CN104911140A - 一种体外胶质疤痕形成模型及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学的技术领域，本发明提供了一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，包括将纯化后的脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞以一定的数量比分别种植于腔室载玻片上相邻的小室内，添加培养基进行培养；当细胞贴壁生长后，再将小室间的隔板移除，继续培养；当观察到脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞这两种细胞生长并相互靠拢时，用锐器在两种细胞交界处作机械划痕损伤细胞，最终形成类胶质疤痕的结构。本发明获得的体外胶质疤痕形成模型能够较好地模拟体内胶质疤痕形成的整个过程，并出现相应的胶质疤痕形态结构及相关细胞生物学与分子生物学的变化，为胶质疤痕形成的机制研究及相关治疗研究提供体外细胞水平的实验模型。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学的技术领域，具体涉及一种可以在体外模拟中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的模型及其构建方法，为胶质疤痕形成的机制研究及相关治疗研究提供体外细胞水平的实验模型。
背景技术
中枢神经系统损伤时，会引起静止的星形胶质细胞转变成反应性星形胶质细胞，并围绕损伤部位伸出星状粗大突起；同时，脑(脊)膜纤维细胞也会迁移到损伤处，分布在损伤组织与反应性星形胶质细胞之间，排列紧密；反应性星形胶质细胞会向脑(脊)膜纤维细胞伸出指状突起，彼此结合；两种细胞共同分泌并形成特殊的细胞外基质，细胞及细胞外基质共同形成较为致密的疤痕组织(Shearer MC,Fawcett JW.The astrocyte/meningeal cell interface-a barrier tosuccessful nerve regeneration？Cell Tissue Res.2001；305:267-273.)。疤痕组织封闭损伤组织，使其与正常组织隔离(Sofroniew MV.Molecular dissection of reactiveastrogliosis and glial scar formation.Trends Neurosci.2009；32:638-647.VoskuhlRR,Peterson RS,Song B,Ao Y,Morales LB,Tiwari-Woodruff S,Sofroniew MV.Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptiveimmune inflammation of the CNS J Neurosci.2009；29:11511-11522.)。
疤痕组织一般分胶质疤痕和纤维疤痕两种，前者为主，后者为辅；其中，胶质疤痕中含有硫酸软骨素蛋白聚糖、结合腕蛋白等具有抑制轴突再生的物质(Sandvig A,Berry M,Barrett LB,Butt A,Logan A.Myelin-,reactive glia-,andscar-derived CNS axon growth inhibitors:Expression,receptor signaling,andcorrelation with axon regeneration.Glia.2004；46:225-251.)；纤维疤痕中致密的Ⅳ型胶原，及纤维结合蛋白和层粘连蛋白等结构可以成为轴突再生的陷阱(KlapkaN,Muller HW.Collagen matrix in spinal cord injury.J Neurotrauma2006；23:422-435.Kawano H,Kimura-Kuroda J,Komuta Y,Yoshioka N,Li HP,Kawamura K,Li Y,Raisman G.Role of the lesion scar in the response to damageand repair of the central nervous system.Cell Tissue Res.2012；349:169-180.)。
胶质疤痕虽然能对因损伤而导致的中枢神经系统开放性创面及时封闭，但同时也因此界面的出现而关闭了轴突生长的通道，起到阻碍轴突再生的负面效果(Li Y,Li D,Ibrahim A,Raisman G.Repair involves all three surfaces of the glialcell.Prog Brain Res.2012；201:199-218.)。正是这些不利因素协同作用致使损伤的中枢神经系统难以组织修复和功能重建，造成患者终生残疾，给个人、家庭及整个社会带来沉重的经济和精神负担。