CN103074376B - 一种携带Neuritin基因的慢病毒及其在修复视神经损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和神经损伤技术领域，视神经损伤是许多眼部疾病和外伤，严重时会造成患者视神经的萎缩和失明，目前临床实际疗效不尽人意。本发明研究发现Neuritin基因与修复视神经损伤相关，本发明提供了一种携带Neuritin基因的慢病毒载体及其构建方法，本发明还进一步地提供了携带Neuritin基因的慢病毒载体在制备治疗修复视神经损伤药物中的应用。

Description

一种携带Neuritin基因的慢病毒及其在修复视神经损伤中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和神经损伤技术领域，具体涉及一种携带Neuritin基因的慢病毒及其在修复视神经损伤中的应用。

背景技术

视神经损伤是许多眼部疾病和外伤，如青光眼、视神经缺血、钝挫伤、视神经管骨折等，导致视功能损害共同的作用环节，严重时会造成患者视神经的萎缩和失明。尽管对视神经损伤的治疗开展了大量研究工作，但其临床实际疗效不尽人意，按照目前的医疗技术水平难以让患者恢复视力。视网膜神经节细胞（retinalganglioncells，RGCs）的内在再生能力低下，是视神经损伤后再生失败导致视神经萎缩和失明的关键因素，如何进行有效的逆转治疗一直是眼科界面临的难题之一。

近期的研究表明，找准靶点增强受损RGC内在再生能力，能促进视神经长期、活跃的再生并到达上丘和外侧膝状体（参见文献[1]SunF，ParkKK,BelinS,etal.Sustainedaxonregenerationinducedbyco-deletionofPTENandSOCS3.Nature.2011;480(7377):372-5.；[2]KurimotoT,YinY，OmuraK,etal.Long-distanceaxonregenerationinthematureopticnerve:contributionsofoncomodulin,cAMP，andptengenedeletion.JNeurosci.2010;30(46):15654-63.），并有一定程度的功能恢复（参见文献[3]deLimaS,KoriyamaY，KurimotoT,etal.Full-lengthaxonregenerationintheadultmouseopticnerveandpartialrecoveryofsimplevisualbehaviors.ProcNatlAcadSciUSA.2012;109(23):9149-54.），但应用于临床尚远，仍需寻找可应用于临床的关键性因子。

Neuritin又名可塑性相关候选基因15（candidateplasticity-relatedgene15，CPG15），是神经营养因子家族中的新成员。Neuritin主要表达于神经系统中，Neuritin具有独特的神经营养作用，能维持神经元细胞的存活（参见文献[4]PutzU,HarwellCandNediviE.SolubleCPG15expressedduringearlydevelopmentrescuescorticalprogenitorsfromapoptosis.NatNeurosci.2005;8(3):322-31.）、促进神经突起的生长（参见文献[5]CappellettiG,GalbiatiM,RonchiC,etal.Neuritin(cpg15)enhancesthedifferentiatingeffectofNGFonneuronalPC12cells.JNeurosciRes.2007;85(12):2702-13.；[6]NediviE,WuGYandClineHT.PromotionofdendriticgrowthbyCPG15,anactivity-inducedsignalingmolecule.Science.1998;281(5384):1863-6.）和突触成熟（参见文献[7]CantallopsI,HaasKandClineHT.PostsynapticCPG15promotessynapticmaturationandpresynapticaxonarborelaborationinvivo.NatNeurosci.2000;3(10):1004-11.），调节突触可塑性（参见文献[8]WibrandK,MessaoudiE,HavikB,etal.Identificationofgenesco-upregulatedwithArcduringBDNF-inducedlong-termpotentiationinadultratdentategyrusinvivo.EurJNeurosci.2006;23(6):1501-11.），并且是神经营养因子（参见文献[9]NaeveGS,RamakrishnanM,KramerR,etal.Neuritin:ageneinducedbyneuralactivityandneurotrophinsthatpromotesneuritogenesis.ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(6):2648-53.；[10]LeeKH,RyuCJ,HongHJ,etal.CDNAmicroarrayanalysisofnervegrowthfactor-regulatedgeneexpressionprofileinratPC12cells.NeurochemRes.2005;30(4):533-40.）和神经活动（参见文献[11]NediviE,FieldustS,TheillLE,etal.Asetofgenesexpressedinresponsetolightintheadultcerebralcortexandregulatedduringdevelopment.ProcNatlAcadSciUSA.1996;93(5):2048-53.；[12]LeeWCandNediviE.Extendedplasticityofvisualcortexindark-rearedanimalsmayresultfromprolongedexpressionofcpg15-likegenes.JNeurosci.2002;22(5):1807-15.；[13]HarwellC,BurbachB,SvobodaK,etal.Regulationofcpg15expressionduringsinglewhiskerexperienceinthebarrelcortexofadultmice.JNeurobiol.2005;65(1):85-96.）发挥作用的共同下游因子，介导雄激素和电刺激促进神经再生的必须和关键分子（参见文献[14]SharmaN,MarzoSJ,JonesKJ,etal.Electricalstimulationandtestosteronedifferentiallyenhanceexpressionofregeneration-associatedgenes.ExpNeurol.2010;223(1):183-91.；[15]MarronTU,GueriniV，RusminiP，etal.Androgen-inducedneuriteoutgrowthismediatedbyneuritininmotorneurones.JNeurochem.2005;92(1):10-20.）。

