丝分裂相关基因的表达,以阻滞所述靶细胞的有丝分裂中期实现。
更进一步地,在(A1)中,所述化学药物可为能够干扰所述靶细胞有丝分裂的抗癌药物、生物碱或小分子化合物。
更加具体的,所述化学药物可选自如下中的任一种或多种,但不限于以下列举的化学药物:秋水仙素(Colchicine)、诺考达唑(Nocodazole)、长春新碱(Vinblastin)、细胞松弛素B(Cytochalasin B)、多西杉醇(Docetaxel)等。优选秋水仙素,也称秋水仙碱,能抑制细胞有丝分裂,破坏纺锤体,使细胞阻滞在分裂中期。
在本发明的具体实施方式中,所述方法具体包括如下步骤:用含有终浓度为10-15nM(如10nM)秋水仙素的细胞培养液培养所述靶细胞,培养时间为3天,每天更换所述细胞培养液,3天后即获得所述cell-in-cell细胞模型。
更进一步地,在(A2)中,所述有丝分裂相关基因可选自如下中的任一种或多种,但不限于以下列举的基因:CDC20基因、CUEDC2基因、ESPL1基因、BUBR1基因、MAD2基因、BUB1基因、BUB3基因、CDH1基因、ECT2基因等。
在本发明的具体实施方式中,所述方法具体包括如下步骤:向所述靶细胞中导入靶向CDC20基因的siRNA,导入24小时后即获得所述cell-in-cell细胞模型。
其中,所述靶向CDC20基因的siRNA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
在上述方法中,所述靶细胞为贴壁细胞。所述靶细胞可为非肿瘤细胞(如上皮细胞),也可为肿瘤细胞。
在本发明的具体实施方式中,所述靶细胞为MCF10A细胞(一种人非转化乳腺上皮细胞)。具体为经组蛋白H2B-mCherry标记的MCF10A细胞(记为MCF10A/H2B-mCherry细胞)。所述MCF10A/H2B-mCherry细胞是通过逆转录病毒包装方法获得含pBabe-H2B-mCherry质粒的逆转录病毒然后感染MCF10A细胞,然后使用嘌呤霉素加压筛选获得的稳定细胞株。
在本发明中,所述cell-in-cell的种类具体为同质cell-in-cell(即同种细胞之间所形成的cell-in-cell结构)。
第二方面,本发明要求保护由前文所述方法制备得到的cell-in-cell细胞模型。
第三方面,本发明要求保护所述cell-in-cell细胞模型在如下任一中的应用:
(A1)通过所述cell-in-cell细胞模型评价待测物(如特定化合物、提取物、小分子、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)对肿瘤生长等疾病进程的影响;
(A2)将待测物(如特定化合物、提取物、小分子、多肽、蛋白质、基因、治疗性细胞等)靶向所述cell-in-cell细胞模型从而评价所述待测物的生物安全性;
(A3)利用所述cell-in-cell细胞模型制备肿瘤治疗药物;如用于通过cell-in-cell建立新的疾病(如肿瘤)治疗手段,包括可用于治疗的细胞、核酸、蛋白质和小分子等;
(A4)通过或借助所述cell-in-cell细胞模型建立新的动物模型。
本发明的创新性在于:
(1)本发明首次提出通过靶向阻滞有丝分裂中期诱导cell-in-cell细胞模型。该细胞模型的建立并不存在处理方式的局限性,无论化学药物靶向还是遗传学上的基因工程技术干扰都能实现该模型的建立,为研究cell-in-cell的形成机制以及生理、病理学意义提供了十分稳定和可靠的模型。
(2)本发明既能在正常上皮细胞中实现靶向阻滞有丝分裂中期诱导cell-in-cell,又能在肿瘤细胞中建立cell-in-cell细胞模型。更重要的是本发明通过使用肿瘤靶向药物靶向阻滞有丝分裂同样能实现cell-in-cell细胞模型的建立,表明该模型可作为肿瘤治疗研究的体外模型。
(3)研究方法通过有丝分裂阻滞诱导cell-in-cell结构形成在研究领域中属于首创。
附图说明
图1为靶向阻滞有丝分裂中期诱导cell-in-cell结构形成的Time-lapse示意图。
图2为本发明秋水仙素处理诱导cell-in-cell结构形成的细胞模型。其中,A为秋水仙素处理诱导cell-in-cell结构的示意图,左图为对照组,右图为处理组;B为秋水仙素处理诱导cell-in-cell形成率随药物浓度变化图。
图3为本发明RNA干扰CDC20诱导cell-in-cell结构形成的细胞模型。其中,A为RT-PCR检测siCDC20的敲低效率;B为比较对照组与siCDC20敲低组有丝分裂中期的差异;C为比较对照组与siCDC20敲低组cell-in-cell结构形成率的差异。
具体实施方式
在下文中结合一些具体的实施方案对本发明作进一步的示例性描述,应当理解,下面的实施例用于说明本发明内容而非限定本发明内容,任何形式上的变动和/或变通都将落入本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
