CN115305237B - 一种优化的调节性t细胞的扩增及规模化生产的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法，包括如下步骤：制备含有脐血调节性T细胞的重悬液；将含有脐血调节性T细胞的重悬液转移至与磁极配套的无菌管中，磁性分选出CD4+CD25+CD127‑调节性T细胞；在带有磁珠的调节性T细胞中加入扩培液进行培养，初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养40‑50天。本发明的方法，通过一步法分选，细胞扩增效果很好(时间缩短、细胞活性好)，不仅有效扩增时间由18增加到40‑50天，而且增效果不会逐渐变差，大大增加调节性T细胞扩增代数和数目，能够满足临床患者的需求。

Description

一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，尤其涉及一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法。
背景技术
调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类特殊的T细胞亚群，通过抑制和调控效应T细胞维持动态免疫平衡。从上世纪末日本学者分离并鉴定了调节性T细胞后，其已成为近年来免疫领域研究的热点。国外已启动多项调节性T细胞相关的临床试验，其中较有代表性的调节性T细胞治疗移植物抗宿主病证实了该疗法应用于免疫性疾病的安全性及有效性。然而，调节性T细胞治疗免疫性疾病在中国仍是空白。调节性T细胞治疗能够使免疫系统重新达到平衡，阻止自身免疫反应对器官组织的进一步损伤，改善甚至逆转病情，从根本上治愈免疫性疾病。
越来越多的研究表明脐血中富含调节性T细胞，因其具未受抗原激活多为
Figure BDA0003737088100000011
T细胞，体外扩增后的Treg细胞功能良好且免疫原性低，因而为免疫性疾病治疗带来了新希望。本团队前期建立了脐血调节性T细胞的体外分离、扩增和功能鉴定方法并获批国家发明专利(专利号：201710613737.4)，并在国际上首次开展了脐血调节性T细胞治疗自身免疫糖尿病的临床研究，初步明确了脐血调节性T细胞治疗自身免疫糖尿病的安全性和有效性的评估。2019年和2020年，美国青少年糖尿病联盟(JDCA)分别发表年度报告关于全球治疗1型糖尿病的技术，“脐血调节性T细胞“治疗技术连续被评为全球领先技术。目前通过应用脐血Treg细胞来治疗免疫性疾病的临床试验在全球尚属空白。调节性T细胞可从脐血中提取，提取后扩增用后再进行应用，需要14-21天的时间，每次细胞扩增倍数约为100倍左右，只能满足1-2例患者的需要。因此，亟待建立一种调节性T细胞体外扩增优化方法，增加调节性T细胞的扩增代数和数目，满足临床患者的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种调节性T细胞体外扩增优化方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法，包括如下步骤：
(1)制备含有脐血调节性T细胞的重悬液；
(2)将含有脐血调节性T细胞的重悬液转移至与磁极配套的无菌管中，磁性分选出CD4+CD25+CD127-调节性T细胞；
(3)在带有磁珠的调节性T细胞中加入扩培液进行培养，初始培养1～2天后，每隔1～3天继代培养一次，共培养40-50天以上。
上述优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法，优选的，在步骤(1)中，所述制备含有脐血调节性T细胞的重悬液包括以下步骤：从脐带血中分离得到外周血单个核细胞层，并用红细胞裂解液除去其中的红细胞，清洗、计数，离心除去上清液，重悬。
更优选的，所述重悬包括以下步骤：离心除去上清液，用Easy Buffer将细胞重悬至5×107cell/mL，重悬后液体量为0.5mL-6mL，即得到重悬液。
上述优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法，优选的，在步骤(2)中，磁性分选出CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的具体操作包括如下步骤：将含有脐血调节性T细胞的重悬液转移至与磁极配套的无菌管中，加入CD25 Positive Selection Cocktail，孵育5min；涡旋Releasable Rapidsphere 30s以上，直至磁珠团块消失；加入ReleasableRapidsphere；加入CD4+T细胞富集抗体混合物，孵育5mim；加入Easy Buffer定容至10mL，上下轻柔混匀2-3次；将无菌管放置于磁极上，孵育10mim；准备离心管收集CD25-细胞，将磁极连同无菌管一起倾倒管内液体至该管内；从磁极上取下无菌管，向其中加入10mL EasyBuffer，轻柔混匀2-3次后放置于磁极上，孵育5min；加入Easy Buffer定容至初始重悬体积，将管壁上细胞全部冲下；加入磁珠去除缓冲液；加入CD127high去除抗体混合物，孵育5min；加入Easy Buffer定容至10mL，上下混匀2-3次；将无菌管放置于磁极上，孵育5min；准备离心管收集调节性T细胞，将磁极连同无菌管一起将液体倾倒至准备好的离心管内，即得。
