CN104342404B - 一种获得调节性巨噬细胞的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，公开了一种体外获得调节性巨噬细胞的方法。涉及使用脾脏内皮基质细胞诱导一种新的调节性巨噬细胞的方法。具体而言，本发明所述的方法材料包括小鼠脾脏基质内皮细胞和骨髓单个核细胞。将两者共培养可以使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞，表达巨噬细胞表面分子标志，以高表达CD45RB，中等表达CD11c为特征，并且该细胞具有类似于M2b性巨噬细胞的细胞因子表达谱。依赖于与ESSC接触培养，该巨噬细胞能够分泌高水平IL‑10，并且在体外抑制T细胞增殖和诱导T细胞凋亡，说明该方法所分选的巨噬细胞经过实验证实呈现调节性巨噬细胞的特点。该方法为体外大量诱导获得高分泌IL‑10的巨噬细胞提供了新的方法，可以应用于实验和临床。

Description

一种获得调节性巨噬细胞的新方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及使用脾脏内皮基质细胞诱导一种调节性巨噬细胞的方法。具体而言，本发明所述的方法材料包括小鼠脾脏基质内皮细胞和骨髓单个核细胞。将两者共培养可以使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞，表达巨噬细胞表面分子标志，以高表达CD45RB，中等表达CD11c为特征。该巨噬细胞能够分泌高水平IL-10，并且在体外抑制T细胞增殖和诱导T细胞凋亡，说明该方法所分选的巨噬细胞经过实验证实呈现调节性巨噬细胞的特点。

背景技术

巨噬细胞是一类多功能的固有免疫细胞，分布于体内的各个器官、结缔组织、浆膜腔等[van Furth R，Cohn ZA，Hirsch JG， et al.Bull word health organ，1972，46：845-852.]。根据巨噬细胞的功能，可将其分为M1型巨噬细胞(或称为经典活化的巨噬细胞)和M2型巨噬细胞(或旁路活化巨噬细胞)[Mantovani A，Sica A，Locati M，Immunity，2005，23：344-346.Martinez FO，Sica A，Mantovani A，et al.Front Biosci.2008，13：453-461.]。M1型巨噬细胞易受促炎信号刺激，比如Toll样受体配体和Th1细胞因子；M2型巨噬细胞主要由抗炎介质诱导，包括IL-10，TGF-β，糖皮质激素，免疫复合物，凋亡细胞等。M1型巨噬细胞主要在清除微生物、介导Th1免疫应答反应上发挥重要作用，M2型巨噬细胞主要参与Th2相关的免疫应答反应[Martinez FO，Helming L，Gordon S.Annu.Rev.Immunol.2009，27：451-483.Mantovani A，Sica A，Sozzani S，et al.Trends immunol.2004，25：677-686.]，并且发挥免疫调节作用。近些年，根据M2型巨噬细胞的基因表达和趋化因子进一步将其分为M2a，M2b，和M2c巨噬细胞。Th2型细胞因子IL-4和(或)IL-1 3可诱导巨噬细胞向M2a巨噬细胞分化，M2a巨噬细胞上调甘露醇受体的表达，分泌细胞外基质，也与某些寄生虫病相关；糖皮质激素、IL-1 0、TGF-β等抗炎刺激可刺激巨噬细胞分化为M2c巨噬细胞[Luca Cassetta，Edana Cassol，Guido Poli.Scientific World Journal.2011，11：2391-2402.EdwardsJP，Zhang X，Frauwirth KA，et al.J.Leukoc.Biol.2006，80：1298-1307.]。

