CN107349219B - 调节性t细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用、及其扩培液和扩培方法 - Google Patents

调节性t细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用、及其扩培液和扩培方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用、及其扩培液和扩培方法。调节性T细胞的扩培液按体积份数比计包括35.274～42.69份无血清培养液、1.25～2.5份4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5～1份青霉素‑链霉素溶液、0.5～1份L‑谷氨酰胺、0.05～0.1份2‑巯基乙醇、0.00769～0.01154份重组白介素‑2、0.001～0.01份雷帕霉素和5～10份AB血清。上述调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用，通过对自身免疫糖尿病发病机制和调节性T细胞的针对性研究，申请人发现将调节性T细胞在治疗自身免疫糖尿病方面具有较好的疗效。

Description

调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用、及其扩培 液和扩培方法
技术领域
本发明涉及细胞治疗领域，特别地，涉及一种调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用。此外，本发明还涉及一种包括上述调节性T细胞的扩培液及扩培方法。
背景技术
自身免疫糖尿病(ADM)是一种主要由T细胞介导，多途径、多种免疫细胞参与的自身免疫疾病。将ADM的发病机制作为治疗靶点，改善机体的自身免疫状态，是从根本上治愈ADM的理想治疗方法。调节性T细胞(regμlatory T cell,Treg)是一群具有免疫调节功能的免疫细胞亚群，它具有阻遏自身免疫性细胞增殖(CD4+CD25-T)的能力，主要在免疫系统的反馈调节中发挥抑制作用。调节性T细胞治疗(Treg)能够使免疫系统重新达到平衡，阻止自身免疫反应对胰岛的进一步损伤，保护胰岛β细胞及其功能，改善甚至逆转病情。由于患者本身的Treg细胞功能存在缺陷，寻找可用于治疗ADM的调节性T细胞迫在眉睫。越来越多的研究表明脐血中富含调节性T细胞，因其具未受抗原激活多为
Figure BDA0001360112920000011
T细胞，体外扩增后的Treg细胞功能良好且免疫原性低，因而为ADM的免疫治疗带来了新希望。目前通过应用脐血Treg细胞来治疗ADM的临床试验在全球尚属空白。调节性T细胞可从脐血中提取，提取后扩增用后再进行应用。目前的调节性T细胞扩增方法，都存在实验室处理阶段，无法大规模推广应用。
发明内容
本发明提供了一种调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用、及其扩培液和扩培方法，以解决治疗免疫糖尿病药物的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面公开了一种调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用。
本发明另一方面公开了一种调节性T细胞的扩培液，对调节性T细胞进行扩增培养以在制备治疗免疫糖尿病药物中应用，调节性T细胞的扩培液按体积份数比计包括35.274～42.69份无血清培养液、1.25～2.5份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5～1份青霉素-链霉素溶液、0.5～1份L-谷氨酰胺、0.05～0.1份2-巯基乙醇、0.00769～0.01154份重组白介素-2、0.001～0.01份雷帕霉素和5～10份AB血清。
进一步地，调节性T细胞的扩培液按体积份数比计包括42.69份无血清培养液、1.25份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5份青霉素-链霉素溶液、0.5份L-谷氨酰胺、0.05份2-巯基乙醇、0.01154份重组白介素-2、0.001份雷帕霉素和5份AB血清。
本发明还公开了一种调节性T细胞的扩培方法，包括以下步骤：
将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合。
在带有磁珠的调节性T细胞中加入上述的扩培液。初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养14～21天。
进一步地，将带有磁珠的调节性T细胞按照每孔2～8×105/ml的浓度加入48孔板中，每孔加入0.5毫升扩培液进行培养，初始培养和继代培养过程均在36～38℃，4～6％的CO2条件下进行。
