CN115103904A - 外周血原料的采集/冷冻融化工序中的单核细胞纯化法 - Google Patents

外周血原料的采集/冷冻融化工序中的单核细胞纯化法 Download PDF

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Abstract

本发明提供单核细胞的制造，该单核细胞是用于在成人T细胞白血病等的治疗药的制造中使用的树突状细胞的原料。本发明提供由血液试样生产单核细胞试样的方法、以及通过这些方法制造的单核细胞试样、由该单核细胞试样诱导的树突状细胞、再生医疗等制品，所述方法包括：从受试者获得血液试样的工序；以及将该血液试样基于比重及细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。本发明还提供成人T细胞白血病(ATL)患者的治疗。

Description

外周血原料的采集/冷冻融化工序中的单核细胞纯化法
技术领域
本发明涉及新型单核细胞制备技术。更特定而言，本发明涉及外周血原料的采集/冷冻融化工序中的单核细胞纯化法。特别是，本发明提供一种最适合制造适于治疗成人T细胞白血病(ATL)的树突状细胞制剂(特别是进行了Tax抗原肽脉冲的再生医疗等制品)的技术。
背景技术
在一般临床中，在造血干细胞移植中所使用的单采原料的组成主要有作为血细胞成分的淋巴细胞、单核细胞及伴随采集而混入的嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、血浆。
对于由单采原料的冷冻融化产生的影响，根据每种成分而不同，特别是嗜中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞会因冷冻压力而导致脆弱性的问题，血小板会因伴随活化诱发凝固而形成的聚集块而导致单核细胞的损失。因此，在利用单采进行的原料采集中，尽可能避免这些成分的混入来采集单核细胞纯度高的原料，这大大关系到其后的制品的收量、品质。
发明内容
用于解决课题的技术手段
本发明涉及作为ATL治疗制品的树突状细胞制品(例如，ATL-DC-101)的制造，包括：外周血单核细胞采集工序及冷冻原料融化后的比重离心工序中的单核细胞纯化法。本发明的树突状细胞制品包括：由外周血单核细胞成分(单采原料)中所含的单核细胞诱导树突状细胞、且进行了靶标Tax抗原肽脉冲而得的再生医疗等制品。本发明的制品是自体的树突状细胞制品，因此会产生将患者单采原料搬送至制造设施的工序，但在新鲜原料的情况下，由搬送引起的原料的品质变化、由搬送中的风险(交通情况、人为事故、自然灾害等)引起的伴随搬送时间延长的品质劣化、原料内的HTLV-1病毒感染扩大成为问题(在ATL患者单采检体中包含HTLV-1感染细胞)。因此，为了治疗的普及，需要确立将患者单采原料冷冻并搬送至制造设施、由冷冻原料来制备树突状细胞的制造法。如果通过本发明能够实现从冷冻原料纯化单核细胞，则对于在距离制造设施偏远的地区的患者也能够普及治疗。
本发明例如提供以下方案。
(方案1)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；以及
2)将该血液试样基于比重及细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
(方案2)根据上述方案所述的方法，其中，上述工序2)将上述血液试样基于比重进行单核细胞浓缩，接着，基于细胞尺寸进行单核细胞浓缩。
(方案3)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血细胞浓度低于规定值的血液试样的工序；以及
2)将该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
(方案4)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层(buffy coat)的值。
(方案5)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好(collection preference)来调整。
(方案6)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案7)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～20。
(方案8)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好的规定值为30～50(例如，30、40、50)。
(方案9)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～20。
(方案10)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为40～70(例如，40、50、60、70)。
(方案11)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，在上述浓缩工序中，包含进行溢出(spillover)的步骤。
(方案12)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；以及
2)从该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序，在该浓缩工序中，包括使淋巴细胞级分溢出以将淋巴细胞级分除掉。
(方案13)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，对于上述溢出，在作为溢出将红细胞从腔室持续地溢出的时刻的处理血液量(基准处理血液量)的值设定为1的情况下，上述溢出能够将处理血液量设定为比基准处理血液量大的值来实施。
(方案14)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述处理血液量为上述基准处理血液量的至少1.2倍。
(方案15)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述单核细胞试样是由从上述受试者获得的血细胞试样直接获得的试样。
(方案16)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述浓缩在从上述受试者获得上述血液试样之后5小时以内进行。
(方案17)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述基于细胞尺寸的分离在上述基于比重的分离之后3小时以内进行。
(方案18)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述单核细胞试样包含相对于全部有核细胞为约30％以上的浓度的单核细胞。
(方案19)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)从受试者获得血液试样的工序；2)向该血液试样中添加冷冻保护剂的工序；以及3)将加有该冷冻保护剂的该血液试样基于比重进行分离，获得比淋巴细胞重的级分的工序。
(方案20)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述血液试样是经过单采分离(apheresis separation)的试样。
(方案21)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述冷冻保护剂包含选自羟乙基淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨糖醇及葡聚糖中的成分。
(方案22)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述浓缩在冷冻保存后进行。
(方案23)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述基于比重的分离以1.074～1.076、优选1.075的比重进行离心分离。
(方案24)根据方案19～23中任一项所述的方法，其中，上述基于比重的分离通过以下的离心分离条件来进行：
第1次离心分离225mL离心管300×g～400×g(例如，350×g)5分钟室温
第2～3次离心分离225mL离心管250×g～350×g(例如，300×g)5分钟室温。
(方案25)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述浓缩在进行上述方案中任一项所述的单采处理之后进行。
(方案26)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)由所得到的血液试样获得包含冷冻保护剂的单核细胞试样的工序；以及
2)将该单核细胞试样用洗涤液进行洗涤的工序，所述洗涤液包含10％以下的含有柠檬酸钠水合物的血液保存液A液ACD-A液。
(方案27)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述ACD-A液以6％以下存在。
(方案28)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述ACD-A液以5.5％存在。
(方案29)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将上述血液试样用洗涤液进行洗涤，所述洗涤液具有5.5％ACD-A液/1％人血清白蛋白(HSA)/RPMI-1640的组成。
(方案30)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括进行死细胞除去处理。
(方案31)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述死细胞除去处理包括将淋巴细胞及血小板也除去。
(方案32)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述死细胞除去处理包含比重离心分离。
(方案33)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述比重离心分离使用密度介质碘克沙醇(Iodixanol)水溶液来进行。
(方案34)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述碘克沙醇水溶液以60w/v％来提供。
(方案35)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述浓缩在无添加DNase或添加DNase的情形下进行。
(方案36)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述DNase包含阿法链道酶(Pulmozyme)。
(方案37)一种生产Tax特异性树突状细胞的方法，其包括：由通过上述方案中任一项所述的方法得到的单核细胞试样诱导树突状细胞的工序；以及对该诱导的树突状细胞进行Tax抗原肽脉冲的工序。
(方案38)一种生产再生医疗等制品的方法，其包括下述工序：将使通过上述方案中任一项所述的方法生产的上述Tax特异性树突状细胞悬浮于冷冻保护液中而得到的物质填充到容器(冻存管(Cryo Tube)或冻存袋(Cryo Bag)等)中，制成再生医疗等制品。
(方案39)一种再生医疗等制品，其是通过上述方案中任一项所述的方法生产的。
(方案40)一种生产单核细胞含有物的系统，其包含具有调整血细胞浓度的功能的单采装置、实现溢出的机构、将细胞进行尺寸分离的尺寸分离部、投入冷冻保护剂的冷冻保护剂投入部、基于比重进行单核细胞分离的单核细胞分离部、和死细胞除去机构中的至少一者。
(方案41)根据方案40所述的系统，其中，所述系统还包含上述方案中任一项或多项所述的至少一个特征。
(方案42)根据方案40或41所述的系统，其中，所述系统还包含基于比重的分离部、冷冻保存细胞的冷冻保存部、进行解冻洗涤的解冻洗涤部、和进行比重离心分离的比重离心分离部中的至少一者。
进而，本发明还提供以下的方案。
(方案A1)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；以及
2)将该血液试样基于比重及细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
(方案A2)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述工序2)将上述血液试样基于比重进行单核细胞浓缩，接着，基于细胞尺寸进行单核细胞浓缩。
(方案A3)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血细胞浓度低于规定值的血液试样的工序；以及
2)将该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
(方案A4)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
(方案A5)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
(方案A6)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案A7)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～20。
(方案A8)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好的规定值为30～50。
(方案A9)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
(方案A10)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
(方案A11)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为40～80(40、50、60、70、80)。
(方案A12)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，在上述浓缩工序中，包括进行溢出的步骤。
(方案A13)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；以及
2)从该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序，在该浓缩工序中，包括使淋巴细胞级分溢出以将淋巴细胞级分除掉。