巨噬细胞在Toll样受体的配体或IL-1R激动剂存在的情况下受到免疫复合物的刺激会形成M2b巨噬细胞，也有研究表明清除凋亡的中性粒细胞过程也会形成M2b巨噬细胞。这类巨噬细胞主要特征是分泌大量的IL-10，IL-6和TNF-α，几乎不分泌IL-12，一般把分泌IL-10与IL-12的差距作为鉴定M2b巨噬细胞的一个指标[Zhang W，Xu W，Xiong S.JImmunol，2010，184：6465-6478.Kobayashi M，Jeschke MG，Shigematsu K，et al.JImmunol，2010，185：7174-7179.Schiffer L，Bethunaickan R，Ramanujam M，et al.JImmunol，2008，180：1938-1947.]。越来越多的研究表明M2b巨噬细胞在免疫调节和Th2细胞分化方面发挥作用，所以也被称为“调节性巨噬细胞”[Mosser DM.Journal of leukocytebiology，2003，73：209-212.Stout RD，Suttles J.J.Leukoc.Biol，2004，76：509-513.]。但是这些不同亚型的巨噬细胞所表达的特异性表面标志还没有一个确切的定论，因为巨噬细胞的生物特征具有很大可塑性，不同微环境可明显改变其生物学功能，并分化为不同功能亚群[Svensson M，Kaye PM.Trends Immunol，2006，27：580-587.Stout RD，Jiang C，MattaB，et al.J Immunol，2005，175：342-349.]。目前基质细胞常被作模拟体内微环境，大部分基质细胞由间充质来源的细胞组成，如成纤维细胞、内皮细胞等等，可以诱导定向造血干细胞的分化[Wolber FM，Leonard E，Michael S，et al.Exp Hematol，2002，30：1010-1019.]。脾脏是一个重要的二级淋巴器官[Ni K，O'Neill H.BrJ Haematol，1999，105：58-67.]，研究已经证明脾基质细胞可以诱导骨髓中的DC或DC前体的增殖和分化，也可诱导造血干细胞和成熟DC分化为调节性DC[Zhang M，Tang H，Guo Z，et al.Nat Immunol，2004，5：1124-1133.Lacey DC，Achuthan A，Fleetwood AJ，et al.J Immunol，2012，188：5752-5765.]。然而脾脏基质细胞是否能够诱导调节性巨噬细胞的产生还不清楚。

发明内容

本发明公开了一种新的调节性巨噬细胞的诱导方法。该方法使用脾脏基质细胞诱导骨髓单个核细胞分化成为调节性巨噬细胞。该细胞具有高水平IL-10分泌和T细胞增殖抑制等特性。并且，该细胞有自己独特的细胞因子表达谱。

本发明通过上述的脾脏基质细胞与骨髓单个核细胞共培养，获得新型的调节性巨噬细胞，并对其表型进行鉴定。具体包括以下步骤：

1)内皮样脾基质细胞(ESSC)的获得和鉴定。

无菌分离1周龄C57BL/6J小鼠脾脏，用无菌剪刀剪至1-2mm大小的组织快，将其均匀地、牢固地贴于6孔板底部，随后加入20％RPMI-1640，所加入的液体量应少许，这样可使组织块不易脱落，次日再补20％RPMI-1640 1ml/孔，放入CO₂细胞培养箱，待孔底细胞饱和度达到80％-90％时，开始传代。刚开始仍用20％RPMI-1640传代，待传代4或5次后可更换成10％RPMI-1640。

ESSC通过形态学鉴定和表面Marker进行鉴定。形态学观察主要在光学倒置显微镜下进行。通过流式细胞术鉴定内皮细胞表面表达的特异性分子CD106来确定我们所分离出的ESSC是否为内皮型。细胞消化下来后用FACS洗液洗涤一遍，用100μl FACS洗液重悬，然后根据抗体说明书加Anti-PE CD106，而后用FACS Calibur流式细胞仪检测。

2)获取骨髓单个核细胞与ESSC共培养。

无菌分离4-6w的C57BL/6J小鼠的腿骨，用注射器冲洗并分离骨髓腔内的细胞，冲洗完毕后经过棉芯过滤，离心；而后，用含10％血清的1640培养基重悬待用。

之前将ESSC种六孔板。待ESSC饱和度达到50％时，将获取的骨髓单个核细胞以5×10⁶/10％RPMI-1640 4ml/孔种于ESSC上培养14天，培养期间每3-4天半定量换液，弃去一半旧培养液换成等量新培养液。培养14天后收集细胞，进行后续试验。