pBabe-H2B-mCherry质粒:记载于“Florey,O.,et al.,Autophagy machinerymediates macroendocytic processing and entotic cell death by targeting singlemembranes.Nat Cell Biol,2011.13(11):p.1335-43.”一文,由纪念斯隆-凯特琳癌症研究中心Michael Overholtzer博士赠送,公众可从申请人处获得,仅可用于重复本发明实验使用。
pCMV-VSV-G质粒:addgene,#8454。
gag/pol质粒:addgene,#14887。
293FT细胞:北纳生物细胞库,BNCC339263。
MCF10A细胞:记载于“Wang M,Ning X,Chen A,Huang H,Ni C,Zhou C,etal.Impaired formation of homotypic cell-in-cell structures in human tumorcells lacking alpha-catenin expression.Scientific reports.2015;5:12223”一文,公众可从申请人处获得,仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、MCF10A/H2B-mCherry稳定细胞系的建立
1、铺细胞
先将293FT细胞以每孔1×106个细胞的密度均匀铺于预先用胶原(collagen I)包埋的六孔板,补齐培养基DMEM(含10%FBS,%表示体积百分含量)至2mL,放入培养箱培养16h后进行转染实验;
2、逆转录病毒包装体系
A液:将0.4μg目的质粒pBabe-H2B-mCherry、0.2μg pCMV-VSV-G质粒、0.25μg gag/pol质粒与100μL Opti-MEM充分混匀,室温静置5min;B液:将转染试剂Lipofectamine 2000轻轻颠倒混匀,取2.5μL Lipofectamine 2000稀释至100μL Opti-MEM中,轻轻颠倒混匀,室温静置5min;C液:将A液与B液混合,轻轻混匀,室温静置20-30min;将800μL Opti-MEM与200μL的C液混合获得转染混合液D。
3、逆转录病毒的包装
弃掉293FT细胞的原培养基,沿孔板内壁轻轻地加入混合好的1mL D液。培养5-6h后弃转染液,更换为含10%(体积百分含量)FBS的正常培养基继续培养。
4、收取病毒
分别于转染后24h、48h、72h收取病毒上清,每次收取病毒上清后补加2mL新鲜的正常培养基。将病毒上清2000rpm离心5min,收集上清,分装并冻存于-80℃备用;
5、逆转录病毒感染细胞
感染细胞前,先将靶细胞MCF10A按1×105/孔接种于六孔板,待8~12h细胞贴壁完全后,取上述病毒上清1mL与500μl新鲜的完全培养基混合,并加入2μl聚凝胺Polybrene(储存浓度10μg/mL),混匀后加入六孔板中感染细胞,感染6h后更换为2mL新鲜培养基继续培养。MCF10A及其衍生细胞MCF10A/H2B-mCherry,用DMEM/F12培养基(含5%马血清,20ng/ml表皮细胞生长因子EGF,10μg/ml胰岛素,0.5μg/ml氢化可的松,100ng/ml霍乱毒素,%表示体积百分含量)培养。
6、加压筛选
细胞于感染后24h使用终浓度为2μg/ml嘌呤霉素加压筛选5天,获得稳定细胞株(命名为MCF10A/H2B-mCherry)。
实施例2、cell-in-cell形成率的统计方法
Cell-in-cell结构如图1所示,红色荧光H2B-mCherry标记细胞核,通过活细胞工作站time-lapse示踪cell-in-cell形成过程,黄色*表示cell-in-cell结构的内部细胞。图1为靶向阻滞有丝分裂中期诱导cell-in-cell结构形成的Time-lapse示意图。具体实施例中,拍摄视野的总细胞数使用尼康显微镜配套的NIS-Elements系统统计,根据H2B-mCherry标记细胞核识别细胞个数;以被靶细胞(即外部细胞)完全包裹内部细胞的结构记为1个cell-in-cell结构。cell-in-cell(%)=cell-in-cell的个数/总细胞数×100的平均值±SD。
实施例3、秋水仙素诱导cell-in-cell结构形成
将培养状态良好、汇合度80%以上的实施例1制备的稳定细胞系MCF10A/H2B-mCherry接种到12孔玻璃底细胞培养板,细胞密度为1×105/孔。待细胞贴壁,更换含有丝分裂阻滞剂秋水仙素(colchicine)的培养基,设置以下浓度梯度0nM、5nM、10nM和15nM。秋水仙素处理3天,每天换液。药物处理3天后,小心吸弃培养基,加入1ml 1×PBS洗两次,使用4%多聚甲醛固定,10min后弃固定液,加入PBS洗两次,最后滴加DAPI封片。尼康倒置荧光显微镜下观察细胞形态及cell-in-cell形成情况,并拍照记录。设置10×物镜,双通道拍摄:mCherry和DIC,每个浓度随机选取四个均匀的视野。
如图2所示,相比于DMSO对照组,秋水仙素Colchicine处理组出现大量cell-in-cell结构(图中黄色箭头所示),并且视野中可见大量被阻滞在有丝分裂中期的细胞(图中蓝色箭头所示)。Cell-in-cell形成率统计结果表明,秋水仙素处理后能成功诱导cell-in-cell结构形成,药物浓度在10nM处效果最佳。