(方案A14)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，对于上述溢出，在作为溢出将红细胞从腔室持续地溢出的时刻的处理血液量(基准处理血液量)的值设定为1的情况下，上述溢出能够将处理血液量设定为比基准处理血液量大的值来实施。
(方案A15)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述处理血液量为上述基准处理血液量的至少1.2倍。
(方案A16)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述单核细胞试样是由从上述受试者获得的血细胞试样直接获得的试样。
(方案A17)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述浓缩在从上述受试者获得上述血液试样之后5小时以内进行。
(方案A18)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述基于细胞尺寸的分离在上述基于比重的分离之后3小时以内进行。
(方案A19)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述单核细胞试样包含相对于全部有核细胞为约30％以上的浓度的单核细胞。
(方案A20)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；
2)向该血液试样中添加冷冻保护剂的工序；以及
3)将加有该冷冻保护剂的该血液试样基于比重进行分离，获得比淋巴细胞重的级分的工序。
(方案A21)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述血液试样是经过单采分离的试样。
(方案A22)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述冷冻保护剂包含选自羟乙基淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨糖醇及葡聚糖中的成分。
(方案A23)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述浓缩在冷冻保存后进行。
(方案A24)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述基于比重的分离以1.074～1.076的比重进行离心分离。
(方案A25)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述基于比重的分离通过以下的离心分离条件来进行：
第1次离心分离225mL离心管300×g～400×g 5分钟室温
第2～3次离心分离225mL离心管250×g～350×g 5分钟室温。
(方案A26)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述浓缩在进行上述方案中任一项所述的单采处理之后进行。
(方案A27)一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)由所得到的血液试样获得包含冷冻保护剂的单核细胞试样的工序；以及
2)将该单核细胞试样用洗涤液进行洗涤的工序，所述洗涤液包含10％以下的含有柠檬酸钠水合物的血液保存液A液(ACD-A液)。
(方案A28)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述ACD-A液以6％以下存在。
(方案A29)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述ACD-A液以5.5％存在。
(方案A30)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将上述血液试样用洗涤液进行洗涤，所述洗涤液具有5.5％ACD-A液/1％人血清白蛋白(HSA)/RPMI-1640的组成。
(方案A31)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括进行死细胞除去处理。
(方案A32)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述死细胞除去处理包括将淋巴细胞及血小板也除去。
(方案A33)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述死细胞除去处理包括比重离心分离。
(方案A34)根据上述方案中任一项所述的方法，其特征在于，上述比重离心分离使用密度介质碘克沙醇(Iodixanol)水溶液来进行。
(方案A35)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述碘克沙醇水溶液以60w/v％来提供。
(方案A36)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述浓缩在无添加DNase或添加DNase的情形下进行。
(方案A37)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述DNase包含阿法链道酶。
(方案A38)一种生产Tax特异性树突状细胞的方法，其包括：
由通过上述方案中任一项所述的方法得到的单核细胞试样诱导树突状细胞的工序；以及
对该诱导的树突状细胞进行Tax抗原肽脉冲的工序。
(方案A39)一种生产再生医疗等制品的方法，其包括下述工序：将使通过方案A38所述的方法生产的上述Tax特异性树突状细胞悬浮于冷冻保护液中而得到的物质填充到冻存管中，制成再生医疗等制品。
(方案A40)一种再生医疗等制品，其是通过方案A39所述的方法生产的。
(方案A41)一种生产单核细胞含有物的系统，其包含具有调整血细胞浓度的功能的单采装置、实现溢出的机构、将细胞进行尺寸分离的尺寸分离部、投入冷冻保护剂的冷冻保护剂投入部、基于比重来进行单核细胞分离的单核细胞分离部、和死细胞除去机构中的至少一者。
(方案A42)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，所述系统还包含基于比重的分离部、冷冻保存细胞的冷冻保存部、进行解冻洗涤的解冻洗涤部、和进行比重离心分离的比重离心分离部中的至少一者。
(方案A43)一种方法，其是治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
(方案A44)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
(方案A45)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
(方案A46)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案A47)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
(方案A48)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好的规定值为30～50。
(方案A49)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
(方案A50)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
(方案A51)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为40～80(40、50、60、70、80)。
(方案A52)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
(方案A53)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出单核细胞的工序包含方案A1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
(方案A54)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出淋巴细胞的工序包含方案A43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，上述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
(方案A55)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
(方案A56)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出淋巴细胞的工序将上述采集偏好设定为30～50来实施。
(方案A57)一种程序，其是使电脑执行治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法的程序，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
(方案A58)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
(方案A59)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
(方案A60)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案A61)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
(方案A62)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述采集偏好的规定值为30～50。
(方案A63)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
(方案A64)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
(方案A65)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述采集偏好被设定为40～80(40、50、60、70、80)。
(方案A66)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
(方案A67)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述取出单核细胞的工序包含方案A1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
(方案A68)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述取出淋巴细胞的工序包含方案A43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，上述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
(方案A69)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
(方案A70)根据上述方案中任一项所述的程序，其中，上述取出淋巴细胞的工序将上述采集偏好设定为30～50来实施。
(方案A71)一种记录介质，其是存储如下程序的记录介质，该程序使电脑执行治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
(方案A72)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
(方案A73)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
(方案A74)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案A75)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
(方案A76)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述采集偏好的规定值为30～50。
(方案A77)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
(方案A78)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
(方案A79)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述采集偏好被设定为40～80(40、50、60、70、80)。
(方案A80)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
(方案A81)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述取出单核细胞的工序包含方案A1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
(方案A82)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述取出淋巴细胞的工序包含方案A43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，上述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
(方案A83)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
(方案A84)根据上述方案中任一项所述的记录介质，其中，上述取出淋巴细胞的工序将上述采集偏好设定为30～50来实施。
(方案A85)一种系统，其是用于治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的系统，所述系统包含：