更优选的，所述CD25 Positive Selection Cocktail的加入量为重悬体积×50uL，所述Releasable Rapidsphere的加入量为重悬体积×30uL，所述CD4+T细胞富集抗体混合物的加入量为重悬体积×50uL，所述磁珠去除缓冲液的加入量为重悬体积×100uL，所述CD127high去除抗体混合物的加入量为重悬体积×50uL。
上述优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法，优选的，在步骤(3)中，将带有磁珠的调节性T细胞按照每孔2～8×105/ml的浓度加入48孔板中，每孔加入0.5毫升扩培液进行培养。
优选的，在步骤(3)中，所述扩培液按体积份数比计包括无血清培养液70.54％-85.27％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液2.5％-5％、青霉素-链霉素溶液1％-2％、L-谷氨酰胺1％-2％、50-100umol/L2-巯基乙醇0-1000U/ml重组白介素-2、50-200nmol/L雷帕霉素、AB血清10％-20％。
优选的，在步骤(3)中，所述初始培养和继代培养过程均在36～38℃，4～6％的CO2条件下进行。
更优选的，种板后第1～2天后，每孔细胞增加0.5ml～1ml扩培液，同时添加100～400U/ml的rhIL-2后培养。
更优选的，继代培养时，吸除孔内0.5ml的培养液，将剩余的培养液混匀细胞，每1孔传2孔，同时每孔补加培养液至1ml，在进行第3次传代培养时，除去抗CD3CD28磁珠，再按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1的比例添加新的抗CD3CD28磁珠。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的方法，通过一步法分选，采用了新的试剂盒，不需要离心，细胞扩增效果很好(时间缩短、细胞活性好)。一般来说扩增时间越长扩增效果逐渐变差，但是本发明不仅有效扩增时间由18增加到40-50天，而且增效果不会逐渐变差，大大增加调节性T细胞扩增代数和数目，能够满足临床患者的需求。
2、本发明扩增得到的脐血调节性T细胞，其流式结果表明扩增18天和40-50天的调节性T细胞CD4+CD25+CD127-的占比为97.07±2.03％和87.1±7.2％，CD3+CD8+的占比分别为4.69±2％和5.2±3.6％，该表型达到临床研究治疗患者的要求；CFSE实验结果表明扩增得到的脐血调节性T细胞能明显抑制攻击性T细胞的增殖能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1脐血调节性T细胞扩增18天和40-50天的倍数比较；
图2是脐血T细胞扩增18天的功能鉴定结果-CFSE。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种优化的调节性T细胞的扩增及规模化生产的方法，对调节性T细胞进行扩增培养和保存以用于治疗免疫相关疾病，扩增方法的方法如下：
一、脐血调节性T细胞制备
1.对脐血袋进行消毒，制备脐血自体血浆：将脐血袋中的脐血转移至50ml离心管中进行离心：离心条件：20℃，3000rpm，10min，+8，-9。取上清转移至新50ml离心管中进行第二次离心：离心条件：20℃，4000rpm，10min，+8，-9，吸取黄色澄清的血浆，56℃水浴灭活30分钟后放置冰箱备用。用与吸出血浆等体积的生理盐水重悬脐血；
2.将生理盐水重悬的脐血缓慢加至淋巴细胞分离液(脐血体积：淋巴细胞分离液体积＝1:1)离心，离心条件：20℃，*400rcf-*1610rcf，25min，+0，-0。离心结束后，脐血分层，用吸管吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，动作缓慢轻柔，尽可能少吸取淋巴细胞液；