当然，治疗中过度抑制胶质疤痕的形成，也会对炎症的限制和神经元的生存，造成不利影响(Okada S,Nakamura M,Katoh H,Miyao T,Shimazaki T,Ishii K,Yamane J,Yoshimura A,Iwamoto Y,Toyama Y,Okano H.Conditional ablation of Stat3or Socs3discloses a dual role forreactive astrocytes after spinal cord injury.Nat Med.2006；12:829-834.HerrmannJE,Imura T,Song B,Qi J,Ao Y,Nguyen TK,Korsak RA,Takeda K,Akira S,Sofroniew MV.STAT3is a critical regulator of astrogliosis and scar formation afterspinal cord injury.J Neurosci.2008；28:7231-7243.)。以上这些研究结果，仅是人们对胶质疤痕作用的肤浅认识，从中可看出胶质疤痕并不能简单的进行好、坏分类，还需要对此进行更深入的探究(Sofroniew MV.Molecular dissection ofreactive astrogliosis and glial scar formation.Trends Neurosci.2009；32:638-647.)。
研究胶质疤痕形成的机制、或寻找治疗胶质疤痕过度增生的靶点，除了在动物体内进行直接研究(存在影响因素多且复杂、费用大、动物伦理等问题)外，更简洁的方式是采取体外研究来模拟胶质疤痕形成的过程，了解相关细胞的细胞生物学变化。到目前为止有如下几种胶质疤痕的培养模型：(一)利用硝酸纤维素片插入皮层，然后将其移出，沾粘于表面的组织进行培养(Rudge JS,Silver J.Inhibition of neurite outgrowth on astroglial scars in vitro.J Neurosci.1990；10:3594-3603.)；此方法虽能体外获得胶质疤痕的相应组分，但它并不是通过体外细胞培养形成的结构，所以整个胶质疤痕形成的过程无法观察到。(二)用星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞直接共同培养，产生类似胶质界膜(glial-limiting membrane)的物质及相关效应(Ness R,David S.Leptomeningealcells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro.Glia.1997；19:47-57.Struckhoff G.Cocultures of meningeal and astrocytic cells–a modelfor the formation of the glial-limiting membrane.Int J Dev Neurosci.1995；13:595-606.)；此方法可以观察到星形胶质细胞的活化过程，但在模拟胶质界膜形成过程中，可能更接近神经组织正常发育的过程，并没有中枢神经系统受损时的相关因素介入。(三)用3D胶固化胶质疤痕的抑制蛋白聚糖等物质，观察对神经元等细胞生长的作用(Gilbert RJ,McKeon RJ,Darr A,Calabro A,Hascall VC,Bellamkonda RV.CS-4,6is differentially upregulated in glial scar and isa potent inhibitor of neurite extension.Mol Cell Neurosci.2005；29(4):545-58.)；但此法并无形成胶质疤痕的细胞参与，所以仅是对某种抑制物质的作用进行研究。(四)将星形胶质细胞和脑(脊)膜纤维细胞在硅橡胶培养皿上培养，然后通过适当的机械拉伸形成细胞创伤，能使星形胶质细胞出现星状和聚集成团，并且胶质疤痕的标记物表达明显增强(Wanner IB,Deik A,Torres M,Rosendahl A,Neary JT,Lemmon VP,Bixby JL.A new in vitro model of the glial scar inhibitsaxon growth.Glia.2008；56:1691-709.)；此方法由于要专用的硅橡胶细胞培养皿，其货源及价格不尽如人意。(五)利用β-转化生长因子的作用，使胶质细胞和脑(脊)膜纤维细胞聚集成团及胶质疤痕的特征性标记物出现(Kimura-Kuroda J,Teng X,Komuta Y,Yoshioka N,Sango K,Kawamura K,Raisman G,Kawano H.Anin vitro model of the inhibition of axon growth in the lesion scar formed after centralnervous system injury.Mol Cell Neurosci.2010；43:177-87.)；当然这种方法是借助生物活性分子的直接作用而引发的结果，但在中枢神经系统损伤时，引发的胶质疤痕形成过程中，生物活性分子水平变化不是先发因素，而是继发的结果，随后再诱发胶质疤痕的形成；所以此方法还不能完全再现胶质疤痕形成的整个过程。
从上述已出现的体外胶质疤痕实验模型中，可以看出还存在着诸多不足，目前尚无构建成功一种理想的体外胶质疤痕形成模型。作为一个理想的体外胶质疤痕形成模型，首先要能较好的模拟体内胶质疤痕形成的整个过程，有相应种类的细胞参与，并出现相应的胶质疤痕形态结构及相关细胞生物学与分子生物学的变化；能方便利用此实验模型，进行神经元生长抑制作用、或其它相关深入试验的探索；模型制备简单，胶质疤痕形成过程观察方便，制备的模型成本合理、材料来源容易等特点。