1)从该患者获得血液试样的试样取得部；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的测定部；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的同等试样取得部，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
(方案A86)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
(方案A87)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
(方案A88)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案A89)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
(方案A90)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述采集偏好的规定值为30～50。
(方案A91)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
(方案A92)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
(方案A93)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述采集偏好被设定为40～80(40、50、60、70、80)。
(方案A94)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
(方案A95)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述取出单核细胞的工序包含方案A1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
(方案A96)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述取出淋巴细胞的工序包含方案A43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，上述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
(方案A97)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
(方案A98)根据上述方案中任一项所述的系统，其中，上述取出淋巴细胞的工序将上述采集偏好设定为30～50来实施。
(方案A99)一种方法，其是用于治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的系统的操作方法，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的试样取得部；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的测定部；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的同等试样取得部，
该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
(方案A100)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
(方案A101)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
(方案A102)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
(方案A103)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
(方案A104)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好的规定值为30～50。
(方案A105)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
(方案A106)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
(方案A107)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述采集偏好被设定为40～80(40、50、60、70、80)。
(方案A108)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
(方案A109)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出单核细胞的工序包含方案A1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
(方案A110)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出淋巴细胞的工序包含方案A43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，上述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
(方案A111)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
(方案A112)根据上述方案中任一项所述的方法，其中，上述取出淋巴细胞的工序将上述采集偏好设定为30～50来实施。
在本发明中，对于上述的一个或多个特征，除了已写明的组合以外，还可进一步组合来提供。本领域技术人员只要根据需要阅读以下的详细说明而加以理解，便可认识到本发明的进一步的实施方式及优点。
发明效果
通过本发明，能够提供作为再生医疗等制品可期待显著的治疗效果的成人T细胞白血病(ATL)治疗。
附图说明
图1表示实施例5的有阿法链道酶处理的融化洗涤后试样的流式细胞术(flowcytometry)结果。
图2是表示实施例5的有阿法链道酶处理的OptiPrep处理后的单核细胞的质量及纯度的结果。
图3表示实施例5的无阿法链道酶处理的融化洗涤后试样的流式细胞术结果。
图4是表示实施例5的无阿法链道酶处理的OptiPrep处理后的单核细胞的质量及纯度的结果。
图5是确认实施例6中得到的树突状细胞(有阿法链道酶)的特性的图。图5表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。如图5中所示的那样，表示FSC-H、FSC-A、SSC-A(活细胞和无双联体(living cells and doublet-free))、在DC门中的CD11c、CD14、HLA-DR、在Lymp门中的CD11c、CD14及HLA-DR。
图6是确认实施例6中得到的树突状细胞(有阿法链道酶)的特性的图。图6表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。如图6中所示的那样，表示FSC-H、FSC-A、SSC-A(活细胞和无双联体)、在DC门中的CD11c、CD40、CD83、在Lymp门中的CD11c、CD40、CD83。
图7是确认实施例6中得到的树突状细胞(有阿法链道酶)的特性的图。图7表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。如图7中所示的那样，表示FSC-H、FSC-A、SSC-A(活细胞和无双联体)、在DC门中的CD11c、CD80、CD86、在Lymp门中的CD11c、CD80、CD86。
图8是确认实施例6中得到的树突状细胞(无阿法链道酶)的特性的图。图8表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。如图8中所示的那样，表示FSC-H、FSC-A、SSC-A(活细胞和无双联体)、在DC门中的CD11c、CD14、HLA-DR、在Lymp门中的CD11c、CD14及HLA-DR。
图9是确认实施例6中得到的树突状细胞(无阿法链道酶)的特性的图。图9表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。如图9中所示的那样，表示FSC-H、FSC-A、SSC-A(活细胞和无双联体)、在DC门中的CD11c、CD40、CD83、在Lymp门中的CD11c、CD40、CD83。
图10是确认实施例6中得到的树突状细胞(无阿法链道酶)的特性的图。图10表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。如图10中所示的那样，表示FSC-H、FSC-A、SSC-A(活细胞和无双联体)、在DC门中的CD11c、CD80、CD86、在Lymp门中的CD11c、CD80、CD86。
图11表示实施例8的MLR的结果。其是将以CFSE标记的CD4细胞(CFSE-CD4)和树突状细胞(DC)分别以CFSE-CD4:DC＝1:0、1:0.1、1:0.01、1:0.001的比率混合并单独培养或共培养后以抗CD3抗体及抗CD4抗体标记的试样的流式细胞术结果(特别是CD4)。P2Exp14、P2Exp21-S、P2Exp21-P分别使用了通过使用以往法的工序得到的树突状细胞(DC)、使用本发明的方法以无DNase处理的工序得到的DC、使用本发明的方法以有DNase处理的工序得到的DC。
图12表示实施例4的方案(protocol)示意图。
图13表示实施例5的抗体染色的抗体表。
图14表示本发明的制造法的示意图。
具体实施方式
以下，对本发明进一步进行详细说明。
在整个说明书中，只要没有特别说明，单数形式的表达应理解为也包括其复数形式的概念。因此，只要没有特别说明，单数形式的冠词(例如，在英语的情况下为"a"、"an"、"the"等)应理解为也包括其复数形式的概念。另外，只要没有特别说明，本说明书中所使用的术语应理解为以该领域中通常所用的含义使用。因此，只要没有其他定义，本说明书中所使用的所有专业术语和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
(定义)
首先对本发明中使用的术语及一般的技术进行说明。
(关于人T细胞白血病病毒(HTLV))
人T细胞白血病病毒(HTLV)是作为人的成人T细胞白血病·淋巴瘤(ATL)的原因而公知的逆转录病毒。作为起因于人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)的疾病，代表性的是ATL，此外有时还会引起HTLV-1相关脊髓病、HTVL-1葡萄膜炎。对于HTLV，可列举出HTLV-1、HTLV-2、HTLV-3等多个类型。其中HTLV-1具有长度约为9kb的原病毒(provirus)基因。HTLV-1的原病毒基因编码Tax、Rex、gag、pol、env等各种蛋白质。其中Tax蛋白质具有全长约353个氨基酸残基，具有在宿主细胞内活化NF-κB、SRF、CREB等宿主的转录因子、抑制p53等蛋白质的功能等多个功能。
作为HTLV-1的生物体内的感染对象细胞，具体而言，可列举出CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、树突状细胞。这些细胞若感染HTLV-1，则介由主要组织相容性基因复合体(MHC)而呈递HTLV-1所编码的Tax等蛋白质的部分肽(例如Tax部分肽)。因此，作为HTLV-1相关疾病例如ATL的有用免疫疗法，报道了下述免疫疗法：其使用在生物体内能够引起免疫应答的CD4+T细胞、CD8+T细胞(也称为CD8+细胞损伤性T细胞、CD8+CTL)，这些细胞是以呈递该HTLV-1特异性的部分肽的细胞(即HTLV-1感染细胞)作为靶标的细胞(日本特开2008-22702、日本特开2014-133712、Miyazaki et al.，Blood 2013121:4894-4901等)。
本发明的单核细胞是为了诱导树突状细胞而使用的，那样的树突状细胞可以通过HTLV-I特异性细胞损伤性T淋巴细胞(CTL)诱导活性肽等进行脉冲刺激。作为这样的肽，只要是具有诱导CTL(对HTLV-I特异性)的活性的肽则没有特别限制，其中，可适宜例示出Tax特异性的CTL诱导活性肽，其中，可特别适宜例示出HLA-A24:02限制性CTL表位即Tax301-309(参照国际公开第2004/092373号小册子)等。这里，例如，针对HLA-A11:01的Tax肽是成为本树突状细胞疗法的靶标的肽之一，需要说明的是，如果改变靶标，则为了各种癌、免疫控制目的也可以使用树突状细胞本身。TCR改变型T细胞是仅以针对HLA-A24的肽作为靶标的细胞，在本发明中，也包含以Tax 301-309作为靶标的情况。例如，在本发明中，可以将HLA-A24:01、HLA-A02:01、HLA-A02:07、HLA-A11:01设定为对象，可以利用如下的树突状细胞，该树突状细胞将在体内能够对靶标进行攻击的T细胞进行HLA限制性地刺激并使之活化。
近年来，已知通过对受试对象施用融合肽(使针对作为辅助性T细胞的CD4+T细胞的癌抗原表位与针对作为CTL的CD8+T细胞的癌抗原表位结合而成)(Helper/Killer-Hybrid Epitope Long peptide)，从而有效地提高针对受试对象的癌细胞的免疫(例如Cancer Science(2012)103，150-153等)。本发明中，通过使用适宜的氨基酸序列的肽，也能够在诱导HTLV-I特异性CD4+T细胞的同时诱导HTLV-I特异性CTL，有效地提高针对HTLV-I的免疫。此外，认为可以使用与Tax对应的适宜氨基酸序列的肽作为脉冲来制造Tax脉冲树突状细胞。
(树突状细胞及单核细胞)
已知树突状细胞(DC)是用于在人体中引发及控制细胞性免疫应答的强力的抗原呈递细胞。对于树突状细胞，有时也依赖于在与T细胞的应答性特异性克隆的相互作用时表达其潜在特性的哪些组合、而变成免疫赋活性或免疫抑制性，因此认为树突状细胞在T细胞介导性免疫反应中发挥非常重要的中心作用。作为广义上被广泛支持的一般见解，认为未成熟树突状细胞与它们的更成熟的对应物相比为“免疫耐受原性”，另一方面成熟树突状细胞与它们的未成熟前体相比为“免疫原性”。树突状细胞由单核细胞在体外(ex vivo)生成、具有特定的抗原，在任意免疫学方向上均有效地发挥功能的树突状细胞的能力依赖于返回到患者之后的它们的存活率及活力。对抗性的免疫赋活与免疫抑制树突状细胞之间的均衡被视为树突状细胞依赖性治疗用免疫应答的方向及强度这两者的主要决定要因。