大鼠缺血性脑损伤（参见文献[16]HanY，ChenX,ShiF,etal.CPG15,anewfactorupregulatedafterischemicbraininjury,contributestoneuronalnetworkre-establishmentafterglutamate-inducedinjury.JNeurotrauma.2007;24(4):722-31.；[17]RickhagM,TeilumMandWielochT.Rapidandlong-terminductionofeffectorimmediateearlygenes(BDNF,NeuritinandArc)inperi-infarctcortexanddentategyrusafterischemicinjuryinratbrain.BrainRes.2007;1151:203-10.），大鼠脑弥漫性轴索损伤（参见文献[18]贺亚龙,贺晓生,章翔,等.候选可塑性相关基因15在大鼠脑弥漫性轴索损伤中的表达.中华神经外科杂志.2010;26(2):186-188.）等脑内Neuritin的表达上调，提示Neuritin在神经元网络修复重建过程中起着重要作用。席绍松等在急性脊髓损伤的模型中，经蛛网膜下腔注入重组人Neuritin，能促进大鼠急性脊髓损伤（改良Allen打击法）后伤区轴突再生相关蛋白神经丝蛋白200及生长相关蛋白43(GAP-43)的表达，并能促进大鼠后肢运动功能的恢复（参见文献[19]席绍松,刘维钢,张红,etal.Neuritin蛋白对大鼠急性脊髓损伤后神经元轴突再生的作用.中国修复重建外科杂志.2009;23(10):1219-1223.）。这些都提示Neuritin在神经系统的发育成熟、创伤修复、病变发生和治疗中起着重要作用，应用前景广泛。

2001年，Krishnamoorthy等采用刚出生1天的大鼠视网膜节细胞转染ψ2E1A病毒建立的大鼠视网膜细胞系（RGC5）（参见文献[20]KrishnamoorthyRR,AgarwalP，PrasannaG,etal.Characterizationofatransformedratretinalganglioncellline.BrainResMolBrainRes.2001;86(1-2):1-12.），自建立细胞系以来，由于其生长活力旺盛，易于培养，被人们广泛应用于体外实验研究，同时也是研究视神经损伤及修复的最佳工具。

目前尚无文献报道Neuritin基因与修复视神经损伤相关，也未有文献报道构建一种携带Neuritin基因的慢病毒载体来治疗视神经损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带Neuritin基因的慢病毒载体。本发明的另一目的在于提供该携带Neuritin基因的慢病毒载体在制备治疗修复视神经损伤药物中的应用。

本发明在Krishnamoorthy等采用刚出生1天的大鼠视网膜节细胞转染ψ2E1A病毒建立的大鼠视网膜细胞系（RGC5）基础上，首次采用丙烯酰胺损伤RGC5，以模拟体内的视神经损伤模型。

