CN115737543A - 调节性t细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用，所述调节性T细胞囊泡复合水凝胶包括调节性T细胞囊泡和水凝胶，所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为：0.5～5g/L，所述调节性T细胞囊泡的制备方法包括：从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；取所得上清，再次进行至少一次离心处理，收集沉淀，获得调节性T细胞囊泡。本发明提供的调节性T细胞囊泡复合水凝胶能明显促进创口愈合，对治疗糖尿病创面愈合有很好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域，特别地，涉及一种调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用。
背景技术
糖尿病创面损伤是一种严重的糖尿病并发症，主要由糖尿病周围神经病变及周围血管病变引起，最常见的表现是糖尿病足溃疡(diabetic foot ulceration,DFU)，最严重时需要手术截肢甚至引起死亡。糖尿病足住院率高，住院时间长，花费高，但普遍而言预后较差，致死、致残率高。
目前针对改善糖尿病周围神经病变和血管病变的抗血小板及抗凝、抗炎症、改善缺氧等治疗措施均对DFU愈合存在一定帮助，但如何在严重的血管病变前提下更有效地促进创面愈合亟待解决。
发明内容
本发明提供了一种调节性T细胞囊泡的制备方法、复合水凝胶及其应用，以解决如何在严重的血管病变前提下更有效地促进糖尿病创面愈合的技术问题。
根据本发明的一个方面，提供一种调节性T细胞囊泡复合水凝胶，包括调节性T细胞囊泡和水凝胶，所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为：0.5～5g/L。
进一步地，所述水凝胶为医用水凝胶。
根据本发明的另一方面，提供一种调节性T细胞囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(3)取步骤(2)所得上清，进行至少一次离心处理，收集沉淀，获得调节性T细胞囊泡。
进一步地，步骤(2)中的至少一次离心处理包括：
取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行第一次离心处理，去除沉淀，收集上清；
取第一次离心处理所得上清，进行第二次离心处理，去除凋亡体和细胞碎片，再次获得上清。
进一步地，所述第一次离心处理的条件为：温度0～10℃，离心力200～500g，时间10～20min。
进一步地，所述第二次离心处理的条件为：温度4～25℃，离心力500～10000g，时间10～30min。
进一步地，步骤(3)中的至少一次离心处理包括：
取步骤(2)中最后一次离心所得上清，进行第N次离心处理，去除上清，获得调节性T细胞囊泡沉淀；
取所述脐血调节性T细胞囊泡沉淀，进行第N+1次离心处理，去除上清，获得调节性T细胞囊泡，其中，N为大于等于3的整数。
进一步地，第N次离心处理与第N+1次离心处理的条件为：温度为4～25℃，离心力3000～20000g，时间为10～60min。
根据本发明的再一方面，还提供一种上述调节性T细胞囊泡复合水凝胶在促进创面愈合中的应用。
进一步地，所述创面包括普通创面或糖尿病创面。
本发明具有以下有益效果：
糖尿病创面性质复杂、致病机制的了解有限而难以治疗，其中，明确创面炎症环境紊乱，炎症持续存在是导致糖尿病性创面延迟愈合的重要原因之一。脐血调节性T细胞来源细胞大囊泡，具有干细胞类似作用：抗炎、免疫调节、促进组织再生，具有强大的促愈合，并且可以向炎症部位趋化的能力。细胞外囊泡直接应用具有局限性：半衰期短和清除率高。水凝胶具有良好的生物相容性、孔隙性、独特的温敏性，细胞囊泡负载于水凝胶可起到持续稳定释放，防止囊泡被过早清除。本发明提供的调节性T细胞囊泡复合水凝胶能明显促进创口愈合，可在严重的血管病变前提下更有效地促进糖尿病创面愈合。
本发明提供的调节性T细胞囊泡的制备方法先从脐血中提取调节性T细胞，在对其进行扩增，经一系列离心处理后获得调节性T细胞囊泡，该方法制备得到的囊泡属于免疫细胞囊泡，单位体积浓度高、制备周期短。
本发明提供的调节性T细胞囊泡的制备方法制得的调节性T细胞囊泡在抑制糖尿病患者单个核心胞的增殖能力上具有明显效果，还能促进血管内皮细胞的迁移能力。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的流式检测脐血调节性T细胞的抑制功能图谱；
图2是本发明优选实施例的调节性T细胞囊泡促进血管内皮细胞的迁移能力图谱；
图3是本发明优选实施例的调节性T细胞囊泡(Treated组)复合水凝胶促进糖尿病创口愈合情况对比图；
图4是本发明优选实施例的调节性T细胞囊泡(Treated组)复合水凝胶促进普通创口愈合情况对比图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及以上，“一个或多个”中的“多个”的含义是两个及以上。