3)共培养细胞的特征鉴定

于ESSC共培养14天后，将细胞轻轻从ESSC上吹下，部分细胞甩片后进行吉姆萨染色确定形态；其余细胞分别进行表面标志分子染色和细胞因子表达谱测定。对于表面标志分子检测，将吹下的细胞用FACS洗液重悬，重悬后的细胞分别染F4/80、CD14、CD40、CD80、CD86、Ia、CD11b、CD11c、CD45RB、CD4、CD8和CD19，并进行流式检测。对于细胞因子表达谱使用ELISA的方法，吹下来的分化细胞收取后种于96孔板，1×10⁵/200μl 10％RPMI-1640/孔，用LPS 1μg/ml刺激24h收培养上清，检测细胞因子IL-6、TNF-α、IL1-β和IL-10的分泌。

4)分化的调节性巨噬细胞分泌高水平IL-10需要与ESSC直接接触。

ESSC传代到24孔板中，到50％饱和度时，分将骨髓单个核细胞于ESSC混合培养和分离培养。混合培养的情况下，可直接种骨髓单个核细胞到ESSC细胞上；分隔培养使用Transwell板，将骨髓单个核细胞种于Tanswell孔上，孔下为ESSC。培养14天后，分别取出分化的细胞，并且对每孔取出的细胞数进行计数。计数后分别种于96孔板，一部分孔用LPS 1μg/ml刺激24h收培养上清，检测IL-10分泌。

5)调节性巨噬细胞对T细胞增殖和凋亡的影响。

无菌获取6-8周龄C57BL/6J小鼠的脾脏，用免疫磁珠的方法纯化CD4⁺CD25^-T细胞。将这群细胞标记CFSE后与分化的巨噬细胞共培养，5天后收取培养上清用于检测细胞因子，收取细胞用于检测分化细胞对T细胞增殖和凋亡的影响。

附图说明

图1脾脏基质细胞形态与表面分子鉴定；

图2分化的调节性巨噬细胞形态和表面分子鉴定；

图3分化的调节性巨噬细胞的细胞因子表达。

图4与ESSC直接接触培养的分化调节性巨噬细胞数量更多，分泌IL-10能力更强。

图5调节性巨噬细胞在体外能够抑制CD4+T细胞的增殖，诱导CD4+T的凋亡。

实施例一内皮样脾基质细胞(ESSC)的培养传代和鉴定

一、材料和方法

1.材料

C57BL/6J小鼠，1周，雌性，购自并饲养于军事医学科学院实验动物中心，SPF级饲养。75％乙醇，生理盐水，RPMI-1640(购自Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，北京元亨金马生物技术开发有限公司)，0.25％胰酶，FACS洗液，mAnti-PE CD106(购自eBioscience)。小青瓶，试管，剪刀，镊子，滴管，移液器，离心机，流式细胞仪FACS Calibur(BD，美国)，CO₂细胞培养箱(Forma3111型，Thermo，美国)，光学倒置显微镜。

2.实验方法：

(1)ESSC的培养和传代：

无菌分离1周龄C57BL/6J小鼠脾脏，用无菌剪刀剪至1-2mm大小的组织快，将其均匀地、牢固地贴于6孔板底部，随后加入20％RPMI-1640，所加入的液体量应少许，这样可使组织块不易脱落，次日再补20％RPMI-1640 1ml/孔，放入CO₂细胞培养箱，待孔底细胞饱和度达到80％-90％时，开始传代。刚开始仍用20％RPMI-1640传代，待传代4或5次后可更换成10％RPMI-1640。

传代时，吸出旧培养液入小青瓶后，每孔加入2ml生理盐水洗涤，吸出生理盐水弃去，加入200μl0.25％胰酶消化，轻敲六孔板使细胞脱落，然后用旧培养液终止胰酶消化，吹下细胞，吸入试管，1200rpm离心4min，去上清，弹匀，向试管中加入新培养液9ml，混匀，取新六孔板，每孔1.5ml，放入CO₂细胞培养箱，待细胞饱和度达到80％-90％时，再进行传代。