发明内容
本发明的目的在于构建一种体外胶质疤痕形成模型及其构建方法，本发明的另一目的在于提供该模型在胶质疤痕形成的机制研究及相关治疗药物筛选中的应用。
为达到本发明的目的，克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题主要有：1.选择合适种类的细胞，以及细胞之间合适的配比；2.体外培养环境(体外胶质疤痕形成模型构建基质、载体)；3.培养过程中添加何种细胞因子；4.如何通过适当的机械划痕来形成细胞创伤等。
为构建一个理想的体外胶质疤痕形成模型，本发明的主要技术方案如下：
首先体外利用脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞联合培养，并在1:1、1:2、2:1、3:4等比例中筛选到最合适的配比(3:4)，这样的细胞组合优点在于形成的胶质疤痕组织更接近体内的实际状况。
其次利用腔室载玻片来作为体外培养环境，可以为随后的形态学技术处理及显微镜观察提供方便。
在培养过程中，不添加β-转化生长因子等细胞因子，主要考虑到中枢神经系统受损的主要诱因往往是撞击等机械性的损伤，随后才引起β-转化生长因子的水平升高，所以β-转化生长因子并不是胶质疤痕形成的起始因素；但使用了一般细胞在贴壁培养时添加的介质：L-多聚赖氨酸，并对其浓度的效果进行了选择性比较，表明在10、25、50、75μg/ml等浓度范围内，50μg/ml和75μg/ml两种浓度效果均可，从节约成本的角度出发，后续实验均选用50μg/ml的L-多聚赖氨酸。
最后通过特定的机械划痕使细胞损伤，从而引起两种细胞组成细胞团并分泌相应细胞外基质，形成胶质疤痕，达到体外模拟胶质疤痕的细胞水平实验模型目的。
本发明提供了一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，所述的体外胶质疤痕形成模型也称为类胶质疤痕模型、或体外模拟中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的实验模型，所述的构建方法包括以下步骤：
A.将纯化后的脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞以数量比为3:4的比例分别种植于腔室载玻片上相邻的小室内，小室底部的载玻片已预先用50-75μg/ml的L-多聚赖氨酸包被，每个小室内为100μl～300μl(优选为200μl)的细胞悬液，脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞细胞密度为1×104/ml～8×105/ml(优选为脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞细胞密度分别为6×104/ml和8×104/ml；或脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞细胞密度分别为3×105/ml和4×105/ml)；
B.0.5小时后将小室之间的隔板移除，总量添加5ml含10％FBS的DMEM/F12培养基，于37℃，5％CO2培养箱培养2天以上；
C.当观察到脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞这两种细胞相互靠拢时，显微镜下用锐器在两种细胞交界处作机械划痕，所述的机械划痕类似“丰”字，换含10％FBS的DMEM/F12培养液后继续培养，培养6天以上形成类胶质疤痕的结构。
本发明中，细胞悬液，是用含10％FBS的DMEM/F12培养液来稀释细胞的。
本发明中，腔室载玻片，选用是4孔规格。
本发明中，5％CO2培养箱培养3～5d左右，可观察到脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞这两种细胞相互靠拢时，相互靠拢是两种细胞相互靠近并接触。
本发明中，锐器，较优的选用一次性1ml注射器针尖。
本发明中，所述的机械划痕类似“丰”字，即十六横一竖且一竖贯通十六横，其中纵向划痕(一竖)为16次，横向划痕各为1次。
本发明中，步骤C换液后继续培养7～8d形成类胶质疤痕的结构。
本发明所述的脑(脊)膜纤维细胞(Meningeal Fibroblast)，可用文献方法获得(Kimura-Kuroda J,Teng X,Komuta Y,Yoshioka N,Sango K,Kawamura K,Raisman G,Kawano H.An in vitro model of the inhibition of axon growth in thelesion scar formed after central nervous system injury.Mol Cell Neurosci.2010；43(2):177-87.)；或从中科院细胞所获得。
本发明所述的星形胶质细胞，可用文献方法获得(Kimura-Kuroda J,Teng X,Komuta Y,Yoshioka N,Sango K,Kawamura K,Raisman G,Kawano H.An in vitromodel of the inhibition of axon growth in the lesion scar formed after central nervoussystem injury.Mol Cell Neurosci.2010；43(2):177-87.)；或从北京北纳创联生物技术研究院获得(资源编号：3111C0002000000080)。