种板后第1～2天后，每孔细胞增加0.5ml～1ml扩培液，同时添加100～400U/ml的rhIL-2后培养。
进一步地，继代培养时，吸除孔内0.5ml的培养液，将剩余的培养液混匀细胞，每1孔传2孔，同时每孔补加培养液至1ml，在进行第3次传代培养时，除去CD3/CD28磁珠，再按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1的比例添加新的CD3/CD28磁珠。
进一步地，将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合的步骤包括：
将CD3/CD28磁珠与调节性T细胞按1～3:1的比例加入无血清培养液中，并在磁性环境中静置后，吸除液体。
进一步地，调节性T细胞通过提取方式获取，提取方法包括以下步骤：
从脐带血中分离得到外周血单个核细胞层，并用红细胞裂解液除去其中的红细胞，清洗、计数。
离心除去上清液，冻存，复苏并计数，将其与CD25磁珠结合，磁性分选得到CD4+CD25+T细胞，即调节性T细胞。
进一步地，冻存步骤所用冻存液包括10％体积百分数的DMSO和90％体积百分数的脐血自体血浆。
本发明具有以下有益效果：上述调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用，通过对自身免疫糖尿病发病机制和调节性T细胞的针对性研究，申请人发现将调节性T细胞在治疗自身免疫糖尿病方面具有较好的疗效，在临床试验中，目前已成功治疗自身免疫糖尿病患者4例，目前的随访结果提示该治疗方法是安全的。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的扩增后的脐血调节性T细胞扩增后的表型检测图；图1A为脐血调节性T细胞的表型检测图；图1B为CD4+CD25+细胞占总细胞的表型检测图；图1C为CD4+CD25+FoxP3+三阳细胞占总细胞的表型检测图；
图2是本发明优选实施例的扩增后的脐血调节性T细胞对糖尿病攻击性T细胞(CD4+CD25-)的抑制作用图；图2A为阳性对照组的抑制作用图；图2B为阴性对照组的抑制作用图；图2C为CD25-T细胞：调节性T细胞＝1:1组的抑制作用图；图2D为CD25-T细胞：调节性T细胞＝2:1组的抑制作用图；图2E为CD25-T细胞：调节性T细胞＝4:1组的抑制作用图；
图3是脐血调节性T细胞在不同的扩培液中的生长状况；图3A为脐血调节性T细胞在本申请的扩培液中的生长情况；图3B为脐血调节性T细胞在未加入AB血清的扩培液中的生长情况；
图4是脐血调节性T细胞在不同的孔板中的生长状况；图4A为脐血调节性T细胞在24孔板中的生长情况；图4B为脐血调节性T细胞在48孔板中的生长情况。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明的优选实施例提供了一种调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：上述调节性T细胞在制备治疗免疫糖尿病药物中的应用，通过对自身免疫糖尿病发病机制和调节性T细胞的针对性研究，申请人发现将调节性T细胞在治疗自身免疫糖尿病方面具有较好的疗效，在临床试验中，目前已成功治疗自身免疫糖尿病患者4例，目前的随访结果提示该治疗方法是安全的。
本发明另一方面公开了一种调节性T细胞的扩培液，对调节性T细胞进行扩增培养以在制备治疗免疫糖尿病药物中应用，调节性T细胞的扩培液按体积份数比计包括35.274～42.69份无血清培养液、1.25～2.5份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5～1份青霉素-链霉素溶液、0.5～1份L-谷氨酰胺、0.05～0.1份2-巯基乙醇、0.00769～0.01154份重组白介素-2、0.001～0.01份雷帕霉素和5～10份AB血清。
无血清培养液可以是Lonza公司的X-VIVO 15w/o Gent or Phenol Red，货号04-744Q。4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液可以是Hyclone公司的Hepes缓冲液，货号SH3023701。青霉素-链霉素溶液可以是Gibco公司的PENICILLIN STREPTOMYCIN，15140122。L-谷氨酰胺可以是sigma公司的L-Glutamine solution，货号G7513-100ML。2-巯基乙醇可以是Millipore公司的1000X 2-Mercaptoethanol，货号ES-007-E。重组白介素-2可以是R&D公司的rhrhIL-2，货号202-IL-010。雷帕霉素可以是sigma公司的rapamycin，货号R8781-200UL。当然其他公司生产的相同产品同样可以使用。AB血清是美国Gemini公司的，货号100-512。