(2)ESSC的鉴定

通过形态学鉴定和表面Marker鉴定两个方面。形态学观察主要在光学倒置显微镜下进行，并照相。另外通过鉴定内皮细胞表面表达的特异性分子CD106来鉴定所分离出的ESSC是否为内皮型。细胞消化下来后用FACS洗液洗涤一遍，用100μl FACS洗液重悬，然后根据抗体说明书加Anti-PE CD106，4℃避光孵育30min，期间每10min轻弹样品，使细胞与抗体充分混合，然后用FACS洗液洗涤，6000rpm离心30s，去上清，弹匀，加入1％多聚甲醛200μl固定，用FACSCalibur流式细胞仪检测。

二、实验结果

ESSC最初生长缓慢，但是传代3到4次后生长速度会加快，且经过长期培养已形成可稳定、长期传代的细胞。图1显示，在显微镜下，原代培养的脾脏基质细胞呈细长梭型，形态单一，贴壁生长。经过表面Marker的鉴定，图1显示，与阴性对照相比，ESSC可表达CD106，这说明我们所分离培养的ESSC是内皮型脾基质细胞。

实施例二ESSC与骨髓单个核细胞的共培养

一、材料和方法

1、材料

C57BL/6J小鼠，6-8周，雌性，购自并饲养于军事医学科学院实验动物中心，SPF级饲养。75％乙醇，生理盐水，RPMI-1640(购自Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，北京元亨金马生物技术开发有限公司)，0.25％胰酶，FACS洗液，mAnti-PE CD106(购自eBioscience)。小青瓶，试管，剪刀，镊子，滴管，移液器，离心机，2ml无菌注射器，流式细胞仪FACS Calibur(BD，美国)，CO₂细胞培养箱(Forma3111型，Thermo，美国)，光学倒置显微镜。

2、实验方法：

(1)骨髓单个核细胞的获取

取C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％乙醇中2-3分钟，取出后用纸擦去酒精，分离股骨，用剪刀将股骨两段剪去，使关节腔打通，用2ml无菌注射器吸取1ml生理盐水将关节腔的细胞冲入试管中，再吸取生理盐水重复冲洗几次。然后取两只小滴管进行过滤，一只滴管的棉花头推至中央，另一只滴管吸取试管中的骨髓细胞滴入第一只滴管，经过棉花处可起到过滤作用，滤进小青瓶中，用生理盐水20倍稀释计数。取5×10⁶细胞/EP管，6000rpm，30s离心，弹匀，去上清，用1ml 10％RPMI-1640重悬。

(2)骨髓单个核细胞和ESSC的混合培养及获取

待ESSC饱和度达到50％时，将获取的骨髓单个核细胞以5×10⁶/4ml 10％RPMI-1640/孔种于ESSC上培养14天，培养期间每3-4天半定量换液，弃去一半旧培养液换成等量新培养液。培养14天后收集细胞，吸出培养液剩余少量，敲打使细胞脱落，将剩余的培养液及细胞吸入试管，同时用显微镜观察细胞的分离情况，加少量生理盐水，继续敲打并吸出至试管，直至大部分细胞被收集后，2000rpm离心4min，去上清，弹匀，计数。

实施例三共培养后分化细胞的特征鉴定

一、材料和方法

1、材料

抗小鼠F4/80、CD14、CD40、CD80、CD86、Ia、CD11b、CD11c、CD45RB、CD4、CD8、CD19和同型对照抗体购自eBioscience。IL-6、IL-12、TNF-α ELISA试剂盒(购自eBioscience)，IL-10 ELISA试剂盒(购自达科为公司)，LPS(购自Sigma)。吉姆萨试剂。

2、实验方法：

(1)吉姆萨染色

取分化细胞2×10⁵/50μl 10％RPMI-1640用甩片机将细胞甩到载玻片上；待快晾干时，用甲醇固定10min；期间用PBS 1∶10稀释吉姆萨染液；从甲醇中取出后，待快晾干时，用100μl吉姆萨染色滴加到细胞上并覆盖，室温染30min；半小时后，倒去吉姆萨染液，待快晾干用清水轻轻冲洗，期间可用显微镜观察染色情况。