调节性T细胞(regμlatory T cell,Treg)是一群具有免疫调节功能的免疫细胞亚群，它具有阻遏自身免疫性细胞增殖(CD4+CD25-T)的能力，主要在免疫系统的反馈调节中发挥抑制作用。脐血中富含调节性T细胞，因其具未受抗原激活多为
T细胞，体外扩增后的Treg细胞功能良好且免疫原性低且Treg细胞在扩增过程中分泌大量的细胞囊泡，Treg细胞囊泡作为生物制剂的多重作用使其成为最有潜力的促进损伤创面恢复，尤其是糖尿病溃疡中血管、组织修复的治疗手段。
本发明第一方面的实施例提供一种调节性T细胞囊泡复合水凝胶，包括调节性T细胞囊泡和水凝胶，所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为：0.5～5g/L。
在一些实施例中，所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为：0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5等，所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比还可以是上述数值的任意组合范围。
需要说明的是，上述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为：0.5～5g/L，在水凝胶为液体状态时，调节性T细胞囊泡的浓度对应为0.5～5g/L。
脐血调节性T细胞来源细胞大囊泡，具有干细胞类似作用：抗炎、免疫调节、促进组织再生，具有强大的促愈合，并且可以向炎症部位趋化的能力。细胞外囊泡直接应用具有局限性：半衰期短和清除率高。水凝胶具有良好的生物相容性、孔隙性、独特的温敏性。细胞囊泡负载于水凝胶可起到持续稳定释放，防止囊泡被过早清除。本发明提供的调节性T细胞囊泡复合水凝胶能明显促进创口愈合，可在严重的血管病变前提下更有效地促进糖尿病创面愈合。
在本发明的实施例中，所述水凝胶为医用水凝胶。
在一些实施例中，所述水凝胶可以为Pluronic F127，分子式:(C3H6O·C2H4O)x，其中x为正整数，上述水凝胶为聚氧乙烯聚丙乙烯三嵌段聚合物，其水凝胶溶液具有独特的温敏特性，在一定浓度和温度下可由液态转变为多孔三维结构的凝胶态，因其具有医用可注射性及良好的生物相容性，已被美国FDA批准用于人体。例如，默克Sigma公司，货号为CASNo.:9003-11-6的水凝胶。
水凝胶溶液具有良好的生物相容性、孔隙性、独特的温敏性，在一定浓度和温度下可由液态转变为多孔三维结构的凝胶态。细胞囊泡负载于水凝胶后可起到持续稳定释放，防止囊泡被过早清除等功能。
本发明第二方面的实施例提供一种调节性T细胞囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(3)取步骤(2)所得上清，进行至少一次离心处理，收集沉淀，获得调节性T细胞囊泡。
在本发明的实施例中，步骤(1)中从脐血中提取调节性T细胞包括如下步骤：
1.对脐血袋进行消毒，制备脐血自体血浆：将脐血袋中的脐血转移至50mL离心管中进行离心：离心条件：20℃，3000rpm，10min，+8，-9。取上清转移至新50mL离心管中进行第二次离心：离心条件：20℃，4000rpm，10min，+8，-9，吸取黄色澄清的血浆，56℃水浴灭活30分钟后放置冰箱备用。用与吸出血浆等体积的生理盐水重悬脐血；
2.将生理盐水重悬的脐血缓慢加至淋巴细胞分离液(脐血体积：淋巴细胞分离液体积＝1:1)离心，离心条件：20℃，*400rcf-*1610rcf，25min，+0，-0。离心结束后，脐血分层，用吸管吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，动作缓慢轻柔，尽可能少吸取淋巴细胞液；
3.将PBMC层继续离心，离心条件：20℃，*580rcf，10min，+8，-9。取5ml-10ml 10×红细胞裂解液及45ml灭菌用水配置红裂液。在离心完成后，去上清液，加入红裂液2～10分钟后，加入了0.9％生理盐水至35ml定容终止红裂。离心，去除上清，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。重复加入0.9％生理盐水定容，离心，去除上清的步骤2～3次；
4.离心完成后，去上清液，弹散细胞，加入0.9％的生理盐水，取10μL进行计数。剩余的加0.9％生理盐水至40mL定容再次离心，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。其中计数步骤具体为：将所取细胞液置于EP管内，取90μL台盼蓝加于EP管内混匀。取10μL在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/mL*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右；
5.离心完毕后去上清液，用Easy Buffer将细胞重悬至5×107cell/mL，重悬后液体量为0.5mL-6mL；
6.将重悬后的细胞悬液转移至与磁极配套的无菌管中；
7.加入CD25阳性选择抗体，加入量为重悬体积×50uL，混匀；
8.孵育5min；
9.涡旋可释放的球体30s以上，直至磁珠团块消失；
10.加入可释放的球体:加入量为重悬体积×30uL，混匀；