调节性T细胞的扩培液按体积份数比计，各组分以体积的方式计量加入，具体加入的量以体积份数为标准，体积份数即为各组分的体积比。调节性T细胞的扩培液包括无血清培养液70.54％-85.27％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液2.5％-5％、青霉素-链霉素溶液1％-2％、L-谷氨酰胺1％-2％、50-100umol/L2-巯基乙醇、200-400U/ml重组白介素-2、50-200nmol/L雷帕霉素、AB血清10％-20％。
上述扩培液视具体使用情况，配置方法稍有不同，如调节性T细胞刚种板时，扩培液可预先将各组分完全混合好之后配制之间加入孔板内。在继代培养时，扩培液可将除重组白介素-2外的组分混合的预混液加入，再加重组白介素-2。由于继代培养时每孔的重组白介素-2基本消耗完，因此在其每孔传2孔，每孔补入预混液，如每孔补入0.5ml预混液至每孔的溶液1ml。此时需按1ml扩培液的量加入相应的重组白介素-2。
在扩培养液中增加AB血清后，明显促进脐血调节性T细胞的增殖能力，在脐血调节性T细胞扩增2-3周后，有血清组脐血调节性T细胞扩增后的数目较无血清组更好，细胞状态更佳。
可选地，调节性T细胞的扩培液按体积份数比计包括42.69份无血清培养液、1.25份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5份青霉素-链霉素溶液、0.5份L-谷氨酰胺、0.05份2-巯基乙醇、0.01154份重组白介素-2、0.001份雷帕霉素和5份AB血清。
本发明还公开了一种调节性T细胞的扩培方法，包括以下步骤：
将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合。
在带有磁珠的调节性T细胞中加入上述的扩培液。初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养14～21天。
可按照一般的常规方法将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合，得到带有磁珠的调节性T细胞。加入扩培液在孔板在培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养14～21天。继代培养的天数可根据细胞的状态进行调整，如细胞状态好，繁殖速度快可缩短培养时间，反之，则可选择延长培养时间。
可选地，将带有磁珠的调节性T细胞按照每孔2～8×105/ml的浓度加入48孔板中，每孔加入0.5毫升扩培液进行初始培养，初始培养和继代培养过程均在36～38℃，4～6％的CO2条件下进行。
种板后第1～2天后，每孔细胞增加0.5ml～1ml扩培液，同时添加100～400U/ml的rhIL-2后培养。
如图4A和4B，结果提示脐血调节性T细胞在48孔板中的生长情况明显优于24孔板中的生长情况，可能原因48孔底部面积较24孔底部面积小，在种植同样数目下，48孔中的细胞的密度更高；另外在换液时48孔的半径较24孔半径小，在同样体积情况下，48孔中液体位置更高，在换液吸除一半液体时，丢失的细胞会更少。
可选地，继代培养时，吸除孔内0.5ml的培养液，将剩余的培养液混匀细胞，每1孔传2孔，同时每孔补加培养液至1ml，在进行第3次传代培养时，除去CD3/CD28磁珠，再按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1的比例添加新的CD3/CD28磁珠。
可选地，将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合的步骤包括：
将CD3/CD28磁珠与调节性T细胞按1～3:1的比例加入无血清培养液中，并在磁性环境中静置后，吸除液体。
可选地，调节性T细胞通过提取方式获取，提取方法包括以下步骤：
从脐带血中分离得到外周血单个核细胞层，并用红细胞裂解液除去其中的红细胞，清洗、计数。
离心除去上清液，冻存，复苏并计数，将其与CD25磁珠结合，磁性分选得到CD4+CD25+T细胞，即调节性T细胞。
可选地，冻存步骤所用冻存液包括10％体积百分数的DMSO和90％体积百分数的脐血自体血浆。
为便于理解，下面详细描述整个应用过程，可以理解的是，下述调节性T细胞制备、扩增等步骤并非调节性T细胞获取的唯一方式。
一、脐血调节性T细胞制备
1、对脐血袋进行消毒，制备脐血自体血浆：将脐血袋中的脐血转移至50ml离心管中进行离心：离心条件：20℃，3000rpm，10min，+8，-9。取上清转移至新50ml离心管中进行第二次离心：离心条件：20℃，4000rpm，10min，+8，-9，吸取黄色澄清的血浆，56℃水浴灭活30分钟后放置冰箱备用。用与吸出血浆等体积的生理盐水重悬脐血。
2、将生理盐水重悬的脐血缓慢加至淋巴细胞分离液(脐血体积：淋巴细胞分离液体积＝1:1)离心，离心条件：20℃，*400rcf-*1610rcf，25min，+0，-0。离心结束后，脐血分层，用吸管吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，动作缓慢轻柔，尽可能少吸取淋巴细胞液。