正常人的血液一般包含红细胞(“RBC”，其是数量最多且密度最高的细胞)、血小板(“PLT”，其是数量最少且最小密度的细胞)、白细胞(“WBC”，其是最大细胞且具有RBC与PLT之间的密度)和血浆。这三个细胞级分在离心中分离成单独的集团。平均而言，RBC构成个体的全血细胞的约99.9％，占个体内的全血量的约45％，但周知的是其在个体间不同、并且在同一个体内随着时间的经过而不同。RBC作为向身体组织搬运氧的主要机构而发挥重要功能，但对于用于对抗癌症等特定疾病的组织再生或免疫系统增强是没有用的。个体血液量的剩余的几乎全部由占全血量的约55％的作为非细胞性液体的血浆构成，其中悬浮着全部的血液细胞。因此，通常血液量的99％以上由血浆及红细胞构成。
剩余的约<0.6％的正常血液量由WBC及血小板(PLT)构成。PLT是数目比WBC多约30倍的不规则形状的小的核细胞。PLT通过放出阻止出血、修复和再生损伤组织的许多成长因子而在止血及治愈中发挥基本作用。但是，由于它们的粘附性，会妨碍稀少且在临床上重要的靶细胞的有效的富集及纯化。并非最广分布的血液细胞是WBC，仅占典型血液样品中的全细胞的很少部分即约千分之一。WBC对于身体的免疫系统是不可或缺的，参与针对感染症、异物以及血液学肿瘤癌及实体肿瘤癌的身体防卫。在免疫疗法或再生医疗中在临床上被利用的细胞的几乎全部存在于WBC级分内。WBC也可以进一步分成亚群。最大并且密度最高的亚群为粒细胞(GRN)，占全部WBC的约60％。较小并且密度较低的亚群为单核细胞(MNC)，构成剩余的约40％。MNC可进一步分离成淋巴细胞及单核细胞，但由于它们存在于单一且圆形的核的各细胞内，因此被统称为MNC。MNC是免疫系统的重要构成要素，包含T细胞、B细胞及NK细胞，所述NK细胞移动至身体组织的感染部位而分割并分化成巨噬细胞及树突状细胞以诱发免疫应答。目前在临床试验中所研究的许多细胞疗法利用MNC级分中存在的细胞。本发明中，优选进一步将其中的单核细胞分离而制成树突状细胞诱导的原料。
本说明书中“血液试样”可以以从受试者获得的任意的血液作为对象。在单采的情况下，由于通常将全血进行分级，因此作为血液试样，包含全血，但并不限定于此。已经作为包含单核细胞的级分而制备的物质(例如，成分献血后的含单核细胞的试样)也可以在本发明中作为血液试样来使用。
本说明书中所谓“血细胞浓度”是指在某个试样中血细胞所占的浓度。血细胞浓度也可以通过本说明书中使用的采集偏好来表现，在采集偏好高的情况下可以表现为血细胞浓度低，在采集偏好低的情况下可以表现为血细胞浓度高。
本说明书中“采集偏好”是指在单采装置中为了调整血浆泵流量(其对在采集端口内流动的血细胞浓度产生影响)而使用的参照值，是用于着眼于所采集的血液试样的、特别是血细胞所占的浓度而贴标签的指标。需要与患者的白细胞数及血小板数相关，以便使血细胞有效地从通道通过泵送入。在采集偏好高的情况下可以表现为血细胞浓度低，在采集偏好低的情况下可以表现为血细胞浓度高。通常，在患者的血细胞数多的情况下，需要减小采集偏好(颜色变深)。此外，在患者的血细胞数少的情况下，需要增大采集偏好(颜色变浅)。代表性而言，可以通过采集偏好＝60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]来设定。
本说明书中，“单核细胞(Monocyte)”为白细胞的一种，是最大类型的白细胞。是指可以分化成巨噬细胞、树突状细胞的细胞。单核细胞也作为脊椎动物的自然免疫的一部分，此外，对适应免疫的过程也具有影响。据称在人的血液中存在至少3种单核细胞。
本说明书中所谓“血沉棕黄层”是指血液的密度梯度离心分离后的包含大部分白细胞和血小板的经抗凝固处理的血液样品的一部分。
本说明书中，包含单核细胞的试样可称为“单核细胞试样”。作为这样的单核细胞试样的品质的指标，可以利用有核细胞中的单核细胞的比例。在以往使用的单采中，单核细胞试样的比例大多为10％左右。
本说明书中所谓“浓缩”(enrich、enrichment)是指提高特定细胞(例如，单核细胞)在某个集团(例如，有核细胞)中的比例，也被称为纯化(purify、purification)。例如，在操作前的特定细胞的集团中所占的比例为10％时在操作后提高至30％的情况，符合浓缩或纯化的概念。
(Tax抗原肽脉冲树突状细胞)
本发明的一个特征是提供用于制备再生医疗等制品的原料，该再生医疗等制品是由单采原料中所含的单核细胞诱导树突状细胞、且对成为靶标的Tax抗原肽进行脉冲而得到的。目前，虽然进行了树突状细胞疫苗(其以针对ATL的HTLV-1Tax作为靶标)的开发，并得到了高评价，但是通过使用由本发明提供的单核细胞，能够提供更优质的Tax抗原肽脉冲树突状细胞。
(优选的实施方式)
以下对本发明的优选实施方式进行说明。以下提供的实施方式是为了更好地理解本发明而提供的，不应理解为本发明的范围受到以下记载的限定。因此，本领域技术人员明显能够参考本说明书中的记载在本发明的范围内进行适当地改变。另外，可理解为本发明的以下的实施方式可以单独使用、或者将它们组合来使用。
(单核细胞纯化及树突状细胞制造)
本发明提供一种树突状细胞制造法，其在由冷冻原料实施树突状细胞制造时使用了单采法的改良(淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板混入的降低)及冷冻融化后的比重离心法中的单核细胞纯化工序。本制造法包括以下的工序。
自体外周血单核细胞采集法(单采改良法)
单采原料的冷冻保存·搬送
原料融化·洗涤·离心分离法
比重离心分离法(单核细胞纯化)
粘附法粘附处理后的上清液、悬浮细胞的除去法
树突状细胞诱导
树突状细胞成熟化·活化
首先，通过在单采方面的创新，能够显著提高单核细胞的纯度。此外，冷冻后的单采原料在刚融化后的血细胞尺寸、比重、存活率方面与冷冻前原料相比发生变化。特别是，在积存于细胞内的比重较重的冷冻保护剂的影响下，细胞质较广的单核细胞的比重变重。若添加冷冻保护剂，则单核细胞和淋巴细胞的比重发生变动，因此可以通过离心分离等以比重作为指标的分离来进行分离。利用该性质能够通过离心分离来实现单核细胞的纯化。
随着工序进一步简化、作业时间进一步缩短，能够减轻起因于作业者的调制失误、保持制品的均一性。认为作业者人员的削减及作业时间的缩短关系着上市后的制品制造的人工费的削减，可得到充分的经济性效果。
根据本发明的树突状细胞制造法(使用了基于原料采集及冷冻融化的单核细胞纯化法)，能够成为制造销售及治疗以全国规模进行普及的一大助力。为此，从以下的观点出发，需要建立患者单采检体的原料冷冻、向制造设施搬送的系统以及确立由冷冻原料的制造法。
1)防止由原料内HTLV-1感染细胞向其他非感染细胞的病毒感染扩大
2)防止因搬送引起的原料的品质劣化
3)减轻因搬送时间延长带来的风险：交通情况、人为事故、自然灾害
4)调整患者单采、搬送及制造开始日的计划
5)削减人工费·制造费用
在以上所有方面，本发明都得到改善。
(单采)
本发明提供关于单核细胞的单采改良法，代表性而言，提供自体外周血单核细胞采集法。在此发现了：在单采的改良中，通过将基于比重的分离与基于尺寸的分离组合提高单核细胞的纯度。
在此，为了改良单采，作为例示性装置，可以利用由Terumo提供的Spectra Optia等、通过比重与尺寸的组合来分离血细胞的装置。对于使用了Spectra Optia的单采，作为采集外周血干细胞(CD34阳性细胞)的成分采血装置来使用，在大多情况下，通过不使用二级腔室的CMNC模式进行了采集。为了进一步减少红细胞、血小板混入，可以使用这些二级腔室。
在一个实施方式中，例示出使用了离心型血液成分分离装置(Spectra Optia：Terumo BCT)的外周血单核细胞采集或单核细胞采集。
在一个代表性例子中，为了减轻血小板、红细胞的混入而采集纯度高的单核细胞分级，通过离心型血液成分分离装置(例如，Spectra Optia(Terumo))的二级腔室分离方式(MNC)程序，采用与比重相应的血细胞分离和与细胞尺寸相应的分离的两个阶段的分离工序。采集偏好由装置根据施主外周血信息以自动计算的方式来设定，但通过将采集偏好设定为比自动设定值高+10～20，能够减轻嗜中性粒细胞、红细胞的混入。此外通过调整腔室分离工序时的处理血液量及采集泵速度来减轻血小板混入。进而在该工序中通过使淋巴细胞溢出(spillover)，能够控制淋巴细胞采集率而采集纯度更高的单核细胞。更优选的是：也可以将采集偏好设定为比自动设定值高+20～30。虽然不期望受到理论束缚，但有时因该设定1而需要进一步除去淋巴细胞，在此种情况下，在单核细胞采集后设定为淋巴细胞除去模式，可以追加以偏好自动设定值来进行单采、或将偏好值设定为30～50来进行单采的步骤。作为一个例子，在所使用的机器中，在单核细胞采集后将偏好恢复成自动设定值来进行采集。通过追加本工序，能够除去与在以往的采集时能够除去的淋巴细胞数同等的淋巴细胞。
本说明书中所谓“溢出”是指红细胞从腔室持续地溢出的状态。
在一个实施方式中，对于溢出而言，在作为溢出将红细胞从腔室持续地溢出的时刻的处理血液量(基准处理血液量)的值设定为1的情况下，上述溢出也可以将处理血液量设定为比基准处理血液量大的值来实施。
在一个实施方式中，上述处理血液量可以设定为基准处理血液量的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少3倍、至少4倍等，但并不限定于此。
溢出可以设定适宜条件，但为了设定处理血液量，优选按照降低血小板的混入并抑制嗜中性粒细胞的混入的方式设定。虽然不期望受到理论束缚，但认为由于使其通过通常的处理来采集上层，因此采集次数为1～2次。在分2次进行的情况下，对于全部的处理血液量以采血流量40ml/min×180分钟按照7200ml来计算、并按照将其进行2次采集的方式来计算时，可例示出第1次为约6成且4300ml、第2次为剩余4成且2900ml左右，但并不限定于此。
特征是将以比重进行分离的单采与基于比重及尺寸的分离组合这一点。由此，能够离析高纯度的单核细胞。
比重：血小板<单核细胞<淋巴细胞<嗜中性粒细胞<红细胞
尺寸：血小板<红细胞<单核细胞(淋巴细胞<单核细胞)
本发明的方法代表性地包括以下步骤：
·使用Spectra Optia的腔室来进行尺寸分离。
·Spectra Optia基本上被用于造血干细胞移植用的细胞采集，未使用腔室来进行分离。
·在本发明的发明人们以往进行的单采(仅比重的分离)的情况下，试样中的单核细胞的比例为10～15％左右，与此相对，在使用Spectra Optia的腔室除了进行比重分离以外还进行尺寸分离时，上升至30％左右(采集袋中的浓度。Mo(％)＝单核细胞数/有核细胞数×100)。
此外，血小板及红细胞的比例也变少，制成制剂时变得有利。
·通过将采集偏好设定为比自动设定值(用于采集血沉棕黄层的设定值)高10～20的值，能够取得单核细胞多而嗜中性粒细胞、红细胞的混入少的层。自动设定值的具体的算出方法由60-[(0.2×白细胞数)+(0.08×血小板数)]来决定，通过光的透射率来决定。这里，白细胞数是指受试者的白细胞数(×1000/μL)，血小板数是指受试者的血小板数(×1000/μL)。采集偏好低时采集比重高的层，采集偏好高时则采集比重低的层。
·为了不采集尺寸小的细胞，也可以使腔室溢出(spillover)。在代表性的例子中，理想的是，通过作为溢出将红细胞从腔室持续地溢出的时刻的血液处理量的1.2倍的血液进行处理而使其溢出(spillover)。
如上所述，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括含：
1)从受试者获得血液试样的工序；
2)将该血液试样基于比重及细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
这里，优选的是，特征在于通过将采集偏好设定为比通常情况稍高而将血细胞浓度比通常情况低的部分的该血液试样供于浓缩工序。
优选的实施方式之一是：上述工序2)对于该血液试样基于比重进行单核细胞浓缩、接着基于细胞尺寸进行单核细胞浓缩。作为实现这些的装置，可列举出Spectra Optia(注册)。
在另一方面，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)从受试者获得血液试样的工序；2)由该血液试样中的血细胞浓度比规定值低的部分基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
优选的是：上述血细胞浓度参照采集偏好来调整。上述采集偏好通过60-[(0.2×白细胞数)+(0.08×血小板数)]来设定(白细胞数及血小板数为×1000/μl)。优选的是：实际的设定采集偏好优选比该值高。
上述采集偏好设定为比规定值高10～20。上述规定值是用于取得血沉棕黄层的值(例如，默认值30～50)，上述采集偏好设定为60-[(0.2×白细胞数)+(0.08×血小板数)]+10～20。上述采集偏好也可以设定为40～70。
在一个实施方式中，在浓缩工序中，包括使其溢出的步骤。通过溢出可除去多余的血小板及淋巴细胞。在例示的实施方式中，对于溢出，例如在作为溢出将红细胞从腔室持续地溢出的时刻的处理血液量(基准处理血液量)的值设定为1的情况下，上述溢出可以将处理血液量设定为比基准处理血液量大的值来实施。在一部分实施方式中，上述处理血液量为上述基准处理血液量的至少1.2倍。
在一个实施方式中，溢出在尺寸小的细胞优先溢出的条件下进行。在特定的实施方式中，对于溢出，通过实现溢出的机构来进行。在一部分实施方式中，实现溢出的机构具有红细胞检测器。
在一个方面，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)从受试者获得血细胞浓度低于规定值的血液试样的工序；以及2)将该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
在一个实施方式中，对于上述单核细胞试样，其特征在于，其是由从上述受试者获得的血细胞试样直接获得的试样，上述浓缩在从上述受试者获得上述血液试样之后7小时以内、6小时以内、5小时以内、4小时以内、优选3小时以内进行。
作为其他特征，基于细胞尺寸的分离优选在基于上述比重的分离之后5小时以内、4小时以内、或者3小时以内、2小时以内、1小时以内进行。
上述单核细胞试样能够以约10％以上、约20％以上、或者约30％以上的纯度(相对于有核细胞的比率)包含单核细胞。能够以约40％以上、约50％以上、约60％以上、约70％以上的纯度包含单核细胞也可以是本发明的特征之一。
(冷冻保护剂)
在一个方面，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)从受试者获得血液试样的工序；2)向该血液试样中添加冷冻保护剂的工序；3)将加有冷冻保护剂的该血液试样根据比重进行分离而获得比淋巴细胞重的级分的工序。在一个实施方式中，上述血液试样为经过单采分离的试样。