本发明中，步骤A脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞的纯化后，为本领域的常规技术手段。
在本发明的一个优选实施例中，提供了步骤A中脑(脊)膜纤维细胞的培养、纯化及鉴定，具体步骤如下：
1.1分离大脑
出生后24h的SD大鼠，75％酒精浸泡消毒；断头并用眼科弯剪剪开头颅皮肤，暴露“人”字缝；用眼科直剪沿“人”字缝将颅骨剪开并翻向两侧，暴露两侧大脑半球，用显微弯镊取出完整大脑，置于预冷的HBSS缓冲液。
1.2分离大脑脑膜及细胞培养纯化
体视显微镜下，用显微镊夹住脑膜边缘沿大脑皮层表面缓慢地剥离，得到完整的脑膜置于另一预冷的HBSS缓冲液；
显微剪剪碎脑膜后，加0.125％Trypsin-EDTA于37℃下消化18min，加含10％FBS的DMEM/F12培养基，终止消化并离心收集沉淀，DMEM/F12培养基洗涤2遍后，加适量含10％FBS的DMEM/F12培养基种植于细胞培养板中，于37℃、5％CO2的培养箱培养，24h后吸弃含有悬浮细胞的培养基并换液，此后隔天换液。
1.3脑(脊)膜纤维细胞的鉴定
脑(脊)膜纤维细胞经传代后以1×105/ml的密度接种于预先用50μg/ml L-多聚赖氨酸包被的盖玻片上，通过层粘连蛋白(fibronectin,FN)免疫荧光细胞化学染色鉴定。
在本发明的一个优选实施例中，提供了步骤A中星形胶质细胞的培养、纯化及鉴定，具体步骤如下：
2.1分离大脑
同上1.1
2.2分离大脑皮层及细胞培养纯化
剥离脑膜后的大脑皮层，预冷HBSS液冲洗3遍后，剪碎大脑皮层，加0.125％Trypsin-EDTA于37℃下消化12min，加含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化；用5ml的移液器轻轻吹打，离心收集沉淀；DMEM/F12培养基洗涤2遍后，加适量含10％FBS的DMEM/F12培养基种植于预先用50μg/ml L-多聚赖氨酸包被的培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱培养，此后隔天换液。
培养至第7～9d时取出培养瓶拧紧瓶盖，封口膜封住瓶盖口，固定于恒温培养床，37℃，280rmp/min，10～12h，换液继续培养5～6d后同条件处理5～6h。
2.3星形胶质细胞的鉴定
星形胶质细胞经传代后以1×105/ml的密度接种于预先用50μg/ml L-多聚赖氨酸包被的盖玻片上，通过神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光细胞化学染色鉴定。
进一步地，本发明提供了根据上述构建方法获得的体外胶质疤痕形成模型。
根据本发明提供的一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，获得的类胶质瘢痕进行如下鉴定：免疫荧光细胞化学技术检测胶质疤痕的细胞团形态结构及细胞外基质的表达情况。
鉴定结果：免疫荧光细胞化学染色结果显示FN(+)、GFAP(+)、ephrinB2(+)、EphB2(+)、NG2(+)、Phosphocan(+)、Neurocan(+)如图1-6所示，且脑(脊)膜纤维细胞包裹在细胞团的外侧，星形胶质细胞被包裹在细胞团的中心部位，细胞外基质也主要位于细胞团的外侧及脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞的交界处。
本发明还提供了上述体外胶质疤痕形成模型在胶质疤痕形成的机制研究及相关治疗胶质疤痕药物筛选中的应用。
在胶质疤痕形成的机制研究，可以是对具体的信号通路的了解，以便寻找治疗的作用靶点。
所述的药物为预防中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物或治疗胶质疤痕的药物。
本发明的体外胶质疤痕形成模型能够较好地模拟体内胶质疤痕形成的整个过程，并出现相应的胶质疤痕形态结构及相关细胞生物学与分子生物学的变化；利用本发明的体外胶质疤痕形成模型，可以进行神经元生长抑制作用、或其它相关深入试验的探索；本发明的体外胶质疤痕形成模型制备简单，胶质疤痕形成过程观察方便，制备的模型成本合理、材料来源容易等特点。
附图说明
图1为星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养(分阴性对照组、划痕损伤组、阳性对照组)后，GFAP与FN的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图2为星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养(分阴性对照组、划痕损伤组、阳性对照组)后，ephrinB2与FN的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图3为星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养(分阴性对照组、划痕损伤组、阳性对照组)后，EphB2与ephrinB2的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