本发明人在大鼠视神经的基因芯片中发现视神经损伤后7天，视神经内的Neuritin表达下调5倍；对视神经夹伤9秒后分别取不同的时间点观察视网膜neuritin的表达变化，初步观察到损伤后短时间内3天和7天表达下调明显，13天表达上调，到28天逐渐接近正常水平但仍较正常水平低。视神经损伤早期Neuritin的表达下调，提示在视神经损伤早期给予Neuritin重组蛋白或Neuritin重组病毒治疗可能会对视网膜节细胞的存活产生保护作用并有利于视神经的再生。

本发明的技术方案，主要是构建Neuritin的慢病毒载体，并在视网膜神经节细胞系（RGC5）丙烯酰胺损伤模型中，利用Neuritin的慢病毒载体感染RGC5，观察并探讨Neuritin基因治疗修复RGC5的作用及机制。

Neuritin基因，以下也称NRN1基因或Nrn1基因。

本发明的第一方面，是提供一种携带Neuritin基因的慢病毒载体，该慢病毒载体是携带如SEQIDNO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。

所述的慢病毒载体选用Tronolab系统为四质粒系统，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的穿梭质粒。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件，目的穿梭质粒含有目的基因（Nrn1）以及标记基因红色荧光蛋白（RFP）。较优的，目的穿梭质粒的多克隆位点插入如SEQIDNO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。

本发明的第二方面，提供了一种携带Neuritin基因的慢病毒载体的构建方法，具体步骤如下：

1.Neuritin基因慢病毒表达载体的构建

根据Neuritin（NRN1）基因（GenBank:BC002683.2）设计并合成如下PCR引物：

NRN1-正向引物：5’-CGACGCGTATGGGACTTAAGTTGAAC-3’（SEQIDNO:2）；

NRN1-反向引物：5’-TTTGCGGCCGCTCAGAAGGAAAGCCA-3’（SEQIDNO:3）；

使用PCR方法从含有NRN1基因cDNA（1551bp，如SEQIDNO:1所示）克隆模板中扩增NRN1基因CDS区；将慢病毒载体和目的基因分别双酶切，纯化酶切产物后与NRN1基因PCR产物进行定向连接或重组，其产物转化感受态细菌，对生长出的克隆进行Nrn1基因PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提，钙转法将质粒转入293T细胞，36-48小时后通过荧光显微镜观察融合蛋白RFP。

2.Neuritin基因慢病毒包装

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8小时更换为完全培养基，培养48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，感染Hela细胞后采用倍比稀释法检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。

本发明的第三方面，是提供如SEQIDNO:1所示的Neuritin基因在制备治疗修复视神经损伤药物中的应用。以及，进一步地提供上述的携带Neuritin基因的慢病毒载体在制备治疗修复视神经损伤药物中的应用。

用本发明构建的携带Neuritin基因慢病毒治疗损伤的RGC5：首先采用Neuritin基因慢病毒感染RGC5细胞系，再应用丙烯酰胺致RGC5损伤，观察Neuritin基因过表达后对损伤后RGC5的作用及机制。采用Neuritin蛋白对损伤后RGC5的存活具有保护作用，通过抑制Caspase3的活性减少细胞的早期及晚期凋亡。

携带Neuritin基因的慢病毒载体在制备治疗修复视神经损伤药物中的应用，Neuritin慢病毒可转染视网膜节细胞，临床上，具体可采用玻璃体注射该药物转染视网膜神经节细胞以进行视神经损伤的基因治疗。

本发明基于Neuritin独特的神经营养作用及其在神经创伤、疾病中的表达变化和作用，以Neuritin为靶标对RGC5损伤进行基因治疗，以增强RGC的内在再生能力，改善其存活及再生情况。并推测其对RGC5的存活和再生这一视神经损伤和疾病的关键环节具有明显的作用，从而达到甚至超过给予多种NTF、或多种治疗方法保护视网膜RGC和促进视神经再生的疗效，为临床治疗视神经损伤提供有力的手段和理论依据。