代表性而言，冷冻保护剂可列举出包含羟乙基淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨糖醇、葡聚糖等成分的物质，例如ReproCryo DMSO Free RM(ReproCELL)、STEM-CELLBANKER(注册商标)DMSO Free GMP Grade(Clontech)等。特别是除了包含DMSO的物质以外，还可优选使用不含DMSO的物质。
在一个方面，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)由所得到的血液试样获得包含冷冻保护剂的单核细胞试样的工序；以及2)将该单核细胞试样用洗涤液进行洗涤的工序，该洗涤液以比通常情况(15％左右)低的浓度例如10％以下包含含有柠檬酸钠水合物等的血液保护剂A((ACD-A液))。这是因为意外地发现在以通常浓度的ACD-A使用时单核细胞试样劣化，可通过以比通常情况(15％左右)低的浓度例如10％以下包含ACD-A，来解决该问题。优选的是：以约9％以下、约8％以下、约7％以下、约6％以下包含ACD-A为理想情况，在一个优选的实施例中，以约5.5％包含ACD-A为理想情况。
在另一方面，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)由所得到的血液试样获得单核细胞试样的工序；以及2)向该单核细胞试样中添加冷冻保护剂后、用洗涤液进行洗涤的工序，该洗涤液以比通常情况(15％左右)低的浓度例如10％以下包含ACD-A。
在另一方面，本发明提供一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：1)由所获得的血液试样获得单核细胞试样的工序；以及2)对该单核细胞试样在冷冻保存后用洗涤液进行融化洗涤的工序，该洗涤液以比通常情况(15％左右)低的浓度例如10％以下包含ACD-A。
在优选的实施方式中，浓缩在冷冻保存后进行。这是因为通过进行冷冻保存，存活率得到显著地改善。特别是作为一个例子，对于血液试样，在添加上述冷冻保护剂之后，用具有5.5％ACD-A/1％HSA/RPMI-1640的组成的洗涤液进行洗涤。作为另一个例子，对于血液试样，在上述冷冻保存后，用具有5.5％ACD-A/1％HSA/RPMI-1640的组成的洗涤液进行融化洗涤。优选ACD-A以6％以下存在，进一步优选ACD-A以5.5％存在。
对于基于比重的单核细胞的分离，只要是具有可根据比重的不同而对单核细胞进行分离的功能，则可以是任意的分离。例如，在以细胞的洗涤为目的而通过离心分离来进行洗涤的情况下，可考虑使用比重液来进行比重分离的情况等，它们也被包含在其中。在一个特定的实施方式中，本发明的基于比重的浓缩工序可包括基于比重离心分离法的工序。在比重离心分离法中，优选的是以1.074～1.076、优选1.075的比重液来进行离心分离。之所以不是通常的1.070～1.073而是成为稍高的比重取决于由冷冻保护剂产生的预料外的影响。需要说明的是，为1.077以上时可见到淋巴细胞的混入，因此不怎么优选。
在其他实施方式中，基于比重的分离通过以下的离心分离条件来进行。
第1次离心分离 225mL离心管 300×g～400×g、例如350×g 5min RT
第2-3次离心分离 225mL离心管 250×g～350×g、例如300×g 5min RT
在一个优选的实施方式中，浓缩在本发明的单采处理之后进行。
冷冻原料的融化洗涤工序的1)洗涤液组成、2)离心条件是重要条件之一。
1)洗涤液组成5.5％ACD-A/1％HSA/RPMI-1640
2)离心条件：
第1次离心 225mL离心管 350g 5min RT
第2-3次离心 225mL离心管 300g 5min RT。
第1次和第2次的这些条件是对于意外地除去淋巴细胞或高效地除去其他血液成分而言有利的条件。通常，以比其高的重力加速度进行离心分离(例如，500×g、700×g)，但在那样高的重力加速度时无法充分除去。
(死细胞等除去)
在本发明中，也可以包括进一步除去淋巴细胞、血小板及死细胞等的工序。也可以仅进行死细胞除去处理、或者除去死细胞、淋巴细胞及血小板。这样的细胞的除去可通过比重离心分离来进行，比重离心分离优选使用密度介质碘克沙醇(Iodixanol)水溶液来进行，进一步优选的是碘克沙醇(Iodixanol)水溶液以60w/v％来提供，能够使用OptiPrep TM。在一个特定的实施方式中，本发明的死细胞等除去可包含基于比重离心分离法的工序。在比重离心分离法中，优选的是以1.074～1.076、优选1.075的比重液进行离心分离。之所以不是通常的1.070～1.073而是成为稍高的比重取决于由冷冻保护剂产生的预料外的影响。需要说明的是，为1.077以上时见到淋巴细胞的混入，因此不怎么优选。
(DNase的有无)
浓缩能够在无添加DNase或添加DNase的情形下进行。DNase包含阿法链道酶(Pulmozyme)。即使没有DNase处理，也能够确保单核细胞的质量及纯度，因此证明了即使是在实际的临床现场中没有DNase的情况下也能够应用。当然，由于DNase在各方面都具有优势，因此可理解为在本发明中并不否定两者。
(系统)
在一个方面，本发明提供一种生产单核细胞含有物的系统，其包含具有调整血细胞浓度的功能的单采装置、将细胞进行尺寸分离的尺寸分离部、实现溢出的机构、投入冷冻保护剂的冷冻保护剂投入部、基于比重来进行单核细胞的分离的单核细胞分离部、和死细胞除去机构中的至少一者。本发明的系统包含它们中的2个、3个、4个或全部。
优选的是本发明的系统的单采装置优选除了比重分离以外还具有细胞尺寸分离的功能，但并不限定于此。可理解为尺寸分离的功能也可以另外提供。作为那样的例子，可列举出Spectra Optia(Terumo)，但并不限定于此。此外，对于单采装置，可以其本身具有调整血细胞浓度的功能，也可以通过追加而具备发挥如下功能的部分，该功能具有调整血细胞浓度的功能。
实现溢出的机构只要是能够控制液量的机构则可以是任意的机构。
将细胞进行尺寸分离的尺寸分离部只要是能够将细胞根据尺寸进行分离，则可以是任意的分离部。
投入冷冻保护剂的冷冻保护剂投入部只要具有能够保管冷冻保护剂、并适当投入到试样中的功能，则可以是任意的投入部。
对于根据比重来分离单核细胞的单核细胞分离部，只要具有可根据比重的不同来分离单核细胞的功能，则可以是任意的分离部。例如，可以考虑为了洗涤细胞而通过离心分离进行洗涤的情况、使用比重液来进行比重分离的情况等，它们也被包含在其中。在比重因冷冻保护剂而变更的情况下，对于单核细胞的分离，以通常的洗涤为目的而通过离心分离来进行洗涤，由此也可达成目的，因此该情况下也可以为离心分离部装置。在使用比重液来进行比重分离的情况下，除了离心分离机以外，也可在该单核细胞分离部中具备比重液。
关于死细胞除去机构，能够除去死细胞的任意的机构均适合，通常为基于比重离心分离的机构，例如，利用使用了密度介质碘克沙醇(Iodixanol)水溶液的机构。碘克沙醇(Iodixanol)水溶液优选以60w/v％来提供。
该系统也可以进一步具备基于比重的分离部、冷冻保存细胞的冷冻保存部、进行解冻洗涤的解冻洗涤部或将冷冻后的细胞融化的细胞融化部、进行上述的比重离心分离的比重离心分离部、诱导树突状细胞的机构、进行脉冲刺激的机构、制备再生医疗等制品的机构等中的一个或多个或者全部。
这些系统也可以通过电脑进行自动控制或者手动来控制。
系统可具备用于使电脑执行本说明书中记载的方法的程序，例如可具备存储此种程序的记录介质。此外，可具备计算装置(例如，电脑)，用于执行通过程序来指示的命令。计算装置可以在物理上一体化，或者也可以包含在物理上分离的多个构成要素。在这些计算装置的内部，可根据需要具备与学习部、计算部及取得部等相对应的功能。
本发明的系统能够以超多功能LSI(将多个构成部集成在1个芯片上而制造)的形式来实现，具体而言，可以是包含微处理器、ROM(Read Only Memory；只读存储器)、RAM(Random Access Memory；随机存取存储器)等而构成的电脑系统。在ROM中存储有电脑程序。通过使上述微处理器按照电脑程序进行运行，从而系统LSI实现其功能。
需要说明的是，这里，虽然设定为系统LSI，但根据集成度的不同，有时也被称为IC、LSI、Super LSI(Super Large Scale Integration；超大规模集成电路)、Ultra LSI(Ultra Large-Scale Integration；特大规模集成电路)。此外，集成电路化的方法并不限于LSI，也可以通过专用电路或通用处理器来实现。也可以利用可重构处理器，所述可重构处理器能够重构在LSI制造后可程序化的FPGA(Field Programmable Gate Array；现场可编程门阵列)、或者LSI内部的电路单元的连接、设定。进而，如果出现通过半导体技术的进步或派生的其他技术而置换成LSI的集成电路化技术，则当然也可以利用该技术来进行功能块的集成化。可使生物学技术的应用等成为可能。
需要说明的是，在上述各实施方式中，各构成要素也可以通过由专用的硬件来构成、或执行适于各构成要素的软件程序来实现。各构成要素也可以通过由CPU或处理器等程序执行部读出并执行硬盘或半导体存储器等记录介质中记录的软件程序来实现。
本说明书中“程序”以该领域所使用的通常含义来使用，按照电脑应该进行的处理的顺序来记述，在法律上按照“物”来处理。所有的电脑按照程序来运行。在现代的电脑中程序以数据的形式表现，存储于记录介质或存储装置中。
本说明书中“记录介质”是存储有执行本发明的程序的记录介质，记录介质只要能够记录程序，则可以是任意的记录介质。例如，可以是可存储于内部的ROM、HDD、磁盘、USB存储器等闪存器等外部存储装置，但不限定于此。
本说明书中所谓“系统”是指执行本发明的方法或程序的构成，本来是指用于完成目的的体系、组织，其将多个要素体系化地构成且相互地影响，在电脑的领域中，是指硬件、软件、OS、网络等的全体的构成。
(Tax抗原肽脉冲树突状细胞的制造)
本发明提供一种生产Tax特异性树突状细胞的方法，其包括：由通过本发明的工序制备的单核细胞试样诱导树突状细胞的工序、和对该诱导后的树突状细胞进行Tax抗原肽脉冲的工序。
本发明还提供一种生产再生医疗等制品的方法，其包括下述工序：将使Tax特异性树突状细胞悬浮于冷冻保护液中而得到的物质填充到冻存管、冻存袋等容器中，制成再生医疗等制品。
此外，本发明提供通过本发明的方法制造的再生医疗等制品。
(治疗)
本发明的再生医疗等制品可以以有效成分量换算而出于治疗目的施用于适宜的位置，非经口的、局部的或经粘膜的、例如经鼻、经直肠或经皮的、或者局部地施用的情况也可以同样地进行换算。本发明的方法中施用的医药组成物的量根据所治疗的对象、障碍或障碍的症状的重症度、施用法、施用频率及医生的判断来决定。施用频率基本为从每小时的施用到每月的施用为止的范围内。在具体实施方案中，例如可以以1×106～1×107、优选5×106个细胞来进行施用，对于施用次数，代表性而言可施用1～5次(优选为3次)，作为施用间隔，例如可每隔1～4周、优选每隔2周来施用。代表性而言，可以以5×106个细胞每2周施用3次。该治疗也可用于预防。
在优选的实施方式中，本发明可包含从受试体采集单核细胞后的利用单采进行的淋巴细胞除去。本发明的淋巴细胞除去是在利用单采进行的单核细胞采集后等，通过以自动设定值进行单采来除去受试体内的淋巴细胞，诱导抗肿瘤免疫的赋活。作为类似技术，包括治疗性血细胞单采术(Therapeutic cytapheresis)，可列举利用离心分离法的淋巴细胞除去疗法、利用吸附法的白细胞除去疗法、粒细胞除去疗法等，它们都可以采用。该技术还有以抑制炎症为目的的、主要除去细胞障碍性的活化嗜中性粒细胞成分的方面。除去活化嗜中性粒细胞的结果是，能够获得炎症性细胞因子的降低。此外，对于本发明的原料采集时的单采及之后的淋巴细胞除去用单采，在通过离心分离法来采集作为树突状细胞原料的单核细胞时，同时能够除去109个细胞水平的淋巴细胞。其结果是，能够将构成癌症患者的免疫耐受状态的Treg等的淋巴细胞除去，诱导抗肿瘤免疫的赋活。谋求以上述某种含义的并用的疗法也在本发明的范围内。
在一个方面，本发明提供一种方法，其是治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法，该方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从受试者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。该治疗也可用于预防。
在一部分实施方式中，上述规定值也可以是用于取得血沉棕黄层的值。在一部分实施方式中，上述血细胞浓度也可以参照采集偏好来调整。在一部分实施方式中，上述采集偏好被设定为比60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]高的值。在一部分实施方式中，上述采集偏好被设定为60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～20。在一部分实施方式中，上述采集偏好的规定值为30～50。在一部分实施方式中，上述采集偏好被设定为比规定值高10～30。在优选的实施方式中，上述采集偏好被设定为比规定值高20～30。在一部分实施方式中，上述采集偏好被设定为40～80(或者，下限可为50、60等的中间值，上限也可以为60或70等的中间值。)。
在另一实施方式中，在本发明的方法中，获得血液试样的工序包括取出单核细胞的工序、和取出淋巴细胞的工序。取出淋巴细胞的工序可持续任意的时间，但进行优选20分钟以上、进一步优选30分钟以上是有利的。在一部分实施方式中，取出淋巴细胞的工序也可以将上述采集偏好设定为30～50来实施。
或者，在另一实施方式中，在本发明的方法中，取出单核细胞的工序也可以是本说明书中记载的关于单核细胞处理的任意的特征或它们的组合。
在另一方面，本发明提供一种程序，其是使电脑执行治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法的程序，该方法包括：1)从该患者获得血液试样的工序；2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。这里所使用的方法可包含本说明书的其他部分所记载的任意的其他的特征或其组合。
在又一方面，本发明提供一种记录介质，其是记录如下程序的记录介质，该程序使电脑执行治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法，该方法包括：1)从该患者获得血液试样的工序；2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。这里所使用的方法可包含本说明书的其他部分所记载的任意的其他的特征或其组合。