3.将PBMC层继续离心，离心条件：20℃，*580rcf，10min，+8，-9。取5ml-10ml 10×红细胞裂解液及45ml灭菌用水配置红裂液。在离心完成后，去上清液，加入红裂液2～10分钟后，加入了0.9％生理盐水至35ml定容终止红裂。离心，去除上清，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。重复加入0.9％生理盐水定容，离心，去除上清的步骤2～3次；
4.离心完成后，去上清液，弹散细胞，加入0.9％的生理盐水，取10μl进行计数。剩余的加0.9％生理盐水至40ml定容再次离心，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。其中计数步骤具体为：将所取细胞液置于EP管内，取90μl台盼蓝加于EP管内混匀。取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/ml*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右；
5.离心完毕后去上清液，用Easy Buffer将细胞重悬至5×107cell/mL，重悬后液体量为0.5mL-6mL；
6.将重悬后的细胞悬液转移至与磁极配套的无菌管中；
7.加入CD25阳性选择抗体，加入量为重悬体积×50uL，混匀；
8.孵育5min；
9.涡旋可释放的球体30s以上，直至磁珠团块消失；
10.加入可释放的球体：加入量为重悬体积×30uL，混匀；
11.加入CD4+T细胞富集抗体混合物(T cell Enrichment Cocktail)：加入量为重悬体积×50uL，混匀；
12.孵育5mim；
13.加入Easy Buffer定容至10mL，上下轻柔混匀2-3次；
14.将无菌管放置于磁极上，无需盖子；
15.孵育10mim；
16.准备离心管收集CD25-细胞，将磁极连同无菌管一起倾倒管内液体至该管内；
17.从磁极上取下无菌管，向其中加入10mL Easy Buffer，轻柔混匀2-3次后放置于磁极上，孵育5min；
18.重复16-17步操作2次；
19.加入Easy Buffer定容至初始重悬体积，注意将管壁上细胞全部冲下；
20.加入磁珠去除缓冲液(Release Buffer)：加入量为重悬体积×100uL，大力混匀5次以上；
21.加入CD127high去除抗体混合物(Depletion Cocktail)：加入量为重悬体积×50uL，混匀；
22.孵育5min；
23.加入Easy Buffer定容至10mL，上下混匀2-3次；
24.将无菌管放置于磁极上，孵育5min；
25.准备离心管收集调节性T细胞，将磁极连同无菌管一起将液体倾倒至准备好的离心管内，即得CD4+CD25+CD127-调节性T细胞。
上述获取CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的过程可采用EasySepTM人CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(Treg)分选试剂盒，品牌：STEMCELL Technologies，货号:18063。
二、调节性T细胞扩增
1.按照2-8×105/ml将调节性T细胞种植于48孔板中，第0天每孔加含磁珠(磁珠数：细胞数＝1：1)的扩培液0.5ml(扩培液的配方见表1)，37℃,5％CO2浓度培养。
表1配置50ml脐血调节性T细胞扩增培养基的配方
Figure BDA0003737088100000051
Figure BDA0003737088100000061
2.种板后第1-2天(24h-48h)后，每孔细胞增加0.5ml-1ml扩培液，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2，在37℃、5％CO2浓度下培养。
3.种板后第3-4天，第1次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。添加后每孔的扩培液1ml，rhIL-2的加入量以1ml的扩培液的含量加入，其余步骤的rhIL-2加入量与该步骤相同。
4.种板后第5-6天，第2次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
5.种板后第7-10天，第3次传代：先去除培养皿中的抗CD3CD28磁珠，再添加洗净的新抗CD3CD28磁珠(按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1)，在37℃、5％CO2浓度下培养。
6.种板后第10-11天，第4次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
7.种板后第11-12天，第5次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