视神经由于其特殊的结构和生理特性，实际上是中枢神经系统（CNS）的一部分。故研究视神经损伤后的修复再生，也对CNS疾病和损伤的治疗有着重要意义。

附图说明

图1是星状孢子碱(Staurosporine)诱导分化视网膜神经节细胞系，

其中A为未诱导的RGC5；B为星状孢子碱(Staurosporine)诱导分化后的RGC5（采用星状孢子碱(Staurosporine)对视网膜神经节细胞进行诱导分化，使其为成熟的神经元样细胞。）标尺=50μm。

图2是不同浓度的丙烯酰胺损伤视网膜神经节细胞系

其中A为相差显微镜下的照片，显示不同浓度丙烯酰胺对视网膜节细胞系（RGC5）损伤24h的作用；B为不同浓度丙烯酰胺对RGC5损伤后最长突起的的变化，0.2mM对RGC5最长突起已有明显损伤作用；C为不同浓度丙烯酰胺对RGC5的存活的影响，0.2mM损伤后RGC5存活影响不显著。因此，本发明拟选用0.2mM的丙烯酰胺以模拟体内的视神经损伤模型，该浓度对突起有明显的损伤作用，而对节细胞存活影响较小。标尺=20μm。

图3是CCK8法测重组人Neuritin对损伤后RGC5的存活的保护作用。

图4是流式细胞术测凋亡

其中A为正常组；B为单纯损伤组；C为Neuritin治疗组；D为CNTF阳性对照组。早期凋亡和晚期凋亡均显示Neuritin治疗组可减少损伤后RGC5的凋亡，保护作用最明显，优于CNTF阳性对照组。

图5是慢病毒转染RGC5

其中A为相差显微镜下RGC5；B为荧光显微镜下本发明构建的慢病毒成功转染上RGC5细胞，转染进病毒后的RGC5可表达红色荧光蛋白（RFP），转染效率约为90%；C为Real-timePCR结果显示过表达后Neuritin基因表达上调约14倍。标尺=100μm。

图6是Westernblot检测Caspase3蛋白活化情况以检测凋亡情况

结果显示Neuritin慢病毒治疗组凋亡最少，优于Neuritin蛋白给药组和CNTF阳性对照组。而Neuritin给药组优于CNTF阳性对照组。

图7是Neuritin慢病毒转染大鼠视网膜神经节细胞。

A为CTB标记的视网膜节细胞，呈绿色荧光；B为Neuritin慢病毒转染视网膜，呈红色荧光；C为两者的共定位。其中箭头所指处为转染上的视网膜神经节细胞，转染效率为约为30%。标尺=20μm。

图8是Neuritin慢病毒表达质粒载体构建图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

实施例1：

1.Neuritin基因慢病毒表达载体构建

（1）慢病毒表达载体及目的基因的酶切

采用pLenO-RIP（购自Addgene公司）载体使用NotI、MluI进行酶切，酶切后的载体准备载体构建时使用。以NRN1基因CDS区的cDNA克隆为模板采用PCR扩增NRN1基因片段，产物使用NotI、MluI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的基因DNA。

（2）连接反应

将酶切后的慢病毒载体和NRN1基因的PCR产物按照表1中的反应体系进行连接反应。

表1：连接反应体系

以上试剂混合后于4℃，12小时连接反应制备克隆连接液，准备转化。

（3）转化，挑克隆鉴定

采用Axygen质粒抽提试剂盒提取质粒，具体抽提步骤如下：过夜培养的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分两次于一个1.5ml离心管中12,000×g离心1分钟，彻底去除上清；加入250μl细菌悬浮液，振荡器充分重悬细菌；加入250μl细菌裂解液，颠倒混匀4－6次；注意：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染；加入250μl细菌裂解液五分钟内加入350μl中和液，轻轻颠倒混匀6－8次；12,000×g，离心10分钟；将上清转移到小量纯化柱中，小量纯化柱插于废液收集管中，12,000×g离心1分钟；不要吸到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染；弃收集管中的废液，将小量纯化柱插于收集管中，加700μl细菌裂解液到小量纯化柱中，12,000×g离心1分钟；重复该步骤一遍；弃收集管中的废液，将小量纯化柱放入同一支收集管中，12,000×g离心1分钟彻底去除细菌裂解液；将小量纯化柱放入新的干净的1.5ml离心管中，加50l2.5mMTris-HCl洗脱液，室温放置1分钟后，12,000×g离心1分钟；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；所得质粒采用PCR鉴定以及NotI和MluI双酶切鉴定，酶切产物挑选阳性克隆送测序。