在又一方面，本发明提供一种系统，其是用于治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的系统，该系统包含：1)从该患者获得血液试样的试样取得部；2)在该血液试样中测定血细胞浓度的测定部；以及3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的同等试样取得部，该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。这里所采用的各种部分或构成要素可包含本说明书的其他部分所记载的任意的其他的特征或其组合。
在又一方面，本发明提供一种方法，其是用于治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的系统的操作方法，该系统包含：1)从该患者获得血液试样的试样取得部；2)在该血液试样中测定血细胞浓度的测定部；以及3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的同等试样取得部，该方法包括：1)从该患者获得血液试样的工序；2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。这里所采用的各种部分、构成要素或方法可包含本说明书的其他部位部分所记载的任意的其他的特征或其组合。
(其他的实施方式)
对于本发明的一个或多个方案的判定方法及解析方法，基于实施方式进行了说明，但本发明并不限定于该实施方式。只要不脱离本发明的主旨，对本实施方式施加本领域技术人员所想到的各种变形后的方式、将不同实施方式中的构成要素组合而构建的方式也包含在本发明的一个或多个方案的范围内。
本说明书中“或”被使用在可以采用文章中所列举的事项的“至少一项以上”时。“或者”也同样。在本说明书中明确记载为“两个值的范围内”的情况下，其范围也包括两个值本身。
以上，为了便于理解而示出优选的实施方式来说明本发明。以下，基于实施例来说明本发明，但是，上述的说明及以下的实施例仅以例示的目的来提供，并不以限定本发明的目的来提供。因此，本发明的范围也并不限定于本说明书中具体记载的实施方式和实施例，而仅受到权利要求书的限定。
实施例
在本实施例中，针对本发明的单核细胞的纯化方法及之后树突状细胞的诱导、进行Tax肽脉冲而制剂化的一系列实验进行说明，其中，对具特征性的单核细胞的纯化进行详细阐述。在以下的实施例中，遵守赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)等医疗上的伦理规定、GCP等的规则、以及国立医院机构所另行规定的规定，基于与发明人所属的组织有关的伦理委员会的批准来进行。在取得必要的知情同意后进行了以下的实验。
图14中示出本实施例中研究的代表性的单核细胞纯化的方法的示意图。可理解为其中几个(例如，冷冻、融化、比重离心分离)是任选工序，也可以省略。
(实施例1：单采的实施)
在本实施例中，尝试了单采的改良。以下示出步骤。
(方案)
·在实施单采时，首先考虑施主的健康状态，进行与一般临床医疗同样的医学应对。
·事先从施主进行采血，测定血细胞计数及机械分类。
·机器使用了Spectra Optia(Terumo BCT)。
·程序设定为MNC程序。
·确保2条外周静脉通路来用于脱血及回血。
·采集条件如下所述。
Figure BDA0003797881500000381
·采集结束后，从采集检体采集约1ml的样品，测定血细胞计数及机械分类。
(冷冻处理)
<准备物品>
检体(PBMC采集袋)
双分离袋(川澄(Kawasumi)血液分离用袋KBP-66DC)1个
科赫尔钳(Kocher)、封管机(tube sealer)、辊台(roller bench)
无菌接合机(TSCD)
ACD-A液 500mL(使用量为少量)
献血白蛋白20％静注10g/50mL(JB)1个
CP-1 40ml 1个(正晃)
冷冻袋(NIPRO冷冻袋F-100)1个
酒精喷雾
黄色长袍、帽子
PBMC冷冻工序记录书。
(1.转移)
(1)向双袋(double bag)的转移
1.在将乙烯塑料袋打开之前，将双分离袋的针部分从袋的上方用科赫尔钳夹住，将乙烯塑料袋打开，用封管机在接近针的部分切开。
2.将双分离袋的母袋与子袋之间用管钳(Klemme)夹住。
3.将用科赫尔钳夹住后的PBMC采集袋和双分离袋用TSCD接合。
4.将采集袋内的PBMC液转移至双分离袋中。
5.用封管机进行密封(管稍长地残留)而将采集袋切开。
随时留意装有PBMC的袋要将管类用管钳夹住。
(2)ACD-A液的添加(用于预防聚集的产生)
(i)测定PBMC的入袋重量。
(ii)计算ACD-A液的添加量(相对于PBMC内容量为2％w/w)。
(iii)将双分离袋和ACD-A液袋用TSCD连接。在袋根部配置有管钳。
(iv)一边用秤确认重量，一边添加计算量的ACD-A液。
(v)在管段(segment)5个的量的位置处，用封管机密封并将ACD-A液袋切开。
(vi)将ACD-A液充分混合后，将双分离袋的管在辊台上滚动数次，将1个管段切开用于CBC。
(vii)将管段切开后测定重量，记录实际的ACD-A液添加量。
(2.血细胞计数)
(1)将管段内的血液转移到样品管中。
(2)测定CBC及机械分类。
(3.冷冻袋数的确定·容量的调整)
(1)冷冻袋数
冷冻袋数＝2
容量调整后的入袋的重量(目标)＝50g+35g＝85g
(2)容量的调整
(i)在容量多的情况下进行离心。1200rpm(370G)、12min、10℃、Acce19、Dece16。连袋一起用气垫进行保护，按照袋不扭曲的方式固定到离心机中。
(ii)离心分离后，将PBMC袋夹到分离架上，将上清液部(PRP)移注到子袋中。
注意不要使沉淀部分的有核细胞进入。
袋若不按照密封侧成为里侧的方式固定则看不见内容物。
(iii)将PBMC袋放置到秤上，一边测定重量一边送回PRP，调整为目标重量。
(4.必要物品的消毒)
(i)将ACD-A液、分离袋(从乙烯塑料袋的上方将2处夹钳关闭)、CP-1、白蛋白、分离袋(川澄KBP-66DC)、冷冻袋(NIPRO F-100)、连结管(川澄T-8)、20ml注射器、酒精棉和刚才调整的PBMC袋通过酒精喷雾实施1次消毒(不放入安全柜中)。
(ii)穿戴黄色长袍和帽子
由于是洁净操作，因此穿戴黄色长袍和帽子，为了保证洁净，注意在该姿态下不要从调整室出来。
(iii)必要物品的再次消毒
注意：将上述消毒后的必要物品全部干燥后，再次通过酒精喷雾进行消毒，同时放入安全柜中。
(iv)灭菌手套的佩戴
佩戴灭菌手套，把手放到安全柜中进行作业。
一旦把手拿出则变得不再是灭菌，因此要注意直至作业结束之前不要把手拿出来。
(5.安全柜内的操作)
(1)冻害保护液(cryodamage protection liquid)的准备
(i)对于CP-1和白蛋白，将塑料盖卸下并将上部用酒精棉消毒后，用气针刺破。
(ii)取20％白蛋白到16ml注射器中。
(iii)向50ml用CP-1(34mL)中添加20％白蛋白16ml。
(iv)按照不起泡的方式进行颠倒混合。
*防备将CP-1与白蛋白混合时的发热，一边用保冷剂冷却一边进行。
(2)冻害保护液的添加
(i)将连结管从袋中取出，将夹钳关闭。
(ii)将冷冻管的输血口用塑料针(淡黄色)穿刺PBMC袋。
(iii)将连结管的橡胶专用塑料针(白色)穿刺入固定于瓶架上的冻害保护液的橡胶盖。
(iv)将冻害保护液的瓶架挂到安全柜的钩子上，将连结管的夹钳打开。通过辊台促进流出。注意不要丢弃瓶架。
袋用保冷剂夹持，一边进行冷却混合，一边缓慢地加入规定量的冻害保护液(在总量200mL下以10分钟作为目标，在100mL下以5分钟作为目标)。
在之后的作业中还少量加入用于将管内的液体挤出的空气。
加入冻害保护液后，若作业不在冷却下迅速地进行则细胞死亡，因此要留意。
(3)向冷冻袋的移注
(i)在两个冷冻袋上分别记入原料编号+“(1)”、原料编号+“(2)”。
(ii)将两个冷冻袋的管的端部用封管机切掉。
将PBMC袋和两个冷冻袋用TSCD连接。
(iii)将冷冻袋的管钳打开，将PBMC移注到冷冻袋中。
(iv)将冷冻袋的空气转移至原来的袋中而实施排气。空气混入会成为袋破损的原因，因此尽可能排出空气。
在袋为2-3个的情况下，致力于使其尽可能变得等量，但不要耗费时间。
(v)将2个管段的PBMC送回管中，用封管机使PBMC主体停留在黑线之间，制作两根管段用于CBC和保存。
(vi)进行了CBC测定。
(vii)测定冷冻袋的重量。
(viii)1袋1袋放入铝护具中，通过记载了原料编号的密封来封住。由于在解冻时容易剥离，因此密封端进行翻折。
(6.冷冻)
(1)通过程序冷冻仪(CRYOMED Freezer[Thermo SCIENTIFIC])按照以下的程序进行冷冻处理。
1在腔室＝2℃下待机直至样品＝4℃
2以1℃/min进行调整直至样品＝-4℃
3以60℃/min进行调整直至腔室＝-70℃
4以20℃/min进行调整直至腔室＝-15℃
5每次1℃地进行冷却直至样品＝-40℃
6每次1℃地进行冷却直至样品＝-80℃
7结束
(2)冷冻检体的保存
一旦利用程序冷冻仪的冷冻结束，就从腔室中将装有冷冻袋的护具取出，放入液氮罐中进行保存。
在挂在液氮罐上的“细胞治疗科保存检体目录(临床研究)”上记入信息。
(结果)
以下，提出表示试样中的单核细胞纯化的程度等的表(表中，Mo表示单核细胞，Ly表示淋巴细胞，PBMC表示外周血单核细胞，Neut表示嗜中性粒细胞，Ht表示红细胞比容值，Plt表示血小板，Pt表示患者。)。
在以下的表中记载的数据中，以下的表示分别相当于右边的说明中记载的数据。
ComTec：通过以往法实施原料采集及冷冻保存而得到的数据
Optia：通过本发明的方法实施原料采集及冷冻保存而得到的数据
HD23：实施例1的数据
HD24：实施例2的数据
单采采集检体：原料采集工序中采集的检体
冷冻保存检体：冷冻保存工序中的即将冷冻前的检体(相当于上述(3)(v))
Figure BDA0003797881500000441
Figure BDA0003797881500000451
如上所述，在实施例1(HD23)中，使用本发明的方法，单核细胞纯度达到30％左右。此外，Ht(红细胞比容值)及Plt(血小板)与以往方法相比减少。
在实施例1中，采集偏好从通常的值开始。(下述表2、AC表示ACD-A，Hct表示红细胞比容值，TBV表示循环血液量。)
Figure BDA0003797881500000471
由本实施例的结果确认到：与实施单采(仅比重分离)的情况相比，将基于比重及尺寸的分离组合时，10％左右的单核细胞纯度上升至约30％。
需要说明的是，若进行溢出处理则呈现纯度上升的倾向。
如下述所示，若还进行冷冻保护剂处理、死细胞处理、淋巴细胞及血小板除去(OptiPrep)处理，则纯度进一步上升。
(实施例2：单采的进一步改良)
与实施例1同样地进行了单采。
在实施例2中，使用了与实施例1同样的方案，但将采集偏好值设定为比自动设定值高20。
(结果)
可见通过本发明的方法(将采集偏好设定为比通常值高、实施基于比重及尺寸的分离)，使得单核细胞的纯度显著上升(约40％)(表1)。
(实施例3：DNase的处理)
在本实施例中，使用在实施例1中冷冻保存后的冷冻保存原料来实施Tax特异性树状细胞的试验制造，但准备了进行DNase处理的情况和未进行Dnase处理的情况。
(方案)
(目的)
·因在制造工序第一天(Day0)产生的聚集块，有可能使单核细胞回收率、单核细胞纯度降低。在本实施例中，分成添加DNase(阿法链道酶)和无添加DNase(阿法链道酶)的两组来实施，对ATL-DC的回收率、品质进行了比较验证。
(使用原料)
内容量为约50mL，通常制造的一半规模
<采集、冷冻日>2020年1月27日
<单采机器>Spectra Optia(Terumo BCT)
<施主>健康人(HD23)
<采集条件>
·使用了单核细胞采集(MNC collection)方案。
·ACD-A液的使用量设定为血液处理量：ACD-A液＝12：1。
·对于每1个循环的处理血液量，各个循环根据向腔室内的血细胞填充量来决定。
·在循环间进行全血细胞计数测定，作为单核细胞，以l×l0^9个为目标来决定全血液处理量。在采集检体中添加血浆而制备成约200mL。
<冷冻条件>
·依据日常诊疗中的造血干细胞移植的患者及施主的外周血造血干细胞的冷冻保存方法来实施。(添加2％(W/W)的ACD-A液。进行离心分离而除去上清液，将容量调整成50mL。添加50mL的CP-1/HSA混合液，分注到2个冷冻袋(frozen bags)中。使用程序冷冻仪冷却至-80℃以下后，利用液氮罐进行保存。)
<采集·冷冻时的全血细胞计数数据>
[表3]
Figure BDA0003797881500000491
(方法)
将原料的解冻洗涤工序如以下那样分成添加DNase和无添加DNase的两组，之后将两组的细胞分别供于Tax特异性树突状细胞的试验制造工序。将本实施例中的制造工序的一部分(原料的解冻洗涤工序)示于图12中。方法的详细情况如实施例4中记载所示。
需要说明的是，在本实施例中，未实施解冻洗涤工序中使用的培养基的pH调节(基于大气下的气体交换的酸中和)。在Opti-Prep重叠前和烧瓶接种前，使用10mL移液管进行移液以使细胞充分悬浮。
(结果)
根据结果(表4及表5)认为：在有无DNase处理的两种条件下得到的各自的DC的收量、活细胞率及表面形质上未确认到显著的差异，能够制造可施用的DC。
(实施例4：使用了冷冻保护剂的单核细胞纯化的改善)
在本实施例中，针对使用冷冻保护剂时的单核细胞纯化的改善进行了调查。
(材料及方法)
(试剂的制备)
按照以下步骤，制备了试剂。
Day 0
((0)试剂的准备)
必要量
RPMI1640：500ml瓶5瓶
PBS：500ml瓶1瓶、OptiPrep稀释用106.5ml
25％HSA：90ml
ACD-A液：60ml
OptiPrep：30ml
(试剂的制备)
如下所示，调制在工序(1)解冻·洗涤(2)分离和培养中所需的试剂。
※以下试剂要留意在洁净台(clean bench)内无菌地调制。
(培养基(1)(洗涤用)的制备)
培养基(1)(洗涤用)：5.5％ACD-A/1％HSA/RPMI1640
RPMI1640 向500ml瓶中添加ACD-A液30ml后，添加25％HSA 20ml。
ACD-A液 30ml
RPMI1640 500ml/总计 530ml×2个
↓
25％HSA 20ml/总计 550ml×2个
↓
如以下那样转移至加有RPMI1640的500ml瓶中，密闭后进行了搬运。
(1)560ml→38℃用
(2)540ml→室温用
(培养基(2)(洗涤·培养用)的制备)
培养基(2)(洗涤·培养用)：1％HSA/RPMI1640