11.加入CD4+T细胞富集抗体混合物(T cell Enrichment Cocktail):加入量为重悬体积×50uL，混匀；
12.孵育5min；
13.加入Easy Buffer定容至10mL，上下轻柔混匀2-3次；
14.将无菌管放置于磁极上，无需盖子；
15.孵育10min；
16.准备离心管收集CD25-细胞，将磁极连同无菌管一起倾倒管内液体至该管内；
17.从磁极上取下无菌管，向其中加入10mL Easy Buffer，轻柔混匀2-3次后放置于磁极上，孵育5min；
18.重复16-17步操作2次；
19.加入Easy Buffer定容至初始重悬体积，注意将管壁上细胞全部冲下；
20.加入磁珠去除缓冲液(Release Buffer):加入量为重悬体积×100uL，大力混匀5次以上；
21.加入CD127high去除抗体混合物(Depletion Cocktail):加入量为重悬体积×50uL，混匀；
22.孵育5min；
23.加入Easy Buffer定容至10mL，上下混匀2-3次；
24.将无菌管放置于磁极上，孵育5min；
25.准备离心管收集调节性T细胞，将磁极连同无菌管一起将液体倾倒至准备好的离心管内，即得CD4+CD25+CD127-调节性T细胞。
上述获取CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的过程可采用EasySepTM人CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(Treg)分选试剂盒，品牌：STEMCELL Technologies，货号:18063。
在本发明的实施例中，步骤(1)中对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液的过程如下：
1.按照2-8×105/mL将调节性T细胞种植于48孔板中，第0天每孔加含磁珠(磁珠数：细胞数＝1：1)的扩培液0.5ml(扩培液的配方见表1)，37℃，5％ CO2浓度培养。
表1配置50ml脐血调节性T细胞扩增培养基的配方
2.种板后第1-2天(24h-48h)后，每孔细胞增加0.5mL-1mL扩培液，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2，在37℃、5％ CO2浓度下培养。
3.种板后第3-4天，第1次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％ CO2浓度下培养。添加后每孔的扩培液1mL，rhIL-2的加入量以1mL的扩培液的含量加入，其余步骤的rhIL-2加入量与该步骤相同。
4.种板后第5-6天，第2次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％ CO2浓度下培养。
5.种板后第7-10天，第3次传代：先去除培养皿中的抗CD3CD28磁珠，再添加洗净的新抗CD3CD28磁珠(按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1)，在37℃、5％ CO2浓度下培养。
6.种板后第10-11天，第4次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
7.种板后第11-12天，第5次传代：吸除0.5ml扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％CO2浓度下培养。
8.种板后第12-13天，第6次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1ml，在37℃、5％CO2浓度下培养。
9.种板后第13-14天，第7次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％CO2浓度下培养。
10.按照以上方法扩增至细胞停止生长，时间约为20-40天。
根据本发明的实施例，扩增后的脐血调节性T细胞数目明显增多，扩增得到的脐血调节性T细胞能明显抑制攻击性T细胞的增殖能力。
在本发明的实施例中，步骤(2)中，取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行至少一次离心处理，收集离心后的上清。其中，离心次数可以是1次、2次、3次或更多次。步骤(2)的目的是将培养液中的沉淀、凋亡体和碎片去除，保留上清。其中离心次数为多次时可提高囊泡的得率。
在本发明的实施例中，步骤(2)中的至少一次离心处理包括：
取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行第一次离心处理，去除沉淀，收集上清；取第一次离心处理所得上清，进行第二次离心处理，去除凋亡体和细胞碎片，再次获得上清。
根据本申请的实施例，经过以上两次离心去除杂质(残留细胞、细胞碎片和凋亡小体)进而获得高度纯化的囊泡。
在本发明的实施例中，所述第一次离心处理的条件为：温度0～10℃，离心力200～500g，时间10～20min。
在本发明的实施例中，所述第二次离心处理的条件为：温度4～25℃，离心力500～10000g，时间10～30min。经所述第二次离心处理可以获得纯化的大囊泡。