8.种板后第12-13天，第6次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
9.种板后第13-14天，第7次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/ml的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
10、按照以上方法扩增至细胞停止生长，时间约为40-50天。
本实施例中调节性T细胞的扩培液按体积份数比计，各组分以体积的方式计量加入，具体加入的量以体积份数为标准，体积份数即为各组分的体积比。调节性T细胞的扩培液包括无血清培养液70.54％-85.27％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液2.5％-5％、青霉素-链霉素溶液1％-2％、L-谷氨酰胺1％-2％、50-100umol/L2-巯基乙醇0-1000U/ml重组白介素-2、50-200nmol/L雷帕霉素、AB血清10％-20％。
无血清培养液可以是Lonza公司的X-VIVO 15w/o Gent or Phenol Red，货号04-744Q。4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液可以是Hyclone公司的Hepes缓冲液，货号SH3023701。青霉素-链霉素溶液可以是Gibco公司的PENICILLIN STREPTOMYCIN，15140122。L-谷氨酰胺可以是sigma公司的L-Glutamine solution，货号G7513-100ML。2-巯基乙醇可以是Millipore公司的1000X 2-Mercaptoethanol，货号ES-007-E。重组白介素-2可以是R&D公司的rhrhIL-2，货号202-IL-010。雷帕霉素可以是sigma公司的rapamycin，货号R8781-200UL。当然其他公司生产的相同产品同样可以使用。AB血清是美国Gemini公司的，货号100-512。
上述扩培液视具体使用情况，配置方法稍有不同，如调节性T细胞复苏种板时，扩培液可预先将各组分完全混合好之后配制之间加入孔板内，扩培液可将除重组白介素-2外的组分混合的预混液加入，再加重组白介素-2。由于继代培养时每孔的重组白介素-2基本消耗完，因此在其每孔传2孔，每孔补入预混液，如每孔补入0.5ml预混液至每孔的溶液1ml。此时需按1ml扩培液的量加入相应的重组白介素-2。
上述扩培试验的标准如下：
细胞种置48孔板中进行培养,扩培液包含磁珠(磁珠数：调节性T细胞数＝1：1)，1×106细胞/孔/mL，36～38℃，4～6％的CO2环境培养，随后细胞按照已建立的扩增条件进行扩增。其中扩培液的配方为：42.69份无血清培养液、1.25份4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.5份青霉素-链霉素溶液、0.5份L-谷氨酰胺、0.05份2-巯基乙醇、0.01154份重组白介素-2、0.001份雷帕霉素和5份AB血清。
起始调节性T细胞数目为1×106，对扩增后的调节性T细胞数进行计数，计数步骤具体为：取10μl细胞悬液置于EP管内，取90μl台盼蓝加于EP管内混匀。取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/ml*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右。
调节性T细胞扩培扩增至40-50天，调节性T细胞的数目为7834.4±8430.4，而扩增18天的细胞倍数为150.6±70.3，详见图1。
实验1、扩增后脐血调节性T细胞的表型稳定
1.取1孔调节性T细胞(5-10×105)，加入0.9％生理盐水至5ml(常温)，离心，20℃，*570rcf，5min，+8，-9。
2.采用PerFix-nc Kit试剂盒(货号PN B10825，公司Beckman)对调节性T细胞进行表型检测，该试剂盒里有3个buffer,buffer1:Fixative Reagent,PN B10827-75tests-liquid；buffer2:Permeabilizing Reagent,PN B10828-75tests-liquid；buffer 3:Final10×Solution,PN B10829-75tests-liquid。用枪头去除离心后的上清，剩余50μl-100μl液体，加入5μl buffer1液体和5μl Fc Block抗体，震荡(力度适中)，常温避光孵育15min。
3.加入CD3、CD4、CD25、CD127和CD8抗体各5μl，震荡(力度适中)，常温避光孵育15～30min。
4.加入稀释成工作液的buffer3(buffer3：水＝1:9)3ml，离心，20℃，*570rcf，5min，+8，-9。