3、将PBMC层继续离心，离心条件：20℃，*580rcf，10min，+8，-9。取5ml-10ml 10×红细胞裂解液及45ml灭菌用水配置红裂液。在离心完成后，去上清液，加入红裂液2～10分钟后，加入了0.9％生理盐水至35ml定容终止红裂。离心，去除上清，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。重复加入0.9％生理盐水定容，离心，去除上清的步骤2～3次。
4、离心完成后，去上清液，弹散细胞，加入0.9％的生理盐水，取10μl进行计数。剩余的加0.9％生理盐水至40ml定容再次离心，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。其中计数步骤具体为：将所取细胞液置于EP管内，取90μl台盼蓝加于EP管内混匀。取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/ml*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右。
5、离心完成后，去上清液，最后一点可以用移液枪(1000μl)尽可能吸尽，弹散细胞，缓慢滴加3ml冻存液至细胞内，轻轻吹匀，再将剩下的冻存液加入，吹匀，以4ml/管细胞液加入到5ml冻存管内，程序降温至-80度后转移至液氮罐中。其中冻存液的配置方法包括：90％自体血浆和DMSO，根据细胞数5-10×106/ml配制冻存液，配方(10％DMSO+90％脐血自体血浆)/ml，共配置40ml冻存液。配制时先加自体血浆再慢慢滴加DMSO，取DMSO时从底部往上抽加，以防其凝固，全程避光、冰上操作。
6、从液氮罐中取出冻存细胞的冻存管，迅速置于37℃水浴箱进行复苏。用无血清培养液对细胞进行重悬至15ml离心管中，同步骤4的方法进行细胞计数，然后进行离心：离心条件：20℃，*150rcf-*390rcf，10min，+8，-9。
7、离心完毕后去上清液，每1×107/ml细胞加90μl MACS Buffer即(n×90)μl。每1×107/ml细胞加10μl～20μl CD25MicroBeadsII即(n×10)μl。涡旋。
8、将离心管放置冰箱上层15min，中间(7.5min)轻摇一次。在离心管内加MACS，每1×107个细胞加入1～2mL MACS Buffer重悬进行离心，离心条件：20℃，*150rcf-*390rcf，10min，+8，-9。离心时用500μl Buffer润LS柱2次。弃上清。弹散细胞。(以下步骤在冰上操作)。
9、每1×108个细胞加入3ml MACS Buffer，LS柱过柱分离。用15ml离心管收集流出液。加1ml Buffer冲洗离心管得细胞悬液，加入LS柱。重复该步骤一次。该步骤中流出液内的细胞为CD4+CD25-T细胞。
10、用酒精灯消毒后的镊子夹取LS柱，放置于15ml离心管上。加1ml-3ml MACSBuffer于MS柱内，用活塞快速打出，得CD4+CD25+T细胞，流式细胞仪检测CD4+CD25+细胞阳性率(图1)。同步骤4的方法进行细胞计数。然后对CD4+CD25+T细胞进行离心：离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
11、清洗磁珠：将CD3/CD28磁珠(与脐血调节性T细胞的比例为1-3:1)加入包含10ml无血清培养液的15ml的离心管中，将离心管放入磁力架中静止2min，吸取液体。取出离心管，用扩培液重悬磁珠。
12、按照2-8×105/ml细胞种植于48孔板中，第0天每孔加含磁珠的扩培液0.5ml(扩培液的配方见表1)，37℃,5％CO2浓度培养。
表1配置50ml脐血调节性T细胞扩增培养基的配方
Figure BDA0001360112920000061
Figure BDA0001360112920000071
二、调节性T细胞扩增
1.种板后第1-2天(24h-48h)后，每孔细胞增加0.5ml-1ml扩培液，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2，在37℃、5％CO2浓度下培养。
2.种板后第3-4天，第1次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。添加后每孔的扩培液1ml，rhIL-2的加入量以1ml的扩培液的含量加入，其余步骤的rhIL-2加入量与该步骤相同。
3.种板后第5-6天，第2次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
4.种板后第7-10天，第3次传代：先去除培养皿中的CD3CD28磁珠，再添加洗净的新CD3CD28磁珠(按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1)，在37℃、5％CO2浓度下培养。