在本发明的实施例中，步骤(3)中，取步骤(2)所得上清，进行至少一次离心处理，收集沉淀，获得调节性T细胞囊泡，其中，离心次数可以是1次、2次、3次或更多次。经过多次离心可以增加大囊泡的得率。
在本发明的实施例中，步骤(3)中的至少一次离心处理包括：
取步骤(2)中最后一次离心所得上清，进行第N次离心处理，去除上清，获得调节性T细胞囊泡沉淀；取所述脐血调节性T细胞囊泡沉淀，进行第N+1次离心处理，去除上清，获得调节性T细胞囊泡，其中，N为大于等于3的整数，如N为3、4、5或其他大于5的正整数。经上述多次离心可增加大囊泡的得率。
在本发明的实施例中，第N次离心处理与第N+1次离心处理的条件为：温度为4～25℃，离心力3000～20000g，时间为10～60min。上述离心条件可增加大囊泡的得率。
本发明第三方面的实施例提供一种上述调节性T细胞囊泡复合水凝胶在促进创面愈合中的应用。
在一些实施例中，将上述脐血调节性T细胞囊泡按照0.5～5g/L的浓度与医用水凝胶混合均匀后移植于创面，每天移植一次，连续移植4次。
水凝胶溶液具有良好的生物相容性、孔隙性、独特的温敏性，在一定浓度和温度下可由液态转变为多孔三维结构的凝胶态。细胞囊泡负载于水凝胶后可起到持续稳定释放，防止囊泡被过早清除等功能。
在本发明的实施例中，所述创面包括普通创面或糖尿病创面。
创面是正常皮肤在外界致伤因素作用下，所导致的皮肤连续性、完整性破坏，以及皮肤组织的缺失和缺损。通常致伤因素有机械性外伤、手术、热、电流、化学物质、低温、自发感染以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的组织损害。根据创面愈合时间的长短，将创面分为急性创面和慢性创面。不同的创面具有不同的表型特点，这就导致了创面愈合各自的不同结局。皮肤软组织受放射线损伤而形成的溃疡，通常分为两类：一类是皮肤软组织受到大剂量放射线照射，局部产生坏疽性皮炎，坏死组织脱离后形成急性溃疡。
糖尿病创面(最常见的为糖尿病足创面)的特点一般可以分为三个程度：轻度，患者有溃疡，并且溃疡面积一般小于两个厘米，皮肤感染局限于表皮组织下，这个时期应该进行清创，加强甲抗炎治疗可以取得比较好的效果。中度，伤口有溃疡，溃疡周围的溃疡组织一般大于两个厘米，皮肤的感染，可以达皮下组织，深部可以有脓肿，伴有淋巴结肿，这个时期要进行清创，深部脓肿，要进行引流。严重期，感染的比较迅速，足部组织出现了巨大的硬节，颜色发黑，坏疽，患者会出现严重的中毒症状，这个时节主要是进行足部切除，甚至截肢。
实施例
下述实施例更具体地描述了本发明公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本发明公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
本实施例提供一种调节性T细胞囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增至细胞停止生长，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)收集脐血调节性培养上清，4℃条件下采用200-500×g离心10-20分钟，去除沉淀，收集上清。
(3)4℃条件下采用500-10000×g离心10-30分钟，去除凋亡体和细胞碎片。
(4)在4-25℃条件下采用3000-20000×g离心10-60min后，去除上清。
(5)PBS重悬管底脐血调节性T细胞囊泡沉淀，在4-25℃条件下采用3000-20000×g离心10-60min后，去除上清。
(6)PBS重悬囊泡，立即使用或-80℃冻存备用。
将制得的调节性T细胞囊泡进行如下实验：
一、调节性T细胞囊泡抑制糖尿病患者单个核细胞(PBMC)的增殖实验。
1.采集自身免疫糖尿病患者单个核细胞(PBMC)细胞，取1×106个细胞。
2.无血清培养基1mL重悬细胞(1×106个细胞)。
3.每1mL中加入1μl cell trace stock solution(CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(CellTraceTM CFSE Cell Proliferation Kit)，货号：C34554；Thermofisherscientific公司。此试剂盒包含十份一次性瓶装的CellTraceTM CFSE(Component A)，CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的DMSO(Component B)，DMSO(二甲基亚砜)，cell trace stock solution是指按照试剂盒说明书配置的混合液用于对细胞进行CFSE染色：18ulDMSO+1份瓶装CellTraceTM CFSE。
4.37℃避光孵育20min。
5.加入5mL洗涤液(无血清培养液+10％FBS(牛胎血清))。
6.37℃避光孵育5min。
7.离心20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
8.37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
