CN105505874B - 一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法 - Google Patents

一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105505874B
CN105505874B CN201510980113.7A CN201510980113A CN105505874B CN 105505874 B CN105505874 B CN 105505874B CN 201510980113 A CN201510980113 A CN 201510980113A CN 105505874 B CN105505874 B CN 105505874B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
macrophage
modulability
derived
cord blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510980113.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105505874A (zh
Inventor
王维
马小倩
王佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN201510980113.7A priority Critical patent/CN105505874B/zh
Publication of CN105505874A publication Critical patent/CN105505874A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105505874B publication Critical patent/CN105505874B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Abstract

本发明提供了一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法。用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞，通过CD14+免疫磁珠阳性分离获得富含调节性巨噬细胞的CD14+胞群。将成体外周血来源的调节性巨噬细胞与人脐血来源的调节性巨噬细胞在形态、产量、表型、功能等方面作对比。发现脐血来源的调节性巨噬细胞表型与成体外周血来源的调节性巨噬细胞类似，功能优于外周血来源的调节性巨噬细胞，因此可以建立在临床上供第三方使用的调节性巨噬细胞库。

Description

一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法
技术领域
本发明涉及调节性巨噬细胞的来源、分离纯化及培养的技术领域。具体涉及一种利用人脐带血诱导培养得到的具有免疫抑制能力的调节性巨噬细胞，及其分离纯化和培养方法。
背景技术
尽管现在已有广谱的免疫抑制剂用于阻止急性移植后器官排斥的发生，但是终生使用免疫抑制药物，将引起的众多不良副反应，如肾毒性，代谢紊乱，心血管疾病以及导致感染或者肿瘤发生风险增加。因此寻找合适的长效免疫抑制方法仍然是现在的研究热点。调节性巨噬细胞是近年来研究发现的一组高度分化具有高效抑制T细胞应答潜能的巨噬细胞亚群，它能够用于预防和治疗免疫排斥，目前已经在临床实验上开展，在器官移植后诱导移植物免疫耐受。调节性巨噬细胞是从外周血中CD14+单核细胞诱导而来，在特殊培养基中培养6天后加入γ干扰素刺激24小时，分化后的调节性巨噬细胞具有均一性表型为CD14-/low HLADR+CD80-/low CD86+CD16-，能够通过直接接触吞噬T细胞，或者增强吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)表达剥夺色氨酸，间接抑制T细胞的增值(Hutchinson JA,Riquelme P,Sawitzki B,et al.Cutting edge:immunologicalconsequences and trafficking ofhuman regulatory macrophages administeredto renal transplant recipients.JImmunol 2011；187:2072–2078)。在欧洲多中心合作的One Study临床研究中，已经开始在肾移植后使用供体来源的调节性巨噬细胞，经过一年多的追踪随访，认为其在肾移植上的使用是安全及有效的(James A.Hutchinson,Paloma Riquelme,and EdwardK.Geissler.Human regulatory macrophages as a cell-based medicinalproduct.Curr Opin Organ Transplant2012；17:48-54)。因此在临床应用中，使用调节性巨噬细胞将成为一种很有潜力的预防移植后免疫排斥的干预措施。