委托南京金斯瑞生物测序公司测序，1551bp，如SEQIDNO:1所示，测序结果表明NRN1基因号1克隆为鉴定正确的阳性克隆，可进入慢病毒包装的实验流程。

2.Neuritin基因慢病毒包装

（1）慢病毒载体系统质粒基本信息

该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G，目的穿梭质粒（所有质粒均购自Addgene公司）。其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件；目的穿梭质粒含有目的基因以及能表达红色荧光蛋白（RFP）的基因。分别包装含目的基因Nrn1的慢病毒，以及不含目的基因Nrn1的慢病毒以作为对照。

（2）质粒转染

慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞（购自中科院上海细胞所），重新接种于10cm细胞培养皿（每个平皿接种细胞约为2-2.5×10⁶），37℃，50ml/LCO₂培养箱内培养；制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；加入无菌水定容至1800μl，再加入CaCl₂(2.5mol/L)溶液200μl，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000μl，室温放置20-25min。

当细胞密度达60%～70%时转染，将各质粒和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养6-8小时后后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS15ml，轻摇后弃去，重复该步骤3次；每瓶细胞中加入含10%胎牛血清的细胞培养液6ml，继续培养48小时；收集转染72小时的293T细胞上清液；将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，收集离心后的上清液；将上清液以0.45μm滤器过滤；于40ml超速离心管中，4℃，25000rpm/min离心2hrs；而后以冰PBS液或者500μlDMEM培养基重悬病毒沉淀于4℃溶解过夜。

（3）慢病毒滴度测定

采用逐孔稀释滴度测定法:测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，每个96孔中加1×10⁵个细胞，体积为100μl。根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的新鲜培养基。取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。24小时后，加入新鲜培养基100μl。4天后，观察细胞生长状况，并收取细胞进行流式细胞术测定滴度。

最后根据流式细胞仪检测结果计算滴度公式：

滴度（TU/ml）=100000（上样细胞数）×RFP阳性细胞的百分数/病毒上清液的体积（ml）。

实施例2：

1.RGC5的培养及诱导分化

RGC5为刚出生一天的大鼠的视网膜神经节细胞系（参见文献[20]KrishnamoorthyRR,AgarwalP，PrasannaG,etal.Characterizationofatransformedratretinalganglioncellline.BrainResMolBrainRes.2001;86(1-2):1-12.），未完全成熟，首先采用星状孢子碱对其进行诱导，以分化为成熟的神经元样细胞（图1）。未诱导前的RGC5采用高糖DMEM培养基及5%的血清培养RGC5细胞置于含5%CO₂，37℃的培养箱，细胞一天传一次代。使用时采用326nM的星状孢子碱诱导24小时。

2.Neuritin基因过表达及RGC5损伤模型的建立

RGC5培养至80%融合的时候，加入预先摸好浓度的适合的慢病毒量以及一定量的polybrene，24小时后换成正常培养基，96小时后采用荧光显微镜观察RFP的表达，转染效率可达到90%左右（图5），另采用Westernblot及实时荧光定量PCR可观察到转入Neuritin基因的细胞表达约为对照组的10-12倍左右，成功过表达。采用丙烯酰胺对过表达Neuritin基因的RGC5进行损伤，浓度为200nM，损伤24小时（图2）。此RGC5组为Neuritin基因过表达组。

另设组别如下：（1）正常对照组，只加入星状孢子碱诱导，未损伤；（2）单纯损伤组，即只诱导并损伤而不加任何处理组；（3）对照病毒组，为不含Neuritin基因的RFP的对照病毒，处理方式同Neuritin基因过表达组；（4）Neuritin蛋白治疗组，在丙烯酰胺损伤前加入300ng/ml的Neuritin蛋白预处理，隔一天加一次，其他处理同前；（5）睫状神经营养因子（CNTF）阳性对照组，在损伤前加入30ng/ml的CNTF。观察时相点为损伤后的1天、2天、3天、4天、5天。