9.取一孔调节性T细胞(Treg细胞)，去除磁珠，计数，离心，20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
10.1×106个Treg细胞在37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
11.使用不同浓度的调节性T细胞囊泡(0g/L,0-0.1g/L,0.1-5g/L)与单个核细胞(PBMC)细胞在96孔板(每孔供200μl，加3μl磁珠)中进行共培养。单独羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)处理的PBMC细胞设为阴性对照组，CFSE处理的PBMC细胞组(磁珠刺激)设为阳性对照组。
12.流式检测脐血调节性T细胞的抑制功能，如图1所示，不同浓度(Group1和Group2)的脐血调节性T细胞囊泡抑制CFSE标记的PBMC增殖的示意图，未经囊泡处理组设为对照组(Control)。图1右表示对三组的结果进行作图分析。结果表明脐血调节性T细胞囊泡具有抑制炎症细胞的增殖能力。
二、调节性T细胞囊泡促进血管内皮细胞的迁移能力实验。
1.培养板划线：在6孔培养皿的底部均匀横向划线，每孔各三条，用于后续镜下拍照定位；
2.铺细胞：每孔中加入约5×105个细胞；
3.细胞划线：待细胞生长融合至80％时，用无菌枪头在细胞表面均匀划三条
纵向线，与平板背面的划线垂直，左、中、右各3个划痕；
4.洗细胞：划痕完成后，使用1×PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗细胞3次，洗去漂浮的细胞，以便划痕
间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基；
5.用不同浓度(0g/L,0-0.1g/L,0.1-5g/L)的调节性T细胞囊泡处理，细胞培养、观察：将细胞放入37℃，5％ CO2培养箱培养。然后在0h和培养24h后取出培养皿，在显微镜下观察并拍照。
6.结果分析：使用Image J软件计算细胞划痕宽度的均值。结果表明，较对照组，0-0.1g/L(group1),0.1-5g/L(group2)调节性T细胞囊泡促进血管内皮细胞的迁移能力，如图2所示，图2左表示不同浓度(Group1和Group2)的脐血调节性T细胞囊泡抑制血管内皮细胞迁移能力的示意图，未经囊泡处理组设为对照组(Control)。图1右表示对三组的结果进行作图分析。结果表明脐血调节性T细胞囊泡具有抑制血管内皮细胞迁移的能力。
三、调节性T细胞囊泡复合水凝胶在促进糖尿病创口愈合的实验。
1.制备糖尿病小鼠创口模型：选取C57小鼠纳入试验，随机分为对照组(不含调节性T细胞囊泡的水凝胶处理组)和实验组(含调节性T细胞囊泡复合水凝胶处理组)。腹腔注射STZ40mg/kg，连续5天，结束最后一次注射后，随机血糖＞16.7mmol/L认为造模成功。按照以下步骤处理小鼠创面：配置1％的戊巴比妥溶液；小鼠腹腔注射麻醉(40mg/kg),麻醉好后在超净台中剔除背部毛发；创面标记处用碘伏消毒，用眼科剪在小鼠背部剪出1.0×1.0cm2的全层皮肤缺损创面；
2.将本实施例制备的脐血调节性T细胞囊泡按照2.5g/L的浓度与水凝胶混合均匀后移植于小鼠创面，1.0×1.0cm2的创面每次使用75μL混合水凝胶；对照组移植等量不含脐血调节性T细胞囊泡的水凝胶；每天移植一次，连续移植4次。
3.小鼠术前和术后第5、7天拍照观察创口愈合情况。结果显示，较对照组相比(control组)，调节性T细胞囊泡(Treated组)复合水凝胶能明显促进伤口的愈合，如图3所示。
四、调节性T细胞囊泡复合水凝胶在促进普通创口愈合的实验。
1.制备小鼠创口模型：选取C57小鼠纳入试验，随机分为对照组(不含调节性T细胞囊泡的水凝胶处理组)和实验组(含调节性T细胞囊泡复合水凝胶处理组)。按照以下步骤处理小鼠创面：配置1％的戊巴比妥溶液；小鼠腹腔注射麻醉(40mg/kg),麻醉好后在超净台中剔除背部毛发；创面标记处用碘伏消毒，用眼科剪在小鼠背部剪出1.0×1.0cm2的全层皮肤缺损创面；
2.将本实施例制备的脐血调节性T细胞囊泡按照2.5g/L的浓度与水凝胶混合均匀后移植于小鼠创面，1.0×1.0cm2的创面每次使用75μL混合水凝胶；对照组移植等量不含脐血调节性T细胞囊泡的水凝胶；每天移植一次，连续移植4次。
3.小鼠术前和术后第7天观察创口愈合情况。结果显示，较对照组相比(control组)，调节性T细胞囊泡(Treated组)复合水凝胶能明显促进伤口上皮细胞和纤维组织的增生，如图4所示(HE染色法，即是苏木精-伊红染色法。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色、蛋白性液体呈粉红色。Masson染色是结缔组织染色中最经典的一种方法，Masson染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。)
虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件，尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (10)
1.一种调节性T细胞囊泡复合水凝胶，其特征在于，包括调节性T细胞囊泡和水凝胶，所述调节性T细胞囊泡与水凝胶的质量体积比为：0.5～5g/L。