5.种板后第10-11天，第4次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
6.种板后第11-12天，第5次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
7.种板后第12-13天，第6次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
8.种板后第13-14天，第7次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
三、扩增后脐血调节性T细胞的表型稳定
1.取1孔调节性T细胞(5-10×105)，加入0.9％生理盐水至5ml(常温)，离心，20℃，*570rcf，5min，+8，-9。
2.采用PerFix-nc Kit试剂盒(货号PN B10825，公司Beckman)对调节性T细胞进行表型，该试剂盒里有3个buffer,buffer1:Fixative Reagent,PN B10827-75tests-liquid；buffer2:Permeabilizing Reagent,PN B10828-75tests-liquid；buffer 3:Final 10×Solution,PN B10829-75tests-liquid。用枪头去除离心后的上清，剩余50μl-100μl液体，加入5μl buffer1液体和5μl Fc Block抗体，震荡(力度适中)，常温避光孵育15min。
3.加入100μl-200μl buffer2液体，加CD4、CD25及Foxp3抗体各5μl，震荡(力度适中)，常温避光孵育15～30min。
4.加入稀释成工作液的buffer3(buffer3：水＝1:9)3ml，离心，20℃，*570rcf，5min，+8，-9。
5.流式上机检测，流式结果表明扩增14天用于治疗自身免疫糖尿病患者的细胞CD4+CD25+细胞占总细胞的88.74％，CD4+CD25+Foxp3+三阳细胞占双77.26％，检测结果参见图1。其中图1A为脐血调节性T细胞的表型检测图；图1B为CD4+CD25+细胞占总细胞的表型检测图；图1C为CD4+CD25+FoxP3+三阳细胞占总细胞的表型检测图。
三、扩增后脐血调节性T细胞明显抑制攻击性T细胞的增殖能力
1.复苏攻击性T细胞CD4(+)CD25(-)T细胞，取1×106个细胞。
2.无血清培养基1ml重悬细胞(1×106个细胞)。
3.每1ml中加入1μl cell trace stock solution(CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit)，货号：C34554；Thermofisher scientific公司。此试剂盒包含十份一次性瓶装的CellTraceTMCFSE(Component A)，CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的DMSO(Component B)，DMSO(二甲基亚砜)，cell tracestock solution是指按照试剂盒说明书配置的混合液用于对细胞进行CFSE染色：18ulDMSO+1份瓶装CellTraceTMCFSE。详见https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C34554)
4. 37℃避光孵育20min。
5.加入5ml洗涤液(无血清培养液+10％FBS(牛胎血清))。
6. 37℃避光孵育5min。
7.离心20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
8. 37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
9.取一孔调节性T细胞(Treg细胞)，去除磁珠，计数，离心，20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
10. 1×106个Treg细胞在37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
11.将CD4(+)CD25-T细胞数目：调节性T细胞数目按照1:1；2:1；4:1(每孔供200μl，加3μl磁珠)的密度种植与96孔板中进行共培养。单独羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)处理的CD4(+)CD25-T细胞设为阴性对照组，CFSE处理的CD4(+)CD25-T细胞组(磁珠刺激)设为阳性对照组。
12.流式检测脐血调节性T细胞的抑制功能。