5.流式上机检测，流式结果表明扩增18天和40-50天的调节性T细胞CD4+CD25+CD127-的占比为97.07±2.03％和87.1±7.2％，CD3+CD8+的占比分别为4.69±2％和5.2±3.6％，该表型达到临床研究治疗患者的要求。
实验2、扩增后脐血调节性T细胞明显抑制攻击性T细胞的增殖能力
1.复苏攻击性T细胞CD4(+)CD25(-)T细胞，取1×106个细胞。
2.无血清培养基1ml重悬细胞(1×106个细胞)。
3.每1ml中加入1μl cell trace stock solution(CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit)，货号：C34554；Thermofisherscientific公司。此试剂盒包含十份一次性瓶装的CellTraceTM CFSE(ComponentA)，CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的DMSO(Component B)，DMSO(二甲基亚砜)，cell trace stock solution是指按照试剂盒说明书配置的混合液用于对细胞进行CFSE染色：18ulDMSO+1份瓶装CellTraceTM CFSE。详见https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C34554)
4.37℃避光孵育20min。
5.加入5ml洗涤液(无血清培养液+10％FBS(牛胎血清))。
6.37℃避光孵育5min。
7.离心20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
8.37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
9.取一孔调节性T细胞(Treg细胞)，去除磁珠，计数，离心，20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
10.1×106个Treg细胞在37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
11.将CD4(+)CD25-T细胞数目：调节性T细胞数目按照1∶1；2∶1；4∶1(每孔供200μl，加3μl磁珠)的密度种植与96孔板中进行共培养。单独羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)处理的CD4(+)CD25-T细胞设为阴性对照组，CFSE处理的CD4(+)CD25-T细胞组(磁珠刺激)设为阳性对照组。
12.流式检测脐血调节性T细胞的抑制功能。
13.CFSE实验结果显示CD4(+)CD25-T：Treg数目比率分别为1，2，4，8∶1共培养时，CD4(+)CD25-T增殖被抑制率分别为56.5±11.6％，60.2±16.1％，65.4±13.4％，71.1±11.2％，结果表明扩增后的脐血调节性T细胞能明显抑制攻击性T细胞的增殖能力，参见表2-6和图2。
表2：脐血调节性T细胞扩增18天的扩增倍数
Figure BDA0003737088100000091
表3：脐血T细胞扩增18天表型鉴定结果
样本 CD3+CD4+CD25+CD127-Tregs(％) CD8+T cells(％)
1 93.4 7.58
2 98.2 5.93
3 99 6.56
4 96.2 2.71
5 95.8 3.05
6 98.7 2.77
7 98.2 4.23
均数±标准差 97.07±2.03 4.69±2.00
表4：脐血T细胞扩增40-50天扩增倍数
Figure BDA0003737088100000101
表5：脐血T细胞扩增40-50天表型鉴定结果
样本 CD3+CD4+CD25+CD127-Tregs(％) CD8+T cells(％)
1 78.9 2.49
2 89.8 3.74
3 92.6 9.28
均数±标准差 87.1±7.2 5.2±3.6
表6：脐血T细胞扩增40-50天功能鉴定结果-CFSE
1 2 3 均数±标准差
P+ 70.4 87.6 88.6 82.2±10.2
1∶1 44.6 67.8 57.0 56.5±11.6
2∶1 42.7 74.4 63.4 60.2±16.1
4∶1 50.8 77.0 68.5 65.4±13.4
8∶1 59.2 81.4 72.6 71.1±11.2
总的来说，本发明的方法，通过一步法分选，采用了新的试剂盒，不需要离心，细胞扩增效果很好(时间缩短、细胞活性好)。一般来说扩增时间越长扩增效果逐渐变差，但是本发明不会不仅有效扩增时间由18增加到40-50天，而且增效果不会逐渐变差，大大增加调节性T细胞的扩增代数和数目，能够满足临床患者的需求。