RPMI1640 向500ml瓶中添加25％HSA 20ml。
25％HSA 20ml
RPMI1640 500ml/总计 520ml×2个
↓
一个作为洗涤用而保持室温的状态，另一个作为分离用而在4℃下保冷。
(分离液(比重：1.075)的制备)
如以下所示在225ml离心管中调制OptiPrep比重液。
※在调制前，OptiPrep预先恢复到室温。
比重：1.075→PBS 106.5ml+OptiPrep 30ml
※OptiPrep由于粘度高，因此在分取时注意正确地进行
※按照OptiPrep不残留在移液管内部的方式进行移液
↓
温和地颠倒混合，各分注15ml到8个50ml离心管中。
(洗涤用PBS的调制)
洗涤用PBS：0.5％HSA/PBS(预先在4℃下保冷)
PBS 向500ml瓶中添加25％HSA 10ml。
25％HSA 10ml
PBS 500ml/总计 510ml×1个
(烧瓶洗涤用RPMI1640)
在烧瓶的孵化开始时将RPMI1640 500ml的瓶直接在37℃(孵化器内)下加温。
((1)冷冻检体的解冻·洗涤工序：有阿法链道酶处理)
以下记载使用了冷冻保护剂的处理方法。
Day 0
(1.机器的准备)
将水浴加温至38℃。
进行了离心机的设定(确认离心特性设定)(还进行平衡的制作)。
细胞计数器的设置
(2.离心管的准备)
准备5个225ml离心管并贴上“A”、“B”、“C”、“(9)S”、“(9)P”标签，准备1个50mL离心管并贴上“D”标签来准备
另外还准备了废液用瓶。
(3.试剂的准备)
如以下所示分注上述工序中制备的培养基(1)(560ml瓶)。
培养基(1)：5.5％ACD-A/1％HSA/RPMI1640
向两个225ml离心管(A、B)中分注各180ml
向一个225ml离心管(C)中分注160ml
向一个50ml离心管(D)中分注40ml(用于共洗涤)
预先水浴加温。
剩余一瓶(540ml)预先保持在室温的状态下。
培养基(2)：1％HSA/RPMI1640
一个作为洗涤用而保持室温的状态，另一个作为分离用而在4℃下保冷。
(4.样品管准备)
准备用于采样、计数的微型离心管(Eppendorf)。
(5.培养基的准备5.5％ACD-A)
将加温后的培养基(1)(A、B、C、D)全部取出。
(6.冷冻检体的准备)
将冷冻袋(冷冻单采检体)从液氮中取出。
(7.冷冻检体的解冻)
将冷冻袋用38℃水浴迅速解冻(约2分钟)。
(8.第1次细胞回收)
将冷冻袋放入洁净台中，按照连接部不会变得不洁净的方式(使其浮在空中)将袋穿刺器与50ml注射器连接并回收(第1次)。
(9.细胞的分注、第1次洗涤)
测定第1次的回收液量，三等分后分注到225ml离心管(A、B、C：培养基(1))中。
第1次的回收液量：40ml(各约13ml)
(10.细胞的分注、第1次洗涤)
在50mL注射器上连接18G针，从50ml离心管(D)中分取22ml的培养基(1)。
(11.细胞的回收、第2次)
再次连接到冷冻袋上，将残留在袋内的细胞冲洗回收(第2次)。
(12.细胞的回收、第2次)
测定第2次的回收液量，添加到225ml离心管(C)中。
第2次的回收液量：24ml(经计算在离心管C中添加了约15ml原料)
(13.细胞的回收、第2次)
对离心管盖上盖子，进行数次颠倒混合。
(14.检体的离心分离、第1次)
进行离心分离(20℃，350×g，5分钟，制动(brake)2)。
(15.上清液的除去)
除去上清液(50ml移液管)。废液废弃到废液瓶中。
此时，为了减少细胞的损失，留意残留约10ml左右的上清液。
(16.细胞的悬浮)
将离心管的底与管架接触，使其横向滑动而将颗粒松解。
这以后的作业如以下所示分条件地分别进行了作业。
225ml离心管A→有阿法链道酶处理
225ml离心管B、C→无阿法链道酶处理
(有阿法链道酶处理)
以下，接着进行有阿法链道酶处理的工序。
(17.225ml离心管A)(有阿法链道酶处理)
添加20ml(25ml移液管)室温培养基(1)并使其悬浮(suspend)。
(18.第2次洗涤5.5％ACD-A)(有阿法链道酶处理)
用室温培养基(1)定容(50ml移液管)至200ml，进行3次左右颠倒混合。
这里对有无聚集块进行确认，确认了没有聚集块。
(不管有无聚集块，都进行工序21以后的离心·上清液除去后细胞悬浮液的阿法链道酶处理。)
(19.检体的离心分离、第2次)(有阿法链道酶处理)
进行了离心分离(20℃，300×g，5分钟，制动2)。
(20.上清液的除去)(有阿法链道酶处理)
按照残留液成为约5ml的方式除去了上清液(50ml移液管)。
废液废弃到废液瓶中。
(21.细胞的悬浮)(有阿法链道酶处理)
将离心管的底与管架接触，使其横向滑动而将颗粒松解。
(21.1.阿法链道酶处理)(有阿法链道酶处理)
用残留液悬浮细胞(10ml移液管)，测量悬浮液量。
悬浮液量：2.5ml
→5ml－悬浮液量：2.5ml＝添加量：2.5ml
(在不足的情况下加上添加量的量的培养基(1))
(21.2.阿法链道酶处理)(有阿法链道酶处理)
添加1ml阿法链道酶(2.5mg/2.5ml)。
(21.3.阿法链道酶处理)(有阿法链道酶处理)
一边摇晃管，一边使其反应15分钟。
(22.第3次洗涤、1％HSA/RPMI)(有阿法链道酶处理)
添加20ml(25ml移液管)的室温培养基(2)并使其悬浮。
添加175ml的室温培养基(2)，定容(50ml移液管)至200ml，进行3次左右颠倒混合。
(23.采样)(有阿法链道酶处理)
对悬浮液进行采样(样品(8)P)(仅细胞数计数)。
→分取10μl至微型离心管(×5稀释用)中。
(24.检体的离心分离、第三次)(有阿法链道酶处理)
进行了离心分离(20℃、300×g、5分钟、制动2)。
(25.1.细胞的计数)(有阿法链道酶处理)
在离心分离中进行了样品(8)P的细胞数的计数。
结果记录于细胞数记录表中并计算细胞数。
样品(8)P的活细胞数：3.0×108个…[A]
(25.2.试剂·机器的准备)(有阿法链道酶处理)
工序24的离心结束后，将离心机的制动的设定变更为OFF，设定为4℃进行冷却。
(25.3.培养基准备、1％HSA/RPMI)(有阿法链道酶处理)
准备了在4℃下冷却后的冷培养基(2)(500ml瓶)。
(26.上清液的除去、采样)(有阿法链道酶处理)
除去上清液(50ml移液管)。
(这里，与第1次的洗涤相比也可以除去上清液(约5ml左右))
→上清液回收至225ml离心管((9)P)中(仅FCM)。
(27.细胞的悬浮)(有阿法链道酶处理)
将离心管的底与管架接触，使其横向滑动而将颗粒松解。
用残留液悬浮细胞(10ml移液管)，测量悬浮液量。
悬浮液量：4.0ml…[B]
(28.悬浮液量的计算)(有阿法链道酶处理)
根据计数结果，通过以下的式子算出细胞的悬浮液量，调整细胞浓度。
(1)由于(8)P的细胞数低于4×10^8个，因此悬浮液量设定为20ml。
(2)[C：20ml]－[B：4.0ml]＝添加量：16.0ml…[E]
(29.悬浮液的制备)(有阿法链道酶处理)
在工序27(细胞的悬浮)的细胞悬浮液中加入添加量16.0ml的冷培养基(2)，使用10ml移液管进行移液。
(30.采样)(有阿法链道酶处理)
对细胞悬浮液进行采样(样品(10)P)(细胞数计数、FCM用)。
→分取0.5ml至15ml离心管(×20稀释用)中
确认了以Optiprep的分离所需的50ml离心管的个数(分离个数：1个)
↓
进展至“(2)未熟树突状细胞的调整”的工序
在至重叠之前的期间，细胞悬浮液在4℃下静置。
(无阿法链道酶处理)
工序17以后如以下所示接着进行无阿法链道酶处理的工序。
(17.225ml离心管B、C)(无阿法链道酶处理)
添加20ml(25ml移液管)的室温培养基(1)并使其悬浮。
将两个离心管(B、C)的悬浮液合并至一个225ml离心管(C)中。此时，使用20ml的室温培养基(1)将离心管进行共洗涤。
(18.第2次洗涤、5.5％ACD-A)(无阿法链道酶处理)
用室温培养基(1)定容(50ml移液管)至200ml，进行3次左右颠倒混合。
(19.检体的离心分离、第2次)(无阿法链道酶处理)
进行离心分离(20℃，300×g，5分钟，制动2)。
(20.上清液的除去)(无阿法链道酶处理)
除去上清液(50ml移液管)。废液废弃到废液瓶中。
按照残留液成为约5ml的方式除去上清液(50ml移液管)。
(21.1.细胞的悬浮、1％HSA/RPMI)(无阿法链道酶处理)
将离心管的底与管架接触，使其横向滑动而将颗粒松解。
(21.2.细胞的悬浮、1％HSA/RPMI)(无阿法链道酶处理)
添加20ml(25ml移液管)的室温培养基(2)并使其悬浮。
测量悬浮液量。悬浮液量：27.5ml
(21.3.细胞的悬浮、1％HSA/RPMI)(无阿法链道酶处理)
添加(50ml移液管)120ml的室温培养基(2)并确认有无聚集块(聚集块：无)。
(22.第3次洗涤、1％HSA/RPMI)(无阿法链道酶处理)
添加52.5ml的室温培养基(2)并定容(50ml移液管)至200ml，利用移液的方式悬浮细胞。
(23.采样)(无阿法链道酶处理)
对悬浮液进行采样(样品(8)S)(仅细胞数计数)。
→分取10μl至微型离心管(×5稀释用)中
(24.检体的离心分离第三次)(无阿法链道酶处理)
进行离心分离(20℃、300×g、5分钟、制动2)。
(25.1.细胞的计数)(无阿法链道酶处理)
在离心分离中进行了样品(8)S的细胞数的计数。
结果记录于细胞数记录表中并计算细胞数。
样品(8)S的活细胞数：5.0×108个…[8S]
(25.2.试剂·机器的准备)(无阿法链道酶处理)
在工序24的离心结束后，将离心机的制动的设定变更为OFF，设定为4℃进行冷却。
(25.3.培养基准备、1％HSA/RPMI)(无阿法链道酶处理)
准备在4℃下冷却后的冷培养基(2)(500ml瓶)。
(26.上清液的除去、采样)(无阿法链道酶处理)
按照残留液成为约5ml的方式除去上清液(50ml移液管)。
→上清液回收至225ml离心管((9)S-1)中(FCM)。
(27.细胞的悬浮)(无阿法链道酶处理)
添加20ml(25ml移液管)的冷培养基(2)并使其悬浮。
测量悬浮液量。
悬浮液量：28ml…[B]
(28.悬浮液量的计算)(无阿法链道酶处理)
根据计数结果，通过以下的式子算出细胞的悬浮液量，调整细胞浓度。(按照成为与“有阿法链道酶处理”相同的细胞浓度的方式进行调整)
(1)[8S：50×10^7个]/[1.5×10^7个/ml]＝33ml…[C：细胞悬浮液总量]
(2)[C：33ml]－[B：28ml]＝添加量：5ml…[E]
(29.悬浮液的制备)(无阿法链道酶处理)
在工序27(细胞的悬浮)的细胞悬浮液中加入添加量5ml的冷培养基(2)，使用10ml移液管进行了移液。
(聚集块的处理)
在工序29中，由于确认到大的聚集块，因此进行了以下的作业。
在50ml离心管中添加20ml的室温培养基(2)。
用10ml移液管仅采集聚集块并转移至50ml离心管中，将聚集块悬浮而松解。
静置30秒左右，等待残留的聚集块自然沉降。
按照大的聚集块不进入的方式回收上清液，返回到工序29的细胞悬浮液。
(30.采样)(无阿法链道酶处理)
对细胞悬浮液进行采样(样品(10))(细胞数计数、FCM用)。
→分取0.5ml至15ml离心管(×20稀释用)中
计算以Optiprep的分离所需的50ml离心管的个数。
[C：33ml]/20ml＝分离个数：两个
(在第一个中重叠20ml后，将残留液定容成20ml后重叠到第二个中)
↓
进展至“(2)未熟树突状细胞的调整”的工序
(结果)
在本实施例中，通过利用冷冻保护剂(CP-1)，刚刚单采后为约30％的单核细胞纯度在解冻洗涤工序后上升至约50％。进而，在比重离心分离工序后，单核细胞纯度上升至约70％(表4)。
Figure BDA0003797881500000601
*对于解冻洗涤及OptiPrep后的样品，设门(gating)至5～22μm，对于Tax脉冲前及最终冷冻前的样品，设门至7～22μm。
在无添加DNase的组中，在Day0的制造工序中产生了聚集块，但在添加DNase的组中，在添加处理后未产生聚集块。此外在两组中，Day0的单核细胞在烧瓶上的粘附、Day7所回收的DC的纯度·表面形质未确认到明显的差异。
在这次的使用了Spectra Optia的采集条件下，能够充分采集作为目标细胞的单核细胞，能够减轻淋巴细胞、红细胞、血小板等的混入。认为通过减少这些目标以外的细胞的混入而使得ATL-DC回收率、品质提高。
在这次的验证中，并未实施解冻洗涤工序中使用的洗涤液的pH调节，但得到在换算成全规模制造的情况下可施用的DC的收率，DC的纯度也良好(表5)。
Figure BDA0003797881500000621
(实施例5：Day0单核细胞·淋巴细胞解析)
本实施例如下进行。
(染色)
1.利用1％FBS/PBS进行悬浮，调整为1×10^7/mL左右。
2.在FACS Tube中分注抗体，各添加100μL的细胞悬浮液。
3.在冰上在遮光下孵化20分钟。
4.各添加4mL的冷PBS，以440g、6min、4℃进行离心
5.通过倾析来除去上清液，用适量(250μL以上)1％FBS/PBS来悬浮细胞。
6.在测定之前，在冰上、遮光下保管后，供于流式细胞术(flow cytometry)。
利用抗体的染色按照图13所示进行。
(结果)
将结果示于图1～4中。图1～2是有阿法链道酶处理的试样的Day0的单核细胞·淋巴细胞解析的结果，图3～4是无阿法链道酶处理的试样的Day0的单核细胞·淋巴细胞解析的结果。图1及3是OptiPrep前的试样，图2及4是OptiPrep后的试样。
(实施例6：最终冷冻前检体的DC解析)
本实施例如以下进行。
(抗体分注)
1)制作“P、S”(2种)-“1～9”(9种)标签并贴在18个染色用FCM管上。
2)对9个抗体mix制作用FCM管“Ab1～9”制作各染色(Stain)的抗体mix。
3)轻轻地涡旋进行了混合。
4)将各染色的抗体分注到各管中。
5)在使用之前，遮光并在4℃下保管。
(染色)
1)接收所回收的细胞悬浮液(2×10^6细胞左右)。
2)添加1％FBS/PBS并将总量设定为10ml进行了混合。
3)进行离心分离(4℃，400g，5分钟)。
4)除去上清液。
5)添加700μl的1％FBS/PBS，移液并将颗粒悬浮。
6)通过涡旋进行了混合。
7)向分注有抗体的FCM管中各分注50μl的细胞悬浮液。
8)通过涡旋进行了混合。。
9)在4℃、遮光下孵化30分钟(在15分钟的时刻轻轻地涡旋)。
10)添加2ml的1％FBS/PBS，通过涡旋进行了混合。
11)进行了离心分离(4℃、400g、5分钟)。
12)通过倾析来除去上清液。
13)各添加400μl的1％FBS/PBS，通过涡旋进行了混合。。