13.CFSE实验结果显示CD4(+)CD25-T：Treg数目比率分别为1，2，4：1共培养时，CD4(+)CD25-T增殖被抑制率分别为77％、76.9％、68.9％。结果表明扩增后的脐血调节性T细胞能明显抑制攻击性T细胞的增殖能力参见图2。
扩培对照试验
取相同量的带有磁珠的调节性T细胞分为两组进行扩增，两组放置在48孔板中进行扩培，实验组中扩培条件与前述“二、调节性T细胞扩增”的步骤相同。其中扩培液的配方为：42.69份无血清培养液、1.25份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5份青霉素-链霉素溶液、0.5份L-谷氨酰胺、0.05份2-巯基乙醇、0.01154份重组白介素-2、0.001份雷帕霉素和5份AB血清。而对照组除扩培液中不包含AB血清外，其余与实验组相同。
实验组和对照组的起始调节性T细胞数目相同，均为2×106。对各组的调节性T细胞数进行计数，计数步骤具体为：取10μl细胞悬液置于EP管内，取90μl台盼蓝加于EP管内混匀。取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/ml*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右。扩培14天时，对照组的调节性T细胞总数为3×107，实验组的调节性T细胞总数为1.5×108。扩培21天时，对照组的调节性T细胞总数为1×108，实验组的调节性T细胞总数为7×108。显微镜下观察各组脐血调节性T细胞的生长状况，图3A为对照组中脐血调节性T细胞的生长情况；图3B为实验组组中脐血调节性T细胞的生长情况。图3A和图3B提示脐血调节性T细胞在加入了10％AB血清的扩培液中细胞扩增数目更多，并且细胞更饱满，细胞状态更佳。可见本申请的扩培液能明显促进脐血调节性T细胞的增殖能力。
孔板的对照实验
实验组和对照组的起始调节性T细胞数目相同，均为2×106。其中实验组在48孔板中扩培14天，对照组在24孔板中扩培14天。显微镜下观察脐血调节性T细胞在24孔(图4A)与48孔(图4B)培养皿中的生长情况，结果提示：起始细胞相同，在48孔中扩增的脐血调节性T细胞较24孔的细胞扩增数目更多，细胞更饱满。可见48孔板可适合于脐血调节性T细胞扩增。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种调节性T细胞的扩培方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过提取方式获取所述调节性T细胞，提取方法包括以下步骤：
从脐带血中分离得到外周血单个核细胞层，并用红细胞裂解液除去其中的红细胞，清洗、计数；
离心除去上清液，冻存，复苏并计数，将其与CD25磁珠结合，磁性分选得到CD4+CD25+T细胞，即所述调节性T细胞；
将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合；所述将调节性T细胞与CD3/CD28磁珠结合的步骤包括：将CD3/CD28磁珠与所述调节性T细胞按1~3:1的比例加入无血清培养液中，并在磁性环境中静置后，吸除液体；
将带有磁珠的调节性T细胞按照每孔2~8×105/ml的浓度加入48孔板中，每孔加入0.5毫升扩培液进行培养；所述扩培液按体积份数比计包括35.274~42.69份无血清培养液、1.25~2.5份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5~1份青霉素-链霉素溶液、0.5~1份L-谷氨酰胺、0.05~0.1份2-巯基乙醇、0.00769~0.01154份重组白介素-2、0.001~0.01份雷帕霉素和5~10份AB血清；
初始培养1~2天后，每隔1~3天继代培养一次，共培养14~21天；所述初始培养和继代培养过程均在36~38℃，4~6%的CO2条件下进行；种板后第1~2天后，每孔细胞增加0.5ml~1ml扩培液，同时添加100~400U/ml的rhIL-2后培养；
继代培养时，吸除孔内0.5ml的培养液，将剩余的培养液混匀细胞，每1孔传2孔，同时每孔补加培养液至1ml，在进行第3次传代培养时，除去CD3/CD28磁珠，再按照磁珠：调节性T细胞的数目=1:1的比例添加新的CD3/CD28磁珠。
2.根据权利要求1所述的调节性T细胞的扩培方法，其特征在于，
所述调节性T细胞的扩培液按体积份数比计包括42.69份无血清培养液、1.25份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5份青霉素-链霉素溶液、0.5份L-谷氨酰胺、0.05份2-巯基乙醇、0.01154份重组白介素-2、0.001份雷帕霉素和5份AB血清。
3.根据权利要求1或2所述的调节性T细胞的扩培方法，其特征在于，所述冻存步骤所用冻存液包括10%体积百分数的DMSO和90%体积百分数的脐血自体血浆。
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