3.Neuritin基因慢病毒对损伤后RGC5的保护作用及机制

（1）RGC5细胞存活率的检测

RGC5转染Neuritin基因慢病毒后，以5×10³/孔的密度种植于96孔板内，种植一天后密度约为70%，加入316nM的星状孢子碱诱导分化24小时，后采用200nM的丙烯酰胺损伤24小时，换成正常培养基，实验各组分别在损伤后不同时相点采用CCK8法测量其存活。每100μl培养液中加入10μlCCK8，90min后于450nm处测其吸光度值(图3)。

（2）RGC5细胞凋亡情况的检测

RGC5转染Neuritin基因慢病毒后，以1×10⁵/孔的密度种植于90×10mm的培养皿内，细胞融合至80%后，316nM的星状孢子碱诱导分化24h，接着200nM的丙烯酰胺损伤24小时，换成正常培养基，实验各组分别在损伤后不同时相点采用流式细胞术测量其凋亡情况(图4)。

（3）RGC5细胞突起数量及长度变化的观测

RGC5转染Neuritin基因慢病毒后，以2×10⁴/孔种植于24孔板内，细胞融合至70%后，316nM的星状孢子碱诱导分化24小时，接着200nM的丙烯酰胺损伤24小时，换成正常培养基，实验各组分别在损伤后不同时相点相差显微镜下拍照。采用ImageJ对RGC5的突起数量及长度进行测量以及统计学分析。

（4）RGC5细胞内存活及生长相关蛋白表达的变化

RGC5转染Neuritin基因慢病毒后，以1×10⁵/孔的密度种植于90×10mm的培养皿内，细胞融合至80%后，316nM的星状孢子碱诱导分化24小时，接着200nM的丙烯酰胺损伤24小时，换成正常培养基，实验各组分别在损伤后不同时相点提取蛋白，采用WesternBlot以及免疫细胞化学方法分别检测STAT3、PI3/Akt、MAPK信号通路及Caspase3蛋白(图6)的表达变化情况，以阐明Neuritin作用机制。

实施例3：

1.慢病毒体内转染视网膜节细胞以及Neuritin的过表达

采用玻璃体注射Neuritin慢病毒，一周后采用4%多聚甲醛全身灌注老鼠，取视网膜铺片，采用免疫组化βⅢ-tubulin染色或者霍乱毒素B亚单位（CTB）注射共定位视网膜节细胞以观察转染效果，转染效率约为20-30%(如图7所示)。

采用Westernblot以及免疫组化的方法观察Neuritin慢病毒转染后Neuritin蛋白的过表达以及表达定位的情况。

2.视神经损伤模型的建立

本发明采用视神经夹伤模型，使用Yasargil脑动脉瘤夹于成年雄性大鼠视神经眼球后约1mm处夹伤9s，具体操作参照本发明人已发表文献WangR,XuJ,XieJ,etal.Hyperbaricoxygenpreconditioningpromotessurvivalofretinalganglioncellsinaratmodelofopticnervecrush[J].JNeurotrauma.2010(27):763-70.，模拟临床造成不完全损伤。

实验动物分组为：Neuritin慢病毒组、对照病毒组、生理盐水组。损伤的时间点为：2周，4周，8周。

3.视神经损伤修复相关指标检测

（1）视网膜节细胞的荧光标记、尼氏染色和计数

各组动物（Neuritin慢病毒组、对照病毒组、生理盐水组，n=5），分别取损伤后不同时间点（2周，4周，8周），采用Hamliton微量注射器玻璃体注射带荧光素的霍乱毒素B亚单位（CTB）对视网膜节细胞进行标记，48小时后全身灌注固定，取材，视网膜铺片，定位视神经乳头后，在其上、下、鼻、颞四个象限中按距离视乳头1/6、3/6、5/6处各随机取2个高倍视野拍照，进行节细胞计数，将各组的细胞密度（细胞数/高倍视野）进行比较并行统计学分析。