(2)ELISA

分化细胞收取后种于96孔板，1×10⁵/200μl 10％RPMI-1640/孔；一部分孔用LPS1μg/ml刺激24h收培养上清，冻存与-20℃，检测细胞因子分泌。

1∶250用ELISA包被液稀释小鼠IL-6capture antibody，50μl/孔，放入湿盒中4℃包被过夜；取出湿盒至室温，1∶5用双蒸水稀释5×Assay diluent，弃去包被液，PBST洗板条2次，每次静置1～2分钟弃去，加1×Assay diluent 100μl/孔，室温封闭1h；弃去封闭液，PBST洗板条1次，方法同前，加样和标准品50μl/孔，室温孵育2h；弃去样品及标准品，PBST洗板条5次，方法同前，1∶250用1×Assay diluent稀释小鼠IL-6 detection antibody 50μl/孔，室温孵育1h；弃去孔中液体，PBST洗板条5次，方法同前，1∶250用1×Assay diluent稀释小鼠IL-6Anti-HRP 50μl/孔，室温孵育30min；弃去弃去孔中液体，PBST洗板条7次，方法同前，加TMB 50μl/孔，5～15min，室温避光，待颜色变化恰当时加StopSolution 50μl/孔，上机检测OD450。IL-12、IL-1β、TNF-α的检测同IL-6，IL-10的检测参照IL-10ELISA试剂盒说明书。

(3)表面Marker鉴定

同CD106鉴定。

二、实验结果

图2显示：吉姆萨染色看出，肾形胞核位于细胞边缘，胞质丰富，是典型的巨噬细胞形态。流式检测表明，分化巨噬细胞低表达Ia和CD11c；高表达CD45RB和CD11b；几乎不表达共刺激分子CD40、CD86，CD80中等程度表达；不表达T、B细胞的表面标志CD4、CD8、CD19，表达巨噬细胞特异性标志F4/80、CD14。图3显示，ELISA实验表明，分化巨噬细胞在LPS刺激后，分泌大量的抑炎因子IL-10及炎性因子IL-6、TNF-α，几乎不表达IL-12。因此，脾脏ESSC可诱导骨髓单个核细胞分化出一群新的巨噬细胞，这群细胞呈现调节性巨噬细胞的特征。

实施例四分化细胞分泌IL-10需要与ESSC直接接触

一、材料和方法

1、材料：

Transwell培养板(购自康宁公司)。其余同实施例2.

2、方法：

ESSC传代到24孔板中，到50％饱和度时，分别种骨髓单个核细胞。混合培养的情况下，可直接种骨髓单个核细胞2×10⁵/700μl 10％RPMI-1640/孔，这样ESSC和骨髓单个核细胞可直接接触；用Tanswell分隔培养的细胞，将骨髓单个核细胞种于Tanswell孔上，2×10⁵/200μl 10％RPMI-1640/孔，孔下ESSC加500μl 10％RPMI-1640，其孔径不允许骨髓单个核细胞通过，起到分隔的作用，骨髓单个核细胞不能与ESSC直接接触。

培养14天后，分别取出分化的细胞，并且对每孔取出的细胞数进行计数。计数后分别种于96孔板，1×10⁵/200μl 10％RPMI-1640/孔；一部分孔用LPS 1μg/ml刺激24h收培养上清，冻存与-20℃，检测IL-10分泌。

二、实验结果

图4显示，用Transwell将ESSC与骨髓单个核细胞分开培养后所分化出的细胞数目会明显减少，并且在LPS刺激下，所分泌的IL-10也显著下降。这说明这群调节性巨噬细胞的分化以及高水平分泌IL-10依赖于与ESSC的直接接触。

实施例五分化细胞对T细胞的影响

一、材料和方法

1、材料：

C57BL/6J小鼠，6-8周，雌性，购自并饲养于军事医学科学院实验动物中心，SPF级饲养。CD4阴选试剂盒及CD25阳选试剂盒、分选柱(购自美天旎公司)，纯化buffer，BSA(购自Sigma)，红细胞裂解液，凋亡试剂盒(宝赛公司)，IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒(购自BD)，IL-17 ELISA试剂盒(购自eBioscience).Dynabeads mouse CD3/CD28 T cell expander(购自Invitrogen)，小鼠CD4-PE-Cy5抗体(购自eBioscience)。