图4为星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养(分阴性对照组、划痕损伤组、阳性对照组)后，NG2与FN的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图5为星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养(分阴性对照组、划痕损伤组、阳性对照组)后，Phosphocan与FN的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图6为星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养(分阴性对照组、划痕损伤组、阳性对照组)后，Neurocan与FN的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图7为不同比例(分1:1、1:2、2:1、3:4四组)的星形胶质细胞与脑(脊)膜纤维细胞共培养结果后，GFAP与FN的荧光免疫细胞化学技术的结果；
图8为不同浓度(分10、25、50、75μg/ml四组)的L-多聚赖氨酸条件下，星形胶质细胞、脑(脊)膜纤维细胞分别培养的结果。
图9为不同划痕(“十”字、“井”字、“丰”字)方式后，类胶质疤痕形成的结果。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，此实施例是在以本发明技术方案为前提下进行的实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实验材料与试剂：
新生SD大鼠，来自南通大学实验动物中心；
DMEM/F12、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、L-多聚赖氨酸、Trypsin-EDTA、HBSS缓冲液、hTGF-β1等试剂均购自Gibco公司；
FN、GFAP、NG2、Neurocan等抗体均购自Abcam公司，ephrinB2和EphB2等抗体购自Thermo公司和Immunoway公司，Phosphocan购自Millipore公司；
RNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司，逆转录试剂盒购自Thermo公司，2xTaq MasterMix和DNAmarker均购自康为世纪公司。
实施例1：脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞的培养、纯化及鉴定
1.脑(脊)膜纤维细胞的培养、纯化及鉴定
1.1分离大脑
出生后24h的SD大鼠，75％酒精浸泡消毒；眼科弯剪断头，用拇指和食指固定鼠头，使用眼科弯剪剪开头颅皮肤；暴露“人”字缝，更换眼科直剪，沿“人”字缝将颅骨剪开并翻向两侧，此时暴露两侧大脑半球，使用弯头显微镊从颅底将整个大脑分离出来，置于预冷的HBSS缓冲液。
1.2分离大脑脑膜及脑(脊)膜成纤维细胞培养纯化
体视显微镜下，大脑皮层正面向上，用一显微镊固定大脑，另一显微镊夹住脑膜沿着皮层边缘缓慢地轻轻揭下，即可将完整的脑膜分离下来；同样的方法将所有大脑半球的脑膜分离，转置另一预冷的HBSS缓冲液；
显微剪剪碎脑膜后，加0.125％Trypsin-EDTA于37℃下消化18min，加含10％FBS的DMEM/F12培养基，终止消化并离心收集沉淀，DMEM/F12培养基洗涤2遍后，加适量含10％FBS的DMEM/F12培养基种植于六孔板中，于37℃、5％CO2的培养箱培养，24h后吸弃含有悬浮细胞的培养基并换液，此后隔天换液。
1.3脑(脊)膜纤维细胞的鉴定
脑(脊)膜纤维细胞经传代后以1×105/ml的密度接种于预先用50μg/ml L-多聚赖氨酸包被的盖玻片，对细胞行层粘连蛋白(fibronectin,FN)免疫荧光细胞化学染色鉴定。
2.星形胶质细胞的培养、纯化及鉴定
2.1分离大脑
同1.1
2.2分离大脑皮层及星形胶质细胞培养纯化
体视显微镜下剥离脑膜后，分离大脑皮层，预冷HBSS液冲洗3遍后，剪碎大脑皮层，加0.125％Trypsin-EDTA于37℃下消化12min，加含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化；用5ml的移液器轻轻吹打，离心收集沉淀；DMEM/F12培养基洗涤2遍后，加适量含10％FBS的DMEM/F12培养基种植于预先用50μg/ml L-多聚赖氨酸包被的75cm2培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱培养，此后隔天换液。
培养至第7～9d时取出培养瓶拧紧瓶盖，封口膜封住瓶盖口，固定于恒温培养床，37℃，280rmp/min，10～12h，换液继续培养5～6d后同样处理，37℃，280rmp/min，5～6h。
2.3星形胶质细胞的鉴定
星形胶质细胞经传代后以1×105/ml的密度接种于预先用50μg/ml L-多聚赖氨酸包被的盖玻片上，对细胞行神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)免疫荧光细胞化学染色鉴定。
实施例2：本发明类胶质疤痕模型的建立及鉴定
3.1类胶质疤痕的建立