随后可进行尼氏染色：甲苯胺蓝染液5min，75%乙醇2min，95%乙醇2min，100%乙醇5min次，再经二甲苯透明后封片观察。普通显微镜下观察，按上述方法进行节细胞计数（取视野中体积较大、胞质里有颗粒状尼氏小体、核染色浅及核仁明显的细胞为视网膜节细胞），将各组的细胞密度（细胞数/高倍视野）进行比较并行统计学分析。

（2）视神经轴突荧光标记和神经生长相关蛋白质（GAP-43）免疫荧光染色

各组动物（Neuritin慢病毒组、对照病毒组、生理盐水组，n=5），分别取损伤后不同时间点（2周，4周，8周），采用玻璃体注射CTB对视神经轴突进行标记，48小时后全身灌注固定取材，后固定4小时，30%蔗糖脱水，对视神经行冰冻切片，观察并统计标记的再生轴突数量及其分布，以比较存活轴突的数量。

视神经冰冻切片，进行GAP43的染色，以显示轴突的再生活性。首先PBS洗5分钟×3次，0.4%Triton-X100破膜10分钟，10%血清室温下封闭1小时，甩干切片，一抗（GAP-43）4℃孵育过夜，次日PBS洗5分钟×3次，荧光标记二抗室温反应1小时，PBS洗5分钟×3次，DAPI染核5分钟，PBS洗5分钟×3次，甘油碳酸盐封片剂封片，于荧光显微镜下观察。

（3）瞳孔对光反射和视觉诱发电位

视神经夹伤为不完全损伤模型，采用瞳孔对光反射和视觉诱发电位以显示各组动物的视觉功能情况。各组动物（Neuritin慢病毒组、对照病毒组、生理盐水组，n=5），分别取损伤后不同时间点（2周，4周，8周），麻醉后，于暗室中，将未做手术侧眼睛用锡箔纸避光，用一定的光线刺激手术侧眼睛，采用体视显微镜拍照（实验方法参考文献[22]deLimaS,KoriyamaY,KurimotoT,etal.Full-lengthaxonregenerationintheadultmouseopticnerveandpartialrecoveryofsimplevisualbehaviors[J].ProcNatlAcadSciUSA.2012(109):9149-54.）。分别测量其潜伏期以及最小瞳孔直径的比例以揭示其视觉通路的功能。

视觉诱发电位（实验方法参考文献[23]Pangratz-FuehrerS,KaurK,OusmanSS,etal.FunctionalrescueofexperimentalischemicopticneuropathywithalphaB-crystallin[J].Eye(Lond).2011(25):809-17.），各组动物麻醉后，大鼠固定于脑立体定位仪上，开颅定位于大脑枕叶皮质区，检测其闪光视觉诱发电位。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (1)

1.一种携带Neuritin基因的慢病毒载体在制备治疗修复视神经损伤药物中的应用，其特征在于，该慢病毒载体是携带如SEQIDNO:1所示的Neuritin基因的DNA序列；所述的慢病毒载体选用Tronolab系统，为四质粒系统由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的穿梭质粒；其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE和pMD2G含有病毒包装所必须的元件，目的穿梭质粒含有目的基因以及标记基因红色荧光蛋白；所述的慢病毒载体的构建方法的具体步骤如下：

A)Neuritin基因慢病毒表达载体的构建

设计并合成PCR引物如下：

NRN1-正向引物如SEQIDNO:2所示；

NRN1-反向引物中SEQIDNO:3所示；

使用PCR方法从含有NRN1基因cDNA克隆模板中扩增NRN1基因CDS区；将慢病毒载体和目的基因分别双酶切，纯化酶切产物后与NRN1基因PCR产物进行定向连接或重组，其产物转化感受态细菌，对生长出的克隆进行Nrn1基因PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的克隆，证明目的基因已经定向连入目的载体；再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对，比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体,将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提，钙转法将质粒转入293T细胞，36-48小时后通过荧光显微镜观察融合蛋白RFP；

B)Neuritin基因慢病毒包装

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8小时更换为完全培养基，培养48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，感染Hela细胞后采用倍比稀释法检测病毒滴度。