实施例4、敲低CDC20诱导cell-in-cell结构形成
以siCDC20为例。设计并合成靶向目标基因CDC20的siRNA,并以siNC为对照。序列如下:
siCDC20:5'-CCACCAUGAUGUUCGGGUATT-3'(SEQ ID No.1)。
siNC:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。
MCF10A/H2B-mCherry细胞以1×105/孔的密度接种到12孔玻璃底细胞培养板,培养过夜;通过脂质体转染将siRNA导入细胞内,沉默目标基因CDC20;siRNA导入后24h,使用活细胞工作站进行活细胞示踪,设置10×物镜,双通道拍摄:mCherry和DIC,以15min/帧的频率连续拍摄20h~30h。分析20小时内cell-in-cell的形成情况及有丝分裂中期的持续时间。
有丝分裂中期的持续时间统计方法:通过拍摄的活细胞视频观察,以细胞鼓起变圆、染色体浓集为开始特征,记为第1帧;至两个子代细胞分离开为结束特征,记为第n帧。有丝分裂中期的持续时间=15min×(n-1)。
同时回收siRNA敲低48h的细胞RNA进行RT-PCR验证敲低效率,其中检测引物具体序列如下:
5'-TTCCCTGCCAGACCGTATCC-3'
5'-CAGCCAAGTAGTTGCCCTC-3'。
结果显示,siRNA导入后40h,cell-in-cell形成率最佳。如图3所示,敲低靶向有丝分裂的基因CDC20可以阻滞有丝分裂中期,进而促使cell-in-cell结构形成。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 通过有丝分裂阻滞诱导的细胞叠套结构模型及其制备方法
<130> GNCLN181070
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ccaccaugau guucggguat t 21
Claims (10)
1.一种制备cell-in-cell细胞模型的方法,包括如下步骤:靶向阻滞靶细胞的有丝分裂中期,从而制备得到cell-in-cell细胞模型。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述靶向阻滞靶细胞的有丝分裂中期是通过如下(A1)或/和(A2)来实现的:
(A1)通过化学药物干扰所述靶细胞的有丝分裂中期实现;
(A2)通过遗传学方法干扰所述靶细胞中有丝分裂相关基因的表达,以阻滞所述靶细胞的有丝分裂中期实现。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:(A1)中,所述化学药物为能够干扰所述靶细胞有丝分裂的抗癌药物、生物碱或小分子化合物;
进一步地,所述化学药物选自如下中的任一种或多种:秋水仙素、诺考达唑、长春新碱、细胞松弛素B、多西杉醇。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:用含有终浓度为10-15nM秋水仙素的细胞培养液培养所述靶细胞,培养时间为3天,3天后即获得所述cell-in-cell细胞模型;
进一步地,所述秋水仙素在所述细胞培养液中的终浓度为10nM。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:(A2)中,所述有丝分裂相关基因选自如下中的任一种或多种:CDC20基因、CUEDC2基因、ESPL1基因、BUBR1基因、MAD2基因、BUB1基因、BUB3基因、CDH1基因、ECT2基因。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:(A2)中,所述方法包括如下步骤:向所述靶细胞中导入靶向CDC20基因的siRNA,导入24小时后即获得所述cell-in-cell细胞模型。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述靶向CDC20基因的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法,其特征在于:所述靶细胞为非肿瘤细胞或肿瘤细胞;或
所述cell-in-cell的种类为同质cell-in-cell。
9.由权利要求1-8中任一所述方法制备得到的cell-in-cell细胞模型。
10.权利要求9所述的cell-in-cell细胞模型在如下任一中的应用:
(A1)通过所述cell-in-cell细胞模型评价待测物对肿瘤相关疾病进程的影响;
(A2)将待测物靶向所述cell-in-cell细胞模型从而评价所述待测物的生物安全性;
(A3)利用所述cell-in-cell细胞模型制备肿瘤治疗药物;
(A4)通过或借助所述cell-in-cell细胞模型建立新的动物模型。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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