将纯化后的6×104个脑(脊)膜成纤维细胞和8×104个星形胶质细胞分别种植于相邻的腔室载玻片(Nunc公司)小室，小室底部的载玻片已预先用50μg/mlL-多聚赖氨酸包被，每室大约200μl的细胞悬液(脑(脊)膜成纤维细胞和星形胶质细胞的密度比即为3:4)，0.5h后将小室移除，添加5ml含10％FBS的DMEM/F12培养基，于37℃，5％CO2培养箱培养3～5d左右，两种细胞已相互靠拢，取一次性1ml注射器针尖，显微镜下在两细胞交界处似“丰”字划痕，其中纵向划痕16次，横向1次，换液后继续培养，约7～8d左右形成类胶质疤痕的结构。
3.2类胶质瘢痕的鉴定
经划痕后再培养7～8d，两种细胞开始聚集成较大的细胞团，体积较TGF-β1作用后的类胶质疤痕结构大。
免疫荧光细胞化学技术检测胶质疤痕的细胞团形态结构及细胞外基质的标记物表达情况分析。
细胞的分子表达及细胞外基质检测的方法参见文献(王晓冬、汤乐民编箸.生物光镜标本技术.北京：科学社，2007)
图中不对共培养细胞进行任何处理作为阴性对照组，采用机械划痕进行损伤共培养细胞作为划痕损伤组，而采用TGF-β1对共培养细胞进行作用作为阳性对照组。
阴性组中星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞相互交织在一起，分布均匀，无明显细胞聚集现象(见图1-6第一排)；阳性对照组中，添加了TGF-β1，可以观察到星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞发生明显迁移，并最终聚集成团(见图1-6第三排)；而划痕损伤组同样出现阳性对照组的现象，且形成的细胞团的细胞数多，多数细胞团体积比阳性对照组的大(见图1-6第二排)。通过免疫荧光细胞化学染色结果显示脑膜成纤维细胞呈FN阳性(见图1、2、4-6)、星形胶质细胞呈GFAP阳性(见图1)，在划痕损伤组和阳性对照组呈现出ephrinB2阳性(见图2、3)和EphB2阳性(见图3)；并根据这些阳性标记物的分布情况可以发现，划痕损伤组与阳性对照组所形成的细胞团，均是脑(脊)膜纤维细胞包裹在细胞团的外侧，星形胶质细胞被包裹在细胞团的中心部位；另外免疫荧光细胞化学染色还发现NG2(见图4)、Phosphocan(见图5)、Neurocan(见图6)等呈阳性，并且这些细胞外基质主要存在于细胞团的外侧及脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞的交界处。
以上实验结果均说明，本发明的体外胶质疤痕形成模型能够较好地模拟体内胶质疤痕形成的整个过程，并出现相应的胶质疤痕形态结构及相关细胞生物学与分子生物学的变化。
对比例1：脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞联合培养比例的选择
本实验将脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞联合培养的数量比例设定为1:1、1:2、2:1、3:4四个比例范围进行试验，实验方法同实施例2中的3.1类胶质疤痕的建立方法，两种细胞的总数和对应比例如下：
1:1 6×104个脑(脊)膜成纤维细胞和6×104个星形胶质细胞
1:2 4×104个脑(脊)膜成纤维细胞和8×104个星形胶质细胞
2:1 8×104个脑(脊)膜成纤维细胞和4×104个星形胶质细胞
3:4 6×104个脑(脊)膜成纤维细胞和8×104个星形胶质细胞
发现1:1、1:2、2:1三组中，两种细胞间无法较好的形成胶质疤痕样的细胞团，而仅有脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞以3:4时，才能形成较为理想大小的细胞团(见图7)。
对比例2：
在选择体外培养环境时，试用了盖玻片和腔室载玻片两种。发现由于普通盖玻片厚度一般为0.17±0.02mm，比较薄，在后续的形态学技术处理过程中很容易破碎，而腔室载玻片比较厚实，且又能将两种细胞隔离培养，因此就成为本实验的最佳选择。
对比例3：
在添加L-多聚赖氨酸作为贴壁培养的细胞介质时，选择了10、25、50、75μg/ml四个不同浓度，通过观察发现两种细胞的生长状态均在50和75μg/ml两个浓度时较好(见图8)，从节约的角度出发，选择了50μg/ml这个浓度。
对比例4：
在培养过程中，添加β-转化生长因子，结果可以模拟胶质疤痕的细胞团形成，但形成的细胞团较小(见图1-6第三排)，为此选择了机械性损伤的方法，试图形成细胞团。
对比例5：
在对细胞进行机械性损伤时，选择了几种不同划痕损伤：“十”字、“井”字和“丰”字三种方式进行试验，发现“十”字和“井”字两种划痕损伤方式时，两种细胞间无法较好的形成胶质疤痕样结构，而仅有“丰”这种方式，能产生理想的胶质疤痕细胞团(见图9)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤：
A.将纯化后的脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞以数量比为3:4的比例分别种植于腔室载玻片上相邻的小室内，小室底部的载玻片已预先用50-75μg/ml的L-多聚赖氨酸包被，每个小室内为100μl～300μl的细胞悬液，脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞细胞密度为1×104/ml～8×105/ml；