但是供体来源的调节性巨噬细胞必须在供体经过外周血动员后培养7天才能得到足够移植的量，而如果使用DCD供体来源的器官，则较难得到这种免疫调节细胞，这使其在移植免疫上的应用大大受到限制。脐血内含有丰富的造血干/祖细胞，自上世纪90年代以来，脐血干细胞移植技术在全世界得到快速发展，世界各国脐血库应运而生，将原本自然流失的脐带血，经分离检测深低温保存，以备临床应用。现在已有多种细胞可以从脐血中获得，如间充质干细胞，调节性T细胞等。从脐血中获得的细胞因其来源广泛、无创伤性、并且免疫原性低，十分适合在临床使用。如人脐血来源的调节性T细胞就比从外周血来源调节性T细胞的在第三方移植受体中存活时间更长，发挥的功能更加强大。因此，如果我们能够从脐血中分离并诱导得到调节性巨噬细胞，并确定纯度和功能，将大大有助于其在临床上的使用。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种具有良好的免疫抑制能力的人脐血来源的调节性巨噬细胞，并建立一种稳定的从人脐血中分离获取以及培养该种调节性巨噬细胞的方法。本发明确立了人脐血来源的调节性巨噬细胞在产量、纯度、功能等方面相对于常规来源于成体外周血的调节性巨噬细胞存在一定优势。
一种人脐血来源的调节性巨噬细胞。
所述的人脐血来源的调节性巨噬细胞的分离纯化方法，用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞，通过CD14+免疫磁珠阳性分离获得富含调节性巨噬细胞的CD14+胞群。
具体包括以下步骤：
1)脐血单核细胞分离：以10ml人淋巴细胞分离液置于50ml离心管下层，然后收集抗凝脐带血用PBS1:1稀释后得到的40ml血细胞悬液轻柔加在上层，两层之间有明显界限，20℃，1800-2000rpm离心30分钟，吸取中间云雾层获得单个核细胞，PBS洗涤2次后计数；
2)CD14+阳选：
(1)收集步骤1)得到的细胞，然后用分选缓冲液Sorting buffer以1.25×105个cells/ul重悬，每106个细胞加入2μl的CD14 MicroBeads微磁珠，4℃孵育10-15分钟；
(2)以每106个细胞加入0.2-0.3mlSorting Buffer终止微磁珠与细胞的结合，1200rpm离心10分钟，每108个细胞用500μl的Sorting Buffer重悬待用；
(3)选择LS分离柱，将分离柱安装入磁场中，每次加入1ml Sorting Buffer缓冲液洗柱，洗3次，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；
(4)将细胞悬液加入分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出分离柱的液体，此时流出来的细胞为CD14-细胞；
(5)将LS分离柱移出磁场，在分离柱下接无菌离心管，往分离柱中加入5mlSorting Buffer缓冲液，用活塞将附在分离柱上的细胞压入离心管中，继续往分离柱中加入5ml Sorting Buffer缓冲液重复该步骤一遍，计数细胞后1200rpm离心10分钟，得到的细胞为CD14+细胞；
(6)将步骤(5)得到的细胞以每108个细胞用500μl的Sorting Buffer重悬；重复操作步骤(3)—(5)一次；
(7)分离CD14+细胞用PBS洗涤2次后待培养。
所述的人脐血来源的调节性巨噬细胞的培养方法，包括以下步骤：
1)用新鲜配制的调节性巨噬细胞培养基重悬细胞浓度为106个cells/3-5ml，放入促进细胞贴壁的培养皿中37℃，5％CO2培养，隔天换液；所述的调节性巨噬细胞培养基是在RPMI-1640培养中添加10-12％的人AB血清、5-10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子M-CSF、1％青霉素和链霉素双抗；
2)培养至第6天时加入终浓度为25-50ng/ml的干扰素IFN-γ刺激18–24小时；
3)培养至第7天，获得调节性巨噬细胞。
本发明的优点在于：确定了脐血来源的调节性巨噬细胞的分离诱导纯化以及培养方法，通过将成体外周血来源的调节性巨噬细胞与其在形态、产量、表型、功能等方面作对比。发现脐血来源的调节性巨噬细胞表型与成体外周血来源的调节性巨噬细胞类似，功能优于外周血来源的调节性巨噬细胞，因此可以建立在临床上供第三方使用的调节性巨噬细胞库。
附图说明
图1为两种不同来源调节性巨噬细胞显微镜下形态，放大倍数；
外周血来源(左)及本发明的调节性巨噬细胞(右)细胞形态放大倍数(100X)；
图2为外周血来源及本发明脐血来源的调节性巨噬细胞在单个核细胞中分选诱导后的得率；
图3为流式细胞术检测成体外周血来源及本发明脐血来源的调节性巨噬细胞表型；
图4脐血来源调节性巨噬细胞抑制效应细胞的效果；
图5外周血来源及本发明脐血来源的调节性巨噬细胞对淋巴细胞抑制效果的比较分析。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
在以下实施例中，获取30例正常分娩足月胎儿的脐静脉血,结扎剪断脐带后立即进行脐静脉穿刺采血，肝素抗凝。该实验得到了中南大学湘雅三医院伦理委员会的批准。进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计和实施。
如无特殊说明，细胞培养用的培养基和营养因子均购自Life technology和Sigma等全球各大生物试剂公司。所述荧光标记的鼠抗人抗体购自美国eBiosciense或BD公司；Ficoll-Plus人淋巴细胞分离液购自GE生物公司,FC500流式细胞仪为美国贝克曼-库尔特公司，分选CD14+细胞的磁珠选用MACS Milteny Biotec公司的CD14+Microbeads(human)磁珠分离试剂盒。
材料：磷酸缓冲液PBS、人血白蛋白、CPD-A(含腺嘌呤的柠檬酸-磷酸-葡萄糖溶液，购于Sigma公司)、CD14 MicroBeads微磁珠(取自MACS Milteny Biotec公司的CD14+Microbeads(human)磁珠分离试剂盒)、TrypLE ExpressTM酶、BSA(牛血清白蛋白)、NaN3、FcR-block(Fc受体封闭剂)、IFN-γ(γ干扰素)、RPMI-1640培养基、人AB血清、M-CSF巨细胞集落刺激因子、青霉素和链霉素(双抗)、Ficoll-Plus人淋巴细胞分离液；