Claims (9)

1.一种优化的调节性T细胞的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备含有脐血调节性T细胞的重悬液；
（2）将含有脐血调节性T细胞的重悬液转移至与磁极配套的无菌管中，加入CD25Positive Selection Cocktail，孵育5min；涡旋Releasable Rapidsphere 30s以上，直至磁珠团块消失；加入Releasable Rapidsphere；加入CD4+ T细胞富集抗体混合物，孵育5mim；加入Easy Buffer定容至10mL，上下轻柔混匀2-3次；将无菌管放置于磁极上，孵育10mim；准备离心管收集CD25-细胞，将磁极连同无菌管一起倾倒管内液体至该管内；从磁极上取下无菌管，向其中加入10mL Easy Buffer，轻柔混匀2-3次后放置于磁极上，孵育5min；加入Easy Buffer定容至初始重悬体积，将管壁上细胞全部冲下；加入磁珠去除缓冲液；加入CD127high 去除抗体混合物，孵育5min；加入Easy Buffer定容至10mL，上下混匀2-3次；将无菌管放置于磁极上，孵育5min；准备离心管收集调节性T细胞，将磁极连同无菌管一起将液体倾倒至准备好的离心管内，即得磁性分选出的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞；获取CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的过程采用EasySep™人CD4+CD25+CD127-调节性T细胞分选试剂盒，品牌：STEMCELL Technologies，货号：18063；
（3）在带有磁珠的调节性T细胞中加入扩培液进行培养，初始培养1~2天后，每隔1~3天继代培养一次，共培养40-50天。
2.根据权利要求1所述优化的调节性T细胞的扩增方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述制备含有脐血调节性T细胞的重悬液包括以下步骤：从脐带血中分离得到外周血单个核细胞层，并用红细胞裂解液除去其中的红细胞，清洗、计数，离心除去上清液，重悬。
3.根据权利要求2所述优化的调节性T细胞的扩增方法，其特征在于，所述重悬包括以下步骤：离心除去上清液，用Easy Buffer将细胞重悬至5×107cell/mL，重悬后液体量为0.5mL-6mL，即得到重悬液。
4.根据权利要求1所述优化的调节性T细胞的扩增方法，其特征在于，所述CD25Positive Selection Cocktail的加入量为重悬体积×50uL，所述ReleasableRapidsphere的加入量为重悬体积×30uL，所述CD4+ T细胞富集抗体混合物的加入量为重悬体积×50uL，所述磁珠去除缓冲液的加入量为重悬体积×100uL，所述CD127high 去除抗体混合物的加入量为重悬体积×50uL。
5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，在步骤（3）中，将带有磁珠的调节性T细胞按照每孔2~8×105/ml的浓度加入48孔板中，每孔加入0.5毫升扩培液进行培养。
6.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述扩培液按体积份数比计包括无血清培养液70.54%-85.27%、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液2.5%-5%、青霉素-链霉素溶液1%-2%、L-谷氨酰胺1%-2%、50-100umol/L2-巯基乙醇0-1000U/ml重组白介素-2、50-200nmol/L雷帕霉素、AB血清10%-20%。
7.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述初始培养和继代培养过程均在36~38℃，4~6%的CO2条件下进行。
8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，种板后第1~2天后，每孔细胞增加0.5ml~1ml扩培液，同时添加100~400U/ml的rhIL-2后培养。
9.根据权利要求7或8所述的扩增方法，其特征在于，继代培养时，吸除孔内0.5ml的培养液，将剩余的培养液混匀细胞，每1孔传2孔，同时每孔补加培养液至1ml，再进行第3次传代培养时，除去抗CD3CD28磁珠，再按照磁珠：调节性T细胞的数目=1:1的比例添加新的抗CD3CD28磁珠。
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