B.0.5小时后将小室之间的隔板移除，总量添加5ml含10％FBS的DMEM/F12培养基，于37℃，5％CO2培养箱培养2天以上；
C.当观察到脑(脊)膜纤维细胞和星形胶质细胞这两种细胞相互靠拢时，显微镜下用锐器在两种细胞交界处作机械划痕，所述的机械划痕类似“丰”字，换含10％FBS的DMEM/F12培养液后继续培养，培养6天以上形成类胶质疤痕的结构。
2.根据权利要求1所述的一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，其特征在于，步骤A所述的细胞悬液，是用含10％FBS的DMEM/F12培养液来稀释细胞的。
3.根据权利要求1或2所述的一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，其特征在于，步骤B中，5％CO2培养箱培养3～5天。
4.根据权利要求1或2所述的一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，其特征在于，步骤C所述的锐器为一次性1ml注射器针尖。
5.根据权利要求1或2所述的一种体外胶质疤痕形成模型的构建方法，其特征在于，步骤C所述的机械划痕类似“丰”字，为横向划痕16道，每道用锐器划1次；和纵向划痕1道，纵向划痕一道用锐器划16次，且每次都贯通横向划痕十六道。
6.一种根据权利要求1至5任一所述的体外胶质疤痕形成模型的构建方法获得的体外胶质疤痕形成模型。
7.根据权利要求6所述的体外胶质疤痕形成模型，其特征在于，模型中的类胶质瘢痕具有以下特性：脑(脊)膜纤维细胞包裹在细胞团的外侧，星形胶质细胞被包裹在细胞团的中心部位，细胞外基质也主要位于细胞团的外侧及脑(脊)膜纤维细胞与星形胶质细胞的交界处。
8.根据权利要求6或7所述的体外胶质疤痕形成模型，其特征在于，模型中的类胶质瘢痕具有以下特性：
免疫荧光细胞化学技术检测胶质疤痕细胞外基质中FN、GFAP、ephrinB2、EphB2、NG2、Phosphocan、Neurocan呈阳性。
9.一种如权利要求6所述的体外胶质疤痕形成模型在胶质疤痕形成的机制研究中的应用。
10.一种如权利要求6所述的体外胶质疤痕形成模型在筛选治疗胶质疤痕药物中的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN114381423A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-22 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103989536A (zh) * | 2014-04-24 | 2014-08-20 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种精准化小鼠脊髓夹伤夹子和夹伤力度调整方法 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103989536A (zh) * | 2014-04-24 | 2014-08-20 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种精准化小鼠脊髓夹伤夹子和夹伤力度调整方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| INA B. WANNER，ET AL: "A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth", 《GLIA》 * |
| JUNKO KIMURA-KURODA，ET AL: "An in vitro model of the inhibition of axon growth in the lesion scar formed after central nervous system injury", 《MOLECULAR AND CELLULAR NEUROSCIENCE》 * |
| 朱舟等: "胶质疤痕研究新进展", 《国外医学物理医学与康复学分册》 * |
| 胡凌云等: "脊髓损伤模型大鼠星形胶质化形成与Akt/mTOR/p70S6K信号通路的激活", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861482A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-08-17 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 体外细胞疾病模型及其制备方法 |
| CN105861482B (zh) * | 2016-04-05 | 2019-10-11 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 体外细胞疾病模型及其制备方法 |
| CN114381423A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-22 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种体外构建瘢痕疙瘩模型的方法 |
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