Sorting buffer分选缓冲液(PBS中含有10-12％CPD-A和0.5％人血白蛋白)
培养基(RPMI-1640培养基中添加10-12％人AB血清、5-10ng/mlM-CSF、1％双抗)
Staining buffer染色缓冲液(PBS中含有1-2％BSA+0.1％NaN3)
实施例1.人脐血调节性巨噬细胞细胞分离、纯化
1、人脐血单核细胞(CBMC)分离。收集抗凝血用PBS1:1稀释，以10ml人淋巴细胞分离液置于50ml离心管下层，40ml血细胞悬液轻柔加在上层，两层之间有明显界限，20℃，1800-2000rpm离心30分钟，吸取中间云雾层获得单个核细胞，PBS洗涤2次后计数。
2、CD14+阳选。(1)收集细胞用Sorting buffer以1.25×105个cells/ul重悬，每106个细胞加入2μl的CD14 MicroBeads(取自MACS Milteny Biotec公司的CD14+Microbeads(human)磁珠分离试剂盒)，4℃孵育10-15分钟。(2)以每106个细胞加入0.2-0.3mlSortingbuffer终止微磁珠与细胞的结合，1200rpm离心10分钟，每108个细胞用500μl的SortingBuffer重悬待用。(3)依据细胞数量的多少选择合适的分离柱(以LS柱为例)，将分离柱安装入磁场中，每次加入1mlSorting Buffer缓冲液，3次洗柱，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱。(4)将细胞悬液加入分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出分离柱的液体，此时流出来的细胞为CD14-细胞。(5)将LS分离柱移出磁场，在分离柱下接无菌离心管，往分离柱中加入5ml Sorting Buffer缓冲液，用活塞将附在分离柱上的细胞压入离心管中。重复该步骤一遍，计数细胞后1200rpm离心10分钟，得到的细胞为CD14+细胞。(6)为获得较高纯度的细胞，将得到的CD4+细胞重悬后再过一次分离柱，重复步骤(3)—(5)。
(7)分离CD14+细胞用PBS洗涤2次后待培养。
实验结果：
实施例2.脐血调节性巨噬细胞培养
1、用新鲜配制的调节性巨噬细胞培养基重悬细胞浓度为106个cells/3-5ml，放入促贴的培养皿中37℃，5％CO2培养，隔天换液。培养基(RPMI-1640培养基中添加10-12％人AB血清、5-10ng/mlM-CSF、1％双抗)
2、培养至第6天时加入终浓度为25-50ng/ml的IFN-γ刺激18–24小时。
3、培养至第7天，可获得调节性巨噬细胞。
实施例3.流式细胞术检测脐带血调节性巨噬细胞细胞表型
1、收集培养7天后的细胞。用PBS洗涤3次，按照1ml/25cm2的浓度加入TrypLEExpressTM37℃消化10分钟后用枪头小心刮下细胞，1200rpm离心10分钟收集细胞。
2、免疫荧光染色。收集的细胞用冷的staining buffer洗涤2次后用含有10％FcR-block的staining buffer以10×106个cells/ml的浓度重悬，冰浴封闭20-30分钟。以2×105个细胞/100μl分装到流式管中，加入CD14、CD80、CD86、CD11b、CD83、HLA-DR各2-5ul，充分混匀，4℃避光孵育60分钟，再用冷的staining buffer洗涤3次，500×g离心5min弃上清，400ul staining buffer重悬准备上机。
3、流式细胞术检测细胞表型。采用FC500流式细胞仪进行检测，结果分析应用CellQuest软件。
实验结果：从脐血和成体外周血中分离的单核细胞，在体外经过诱导培养7天后，得到的调节性巨噬细胞均具有较典型的长梭形形态。经过多次分离诱导培养，发现外周血来源的调节性巨噬细胞得率为4.39％±0.45％，脐血来源的调节性巨噬细胞得率为4.71％±0.46％(p<0.05)。流式细胞术检测表型，发现两种来源的调节性巨噬细胞均具有典型的CD14-/low HLADR+CD80-/low CD86+的调节性巨噬细胞表型。
实施例4.脐血调节性巨噬细胞的淋巴细胞混合实验
成体第三方的CD14-细胞作为效应细胞，细胞悬液用CellTraceTMCFSE CellProliferation Kit处理，培养液洗涤3次后用培养液配制细胞悬液作为效应细胞(2×106个/ml，1×105个/孔)，CD3+CD28+的微磁珠作为刺激抗原，取脐血和成体外周血的调节性巨噬细胞与效应细胞以不同比例进行共培养(2×106个/ml，Mreg：Responder＝1:32，1:16，1:8，1:4，1:2，1:1)，加入96孔培养板，加入刺激抗原，培养体系总体积250μl/孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，以及与成体外周血调节性巨噬细胞同一来源的CD14-效应细胞作为自体反应的对照组，均设三复孔。37℃、5％CO2培养5天，收集细胞后采用FC500流式细胞仪进行检测分析。
实验结果：脐血来源的调节性巨噬细胞在混合淋巴实验中表现出非常好的抑制淋巴细胞增殖的效果，在没有刺激物的情况下，调节性巨噬细胞不会影响效应细胞的数量，但是在效应细胞发生刺激增殖时，调节性巨噬细胞能够显著抑制或杀伤效应细胞。在与成体人外周血来源的调节性巨噬细胞的功能比较过程中，脐带血来源的巨噬细胞在抑制第三方淋巴细胞增殖方面效果更好，其效果在调节性巨噬细胞与效应细胞比例在1：4时表现更为明显。