2、方法：

(1)CD4⁺CD25^-T细胞的纯化

无菌分离6-8周龄C57BL/6J小鼠脾脏，制成脾脏单细胞悬液，加红细胞裂解液6000rpm、30s离心去上清，用生理盐水洗涤3遍，计数后取1/10⁷细胞于EP管，用100μl纯化buffer重悬，转移至试管中，加10μl CD4 Biotin-Antibody locktail混匀，4℃避光20min，每2min摇一次，然后加30μl纯化buffer和Anti-Biotin Beads 20μl，4℃避光20min，每3min摇一次。加8-9ml纯化buffer洗涤2000rpm、4min离心后500μl纯化buffer重悬，分选柱用预冷500μl纯化buffer洗涤一遍，然后上样并用500μl纯化buffer洗涤3次，收集未结合细胞，即为CD4⁺T细胞。然后用8-9ml纯化buffer 2000rpm、4min洗涤一遍后100μl纯化buffe重悬，加10μl CD25-PE混匀，4℃避光20min，每2min摇一次，然后用2ml纯化buffe 2000rpm、4min洗涤一遍，用90μl纯化buffe重悬，加Anti-PE Beads10μl，4℃避光20min，每3min摇一次。加8-9ml纯化buffer洗涤2000rpm、4min离心后500μl重悬，分选柱用预冷500μl纯化buffer洗涤一遍，然后上样并用500μl纯化buffer洗涤3次，收集未结合细胞即为CD4⁺CD25^-T细胞。

(2)CD4⁺T细胞标记CFSE

按照上述方法纯化出CD4⁺CD25^-T细胞后，取一部分导入EP管中，用生理盐水6000rpm、30s洗涤3遍；用500μl生理盐水重悬，加CFSE至终浓度为0.2μM，37℃孵育8min；然后加500μl血清37℃孵育10min；生理盐水6000rpm、30s洗涤3遍，用10％RPMI-1640重悬，以1×10⁵/100μl 10％RPMI-1640/孔种入96孔板，一部分与分化巨噬细胞共培养，5天后检测CFSE。

(3)CD4⁺CD25^-T细胞与分化细胞共培养

二者以1∶1的比例种入96孔板，即二者均种1×10⁵的细胞，用200μl 10％RPMI-1640进行培养5天，收取培养上清冻存于-20℃，用于检测细胞因子(方法详见例三)，收取细胞用于检测分化巨噬细胞对T细胞增殖和凋亡的影响。

(4)凋亡的检测

共培养5天后，收取细胞，先标记小鼠CD4(此方法详见例一)，然后用PBS洗涤一遍，6000rpm离心30s，用200μl Binding buffer重悬，根据说明书，加小鼠PI及Annexin V-FITC抗体，室温染色15min，上机检测。

二、实验结果

图5显示，根据CFSE跟踪标记CD4⁺CD25^-T细胞可以看出，与分化巨噬细胞共培养后，CFSE明显向左移动，说明分化巨噬细胞可以抑制T细胞的增殖；凋亡实验中，在分化巨噬细胞存在时，T细胞的早起凋亡比例几乎没有差异，但是晚凋比例要远远高于没有分化巨噬细胞存在时，说明分化的调节性巨噬细胞促进CD4+T细胞的晚期凋亡。

Claims (2)

1.一种新的诱导调节性巨噬细胞的方法，其特征在于，所述调节性巨噬细胞高表达IL-10，所述方法的具体步骤如下：

(1)获得原代培养的脾脏基质细胞；

(2)获得骨髓单个核细胞；

(3)将步骤(1)获得的脾脏基质细胞与步骤(2)获得的骨髓单个核细胞直接接触共培养14天；

(4)共培养后，通过进行细胞表面标志分子染色和细胞因子表达谱测定鉴定出调节性巨噬细胞。

2.权利要求1所述的诱导调节性巨噬细胞的方法，其特征在于，所述脾脏基质细胞是可以传代培养的。