2.根据权利要求1所述的调节性T细胞囊泡复合水凝胶，其特征在于：所述水凝胶为医用水凝胶。
3.一种调节性T细胞囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(3)取步骤(2)所得上清，再次进行至少一次离心处理，收集沉淀，获得调节性T细胞囊泡。
4.根据权利要求3所述的调节性T细胞囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的至少一次离心处理包括：
取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，进行第一次离心处理，去除沉淀，收集上清；
取第一次离心处理所得上清，进行第二次离心处理，去除凋亡体和细胞碎片，再次获得上清。
5.根据权利要求4所述的调节性T细胞囊泡的制备方法，其特征在于，所述第一次离心处理的条件为：温度0～10℃，离心力200～500g，时间10～20min。
6.根据权利要求4所述的调节性T细胞囊泡的制备方法，其特征在于，所述第二次离心处理的条件为：温度4～25℃，离心力500～10000g，时间10～30min。
7.根据权利要求3所述的调节性T细胞囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的至少一次离心处理包括：
取步骤(2)中最后一次离心所得上清，进行第N次离心处理，去除上清，获得调节性T细胞囊泡沉淀；
取所述脐血调节性T细胞囊泡沉淀，进行第N+1次离心处理，去除上清，获得调节性T细胞囊泡，其中，N为大于等于3的整数。
8.根据权利要求7所述的调节性T细胞囊泡的制备方法，其特征在于，第N次离心处理与第N+1次离心处理的条件为：温度为4～25℃，离心力3000～20000g，时间为10～60min。
9.一种如权利要求1或2所述的调节性T细胞囊泡复合水凝胶在促进创面愈合中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述创面包括普通创面或糖尿病创面。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN110891969A (zh) * | 2017-03-20 | 2020-03-17 | 四方控股公司 | 调节免疫细胞的方法和组合物 |
| WO2021225260A1 (ko) * | 2020-05-04 | 2021-11-11 | 주식회사 이뮤니스바이오 | 조절 t 세포 배양액을 포함하는 상처치유용 조성물 |
| CN114224917A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-25 | 中国人民解放军空军军医大学 | 间充质干细胞凋亡微囊泡联合水凝胶在制备哺乳动物皮肤修复产品中的应用 |
| CN115305237A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-11-08 | 中南大学 | 一种优化的调节性t细胞的扩增及规模化生产的方法 |
-
2022
- 2022-12-12 CN CN202211597727.3A patent/CN115737543A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110891969A (zh) * | 2017-03-20 | 2020-03-17 | 四方控股公司 | 调节免疫细胞的方法和组合物 |
| WO2021225260A1 (ko) * | 2020-05-04 | 2021-11-11 | 주식회사 이뮤니스바이오 | 조절 t 세포 배양액을 포함하는 상처치유용 조성물 |
| CN114224917A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-25 | 中国人民解放军空军军医大学 | 间充质干细胞凋亡微囊泡联合水凝胶在制备哺乳动物皮肤修复产品中的应用 |
| CN115305237A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-11-08 | 中南大学 | 一种优化的调节性t细胞的扩增及规模化生产的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIAYI YANG ET AL.: ""Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Combined Pluronic F127 Hydrogel Promote Chronic Diabetic Wound Healing and Complete Skin Regeneration"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》, vol. 15, 11 August 2020 (2020-08-11), pages 5911 - 5926 * |
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