Claims (3)

1.一种人脐血来源的调节性巨噬细胞的分离纯化方法，其特征在于，用密度梯度离心法分离得到脐血单个核细胞，通过CD14+免疫磁珠阳性分离获得CD14+单核细胞；分离的单核细胞，在体外经过诱导培养7天后，得到调节性巨噬细胞；
所述的人脐血来源的调节性巨噬细胞的培养方法，包括以下步骤：
A. 重悬分离的单核细胞，细胞浓度为106个cells/3-5 ml，放入促进细胞贴壁的培养皿中37℃，5% CO2培养，隔天换液；所述的调节性巨噬细胞培养基是在RPMI-1640培养中添加10-12%的人AB血清、5-10 ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子M-CSF、1%青霉素和链霉素双抗；
B.培养至第6天时加入终浓度为25-50 ng/ml的干扰素IFN-γ刺激18–24小时；
C.培养至第7天，获得调节性巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的人脐血来源的调节性巨噬细胞的分离纯化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）脐血单核细胞分离：以10ml人淋巴细胞分离液置于50ml离心管下层，然后收集抗凝脐带血用PBS1:1稀释后得到的40ml血细胞悬液轻柔加在上层，两层之间有明显界限，20℃，1800-2000rpm离心30分钟，吸取中间云雾层获得单个核细胞，PBS洗涤2次后计数；
2）CD14+阳选：
（1）收集步骤1）得到的细胞，然后用分选缓冲液Sorting buffer以1.25×105个cells/μl 重悬，每106个细胞加入2μl的CD14 MicroBeads微磁珠，4℃孵育10-15分钟；
（2）以每106个细胞加入0.2-0.3ml Sorting Buffer终止微磁珠与细胞的结合，1200rpm离心10分钟，每108个细胞用500μl的Sorting Buffer重悬待用；
（3）选择LS分离柱，将分离柱安装入磁场中，每次加入1ml Sorting Buffer缓冲液洗柱，洗3次，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；
（4）将细胞悬液加入分离柱中，在重力作用下自然流尽，收集流出分离柱的液体，此时流出来的细胞为CD14-细胞；
（5）将LS分离柱移出磁场，在分离柱下接无菌离心管，往分离柱中加入5ml SortingBuffer缓冲液，用活塞将附在分离柱上的细胞压入离心管中，继续往分离柱中加入5mlSorting Buffer缓冲液重复该步骤一遍，计数细胞后1200rpm离心10分钟，得到的细胞为CD14+细胞；
（6）将步骤（5）得到的细胞以每108个细胞用500μl的Sorting Buffer重悬；重复操作步骤（3）—（5）一次；
（7）分离的CD14+细胞用PBS洗涤2次后待培养。
3.一种权利要求1或2所述的分离纯化方法获得的人脐血来源的调节性巨噬细胞。
CN201510980113.7A 2015-12-23 2015-12-23 一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法 Active CN105505874B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510980113.7A CN105505874B (zh) 2015-12-23 2015-12-23 一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510980113.7A CN105505874B (zh) 2015-12-23 2015-12-23 一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105505874A CN105505874A (zh) 2016-04-20
CN105505874B true CN105505874B (zh) 2019-06-21

Family

ID=55714170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510980113.7A Active CN105505874B (zh) 2015-12-23 2015-12-23 一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105505874B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3456819A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-20 Trizell GmbH Regulatory macrophages for the treatment of angopathies
CN115305237B (zh) * 2022-07-08 2023-07-14 中南大学 一种优化的调节性t细胞的扩增及规模化生产的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10324011B2 (en) * 2013-03-15 2019-06-18 The Trustees Of Princeton University Methods and devices for high throughput purification
CN104342404B (zh) * 2013-08-09 2017-11-14 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种获得调节性巨噬细胞的新方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Regulation of hepatic endothelial cell and macrophage proliferation and nitric oxide production by GM-CSF, M-CSF, and IL-1β following acute ecdotoxemia;Lisa S. Feder et al.;《Journal of Leukocyte Biology》;19940430;第55卷;摘要、表3
人外周血巨噬细胞培养及功能鉴定;林炜明 等;《中国免疫学杂志》;20150130;第31卷;摘要、第1.2-1.4节
人脐带血来源树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞体外培养及鉴定;陈琛 等;《免疫学杂志》;20110630;第27卷(第6期);摘要、第1.2-1.4节

Also Published As

Publication number Publication date
CN105505874A (zh) 2016-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mareschi et al. Multipotent mesenchymal stromal stem cell expansion by plating whole bone marrow at a low cellular density: a more advantageous method for clinical use
Hutchinson et al. Human regulatory macrophages
CN109652369B (zh) 利用外周血体外制备成熟红细胞的方法及制剂
CN107349219B (zh) 调节性t细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用、及其扩培液和扩培方法
Zuba‐Surma et al. Overview of very small embryonic‐like stem cells (VSELs) and methodology of their identification and isolation by flow cytometric methods
CN104877965B (zh) 一种制备成熟红细胞的方法
CN103710306A (zh) 一种分离纯化小胶质细胞的方法
CN103436493A (zh) 雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法
CN104357389A (zh) 一种改良的人脐血来源调节性t细胞扩增培养基及其使用方法
JPWO2020045368A1 (ja) 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法
Stent et al. Heterogeneity of freshly isolated human tonsil dendritic cells demonstrated by intracellular markers, phagocytosis, and membrane dye transfer
CN111235209A (zh) 一种评估干细胞免疫调控功能的方法
CN105505874B (zh) 一种人脐血来源的调节性巨噬细胞及其分离纯化和培养方法
CN112608896A (zh) 一种nk细胞的培养方法及其应用
CN107164324B (zh) 一种脐血Treg细胞的体外扩增方法
Bosio et al. Isolation and enrichment of stem cells
CN113564117B (zh) 一种冻存脐带血来源调节性t细胞体外扩增优化方法
Kos et al. Flow cytometry-based isolation of tumor-associated regulatory T cells and assessment of their suppressive potential
El-Sahrigy et al. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial
CN104109653B (zh) 利用无动物血清培养体系大规模扩增人外周血dnt细胞的方法
US20170038394A1 (en) Method for the identification of cd4+ regulatory t-cells for use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
Lazarski et al. Flow-based analysis of cell division identifies highly active populations within plasma products during mixed lymphocyte cultures
Chesneau et al. New method for the expansion of highly purified human regulatory granzyme B-expressing B cells
CN113481157A (zh) 特异性抗病毒过继免疫细胞的优化制备方法
Song et al. Culture and identification of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wang Wei

Inventor after: Ma Xiaoqian

Inventor after: Wang Guiqiang

Inventor after: Wang Jia

Inventor before: Wang Wei

Inventor before: Ma Xiaoqian

Inventor before: Wang Jia