14)在测定之前，在4℃、遮光下保管。
(结果)
图5～7是确认使用有阿法链道酶处理的各种抗体而得到的树突状细胞的特性的图。图5～7表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。
图8～10是确认使用无阿法链道酶处理的各种抗体而得到的树突状细胞的特性的图。图8～10表示使用了针对各个标志物的抗体的FCM。
(实施例7：至脉冲细胞的制造为止的流程)
以下示出ATL-DC制造工序流程。
以下流程的一部分如上所述，关于树突状细胞的分化以后，简要地示出。
(方案)
Day0
(1)解冻洗涤工序
·在38℃恒温槽中将冷冻保存检体解冻。
·使用含ACD-A/HSA的RPMI-1640的洗涤工序(2～3次)
·使用含HSA的RPMI-1640的洗涤工序(0～1次)
·洗涤工序中的利用阿法链道酶的聚集块的悬浮
·使用了含HSA的RPMI-1640的细胞悬浮液的制作工序
(2)比重离心分离工序
·使用了OptiPrep的单核细胞/淋巴细胞分离工序
·使用了含HSA的RPMI-1640的单核细胞悬浮液的制作工序
(3)粘附处理工序、培养开始
·利用T-175烧瓶、在AZT存在下静置120分钟
·非粘附细胞的回收和粘附细胞的洗涤工序
·向树突状细胞的分化工序：使用添加有GM-CSF、IL-4、AZT的含HSA的RPMI-1640培养5天
Day5
·KLH脉冲工序
·添加含有KLH、TNF-α、GM-CSF、AZT、HSA的RPMI-1640并培养1天
Day6
·OK432()处理工序：
·将毕西巴尼(Picibanil)/抗恶性肿瘤溶链菌制剂即OK432添加到培养液中，进一步培养1天
Day7
·成熟树突状细胞的回收工序
·Tax肽脉冲工序(室温22±3℃，90分钟)
·利用离心的洗涤工序(2次)
由此，可得到Tax肽脉冲树突状细胞。
·最终制剂化工序：
·细胞密度的调制(1×107个细胞/mL)
·与细胞冷冻保存液混合(5×106个细胞/mL)
·填充到冻存管等中(2.5×106个细胞/0.5mL/管)
·在冻存管(冷冻保存细胞)及添附融化剂(生理盐水)的安瓿上贴标签
·制剂的保存：冷冻保存细胞(≤-80℃)
生理盐水(室温)
得到最终制剂(冷冻保存细胞+添附融化剂)。
出货时进行以下操作。
标准试验(制造机关)：
活细胞数、活细胞率、表面形质解析(FCM)、无菌试验、内毒素(endotoxin)、支原体(mycoplasma)(PCR法)
(结果)
确认到如上所示能够制造Tax肽脉冲树突状细胞。
(实施例8：所得到的细胞的特性分析及MLR)
为了确认上述实施例中得到的树突状细胞(P2Exp21的DC制品(S/P＝无/有阿法链道酶)的功能，进行了混合淋巴细胞反应(MLR)解析。在MLR解析中，与同种CD4阳性细胞进行共培养并评价淋巴细胞刺激能力。
MLR的步骤如下所述。
(材料及方法)
[必要物品]
15mL锥形管
带盖子的FACS管
蓝色管
2/5/10mL移液管
PBS
PBS/FBS：PBS/2％FBS、PBS/1％FBS
RPMI
R10：RPMI/10％FBS
96孔U底板(Nunc Cat#163320)
BD IMag Human CD4 T Lymphocyte Enrichment Set-DM(BD Biosciences，Cat#557939)
CFSE(Sigma Aldrich，Cat#150347594)
※调整为1mM进行分注并在-20℃下冷冻保存。对于冷冻融化，一旦进行4次，便废弃(在盖子上记入“正”字)
V450-Anti CD3 Ab(BD Horizon，Cat#560365)
APC Cy7-Anti CD4 Ab(BioLegend，Cat#300517)
淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)
CELLBANKER1
微量移液管(2、10、20、100、200、1000μL)
带过滤器的芯片(10、20、100、200、1000μL)
移液管助吸器(Pipette-Aid)
[必要机器]
保证品质的离心机
血细胞计算盘计数器
倒立显微镜
(Allogeneic CD4细胞的分离)
<PBMC的分离>
1)将肝素采血的健康人外周血10mL通过使用了淋巴细胞分离剂的比重离心分离法来分离成PBMC。
<CD4细胞的分离>
1)如下所示调制1％FBS/2mMEDTA/PBS…[A]。
PBS 16mL+BSA 160μL+EDTA 64μL(0.5M)
2)向PBMC中按照成为10×10^6个/mL的方式添加[A]，用P1000进行悬浮，转移至带盖的FACS管中。
3)添加5μL/1×10^6个的Biotinylated Human T Lymphocyte EnrichmentCocktail，用P1000进行移液，以15min、RT进行孵化。
4)添加[A]并定容至4mL，进行离心(700g、5min、制动1)，除去上清液(使用P1000芯片)。
5)用P1000添加1mL的[A]并进行悬浮，进一步添加3mL的[A]。
6)进行离心(700g、5min、制动1)，除去上清液(使用P1000芯片)。
7)再一次实施步骤5)～6)。
8)将BD IMag Streptavidin Particle Plus-DM涡旋后，添加5μL/1×10^6个。
9)用P1000进行悬浮(如果未松解则使用P200)，用RT进行孵化30min。
以下，进行操作特别注意不要起泡。
10)添加1.6mL的[A](调整为2mL、按照成为20～80×10^6个/mL的范围的方式)(管[1])。
11)将管[1]在磁铁上静置6min。
12)用2mL移液管按照不与管[1]的深处接触的方式将上清液回收至新的管[2]中。
13)向管[1]中添加2mL的[A]并使其悬浮，将管[1]及[2]在磁铁上静置6min。
14)用2mL移液管将上清液从管[2]回收到15mL管中后，将管[1]的上清液回收到管[2]中。
15)将管[2]在磁铁上静置6min，15mL管在冰上静置。
16)用2mL移液管从管[2]合并上清液至15mL管中。
17)用R10(RPMI/10％FBS)定容成14mL。
18)在离心(700g、5min)后，除去上清液。
17)使其悬浮在RPMI 10mL中，对细胞数进行计数。
18)离心(700g、5min)后，除去上清液。
19)在MLR setup的前一日之前进行分离，将全部的细胞冷冻。用CELLBANKER1调整为5×10^6个/mL，各分注5×10^6个/管，放入BICELL中在-80℃下保存。
(MLR第1天)
<DC制剂的解冻>
1)DC制剂的解冻、树突状细胞数的计数依据ATL-DC-101最终施用制剂的调制来进行(其中使用PBS来代替生理盐水)。
2)基于所计数的树突状细胞数，使用R10(RPMI/10％FBS)来调整0.3mL左右的2×10^5个/mL DC细胞悬浮液(A)。剩余的DC用于细胞表面抗原的染色。
以下，将细胞悬浮液缓和地涡旋后进行分取。
3)由DC细胞悬浮液(A)来调制0.5mL的2×10^4个/mL DC细胞悬浮液(B)。
4)由DC细胞悬浮液(B)来调制0.5mL的2×10^3个/mL DC细胞悬浮液(C)。
5)**如下图所示，向96孔U底板的F-7、8、E-7、8、D-7、8中分别各加入100μL的DC细胞悬浮液(A)、(B)、(C)。此外，向C-5、7、8、D-5、E-5、F-5中加入100μL的R10。
[化学式1]
Figure BDA0003797881500000691
6)为了防止蒸发，向96孔板的最外侧的孔(36孔)中各加入200μL的Milli-Q水。
7)将板在4℃下冷却。(以后，在取出时注意盖子的水滴不要接触缓冲液)
**为了镜检用而制作另一组同样的板。无需用于双联体(Doublet)或校正(compensation)。
<CD4细胞的解冻和CFSE标记>
1)向15mL锥形管中加入14mL的R10，在37℃水浴内加温。
2)在R10温后，将CD4细胞冷冻管在37℃水浴内急速熔化。
3)解冻后立即将管内的细胞液转移至温热的R10中，将盖子紧密地关闭并颠倒搅拌。
4)离心(700g、5min、RT)
5)用抽吸移液管(aspiration pipette)吸引上清液后，用13mL的R10悬浮细胞。
6)离心(700g、5min、RT)。
7)用抽吸移液管吸引上清液后，用10mL的R10悬浮细胞。
8)对细胞数进行计数。(细胞悬浮液：trypan blue＝1：1)
9)离心(700g、5min、RT)
10)用移液管吸引上清液后，用R10将细胞调整为2×10^6个/mL。
11)向板的C-5、E-5、F-5中各添加100μL的细胞悬浮液，再次将板在4℃下冷却。
12)将残留的细胞全部转移至带盖子的FACS管中。
13)离心(700g、5min、RT)
14)用移液管吸引上清液。
15)用4mL的PBS悬浮细胞。
16)将步骤13)-15)进一步重复2次。(可不转移至新的带盖FACS管中)
17)离心(700g、5min、RT)
18)用P1000芯片吸引上清液
19)按照成为0.5～1×10^7cells/mL的方式，用0.4mL的PBS悬浮细胞。
20)关掉洁净台的电。
21)添加2μL的CFSE(1mM)，将管振荡而充分混合(final conc 5μM)
21)将细胞在孵化器中加温(37℃、15min)。
22)将细胞简单地涡旋，添加3.6mL的R10，使其合计为4mL。
23)离心(700g、5min、RT)
24)用P1000芯片吸引上清液。
25)简单地涡旋，添加4mL的R10。
26)将步骤23)-25)进一步重复2次。
27)离心(700g、5min、RT)
28)用P1000芯片吸引上清液。
29)将细胞用R10调整为2×10^6个/mL。
30)向板的D-5、C-7、8、D-7、8、E-7、8、F-7、8中各添加100μL的细胞(不需要移液)。
31)将板用铝箔进行遮光(不密闭)。
31)在37℃下孵化4天。
(MLR第5天)
<回收·洗涤、FCM解析>
1)向7个蓝色管中各分注3mL的1％FBS/PBS。
2)从96孔板中将各个细胞回收至蓝色管中。双联体合并至1管。(使用P200充分地悬浮并回收。注意不要起泡。)
3)离心(700g、5min、RT)后，通过倾析来除去上清液，进行涡旋。
4)各添加4mL的1％FBS/PBS。
5)再一次重复步骤3)及4)。
6)离心(700g、5min、RT)后，通过倾析来除去上清液，进行涡旋。
7)各添加100μL的1％FBS/PBS。
8)分别添加抗体，进行涡旋。
(抗体添加量：V450-CD3 Ab 5μL、APC Cy7-CD4 Ab 1μL)
9)在4℃下遮光20min(将管架放在冰上)。
10)添加4mL的1％FBS/PBS，以440g、5min、4℃进行离心。
11)通过倾析来除去上清液，进行涡旋。
12)再一次重复步骤9)及10)。
13)用450μL的1％FBS/PBS悬浮并涡旋。
14)实施FCM解析。
(使用检体)
DC：
P2Exp14 CE-DC190625(2.5×10^6个/管×1管)
P2Exp21-S-DC200129(2.5×10^6个/管×1管)
P2Exp21-P-DC200129(2.5×10^6个/管×1管)
CD4细胞：HD-CD4-200124(4.8×10^6个/管×2管)
(结果)
·P2EXP21的DC制品(S/P)都为MLR反应阳性。此外，关于反应强度，S确认到稍高的倾向，但不是明显的差异。
[表6]
MLR
Figure BDA0003797881500000721
*CD4细胞在解冻后，接种0.6×10^6个(目视计数)，对剩余的细胞实施CFSE标记。
(结果)
将结果示于图11中。
如所示那样，不管有无DNase处理，在通过本发明的方法得到的DC中，都确认到CFSE衰减的CD4阳性细胞，因此表示具有CD4阳性细胞刺激能力。
图11中，示出以下的试样的树突状细胞制品的功能试验结果。
1)P2Exp14 CE-DC190625(利用以往方法的单采原料)(作为阳性对照而使用：由使用以往方法的单采原料制造的树突状细胞制品中在以前功能试验合格的制品)
2)P2Exp21-S-DC200129(利用Optia(本发明的方法)的单采原料、无DNase处理)
3)P2Exp21-P-DC200129(利用Optia(本发明的方法)的单采原料、有DNase处理)
由图11可知：1)2)3)所有树突状细胞制品对于树突状细胞浓度依赖性都具有CD4+T细胞刺激能力。未确认到树突状细胞的功能因DNase的有无而存在明显的差异。
由以上证明：由通过本发明的方法得到的单核细胞制造的Tax肽脉冲树突状细胞为功能性。
(实施例9：从P1 ATL-DC最终制剂至施用为止的调制流程)
最终制剂(冷冻保存细胞+添附融化液)在进行出货判定试验：活细胞数、无菌试验、内毒素、支原体(PCR法)后，对患者进行施用。
在施用时，细胞融化，调制用于皮下施用的细胞悬浮液，每1次施用5×106个细胞
每2周施用3次。
工序内试验(CPC)：(最终离心上清液)
进行无菌试验、内毒素。
(实施例10：单核细胞回收及淋巴细胞除去)
在实施例10中，使用了与实施例1同样的方案，但如下所示变更采集偏好值。
单采开始后0～1小时：采集偏好值+30
单采开始后1～3小时：采集偏好值+20
以该条件进行采集，结果得到高纯度的单核细胞(表7)。通过得到高纯度的单核细胞，受试体的淋巴细胞除去率降低，因此尝试了在单核细胞采集后追加二级腔室分离方式(MNC)程序的以偏好自动设定值的单采(淋巴细胞除去模式(偏好自动设定值(30～50))。具体而言，在单核细胞采集后将偏好恢复成自动设定值进行采集。
[表7]
Figure BDA0003797881500000741
(结果)
通过追加本工序，能够除去与在以往的采集时能够除去的淋巴细胞数同等的淋巴细胞。
(实施例11：治疗)
若使用实施例10中采用的条件，则作为树突状细胞的原料采集时的单采来使用，目的是通过离心分离法来采集作为树突状细胞的原料的单核细胞，但也是治疗用途(Therapeutic cytapheresis)。
于是，利用该条件，除去将Treg等的抗肿瘤免疫控制为负的免疫细胞。对于之后施用的树突状细胞，对在为了维持恒常性而产生的细胞因子环境下新增殖的初始T淋巴细胞能够进行抗原呈递。
在本实施例中，通过并用淋巴细胞除去模式(偏好自动设定值(30～50))，从而原料采集时的单采通过离心分离法而能够采集作为树突状细胞的原料的高纯度的单核细胞，变得能够除去由通常的治疗单采达成那样的水平即109水平的淋巴细胞(表8)。
[表8]
Figure BDA0003797881500000751
需要说明的是，表8淋巴细胞除去不包括通过单核细胞采集工序来除去淋巴细胞，将单核细胞采集工序和淋巴细胞除去工序的淋巴细胞数加在一起的数目如下所示。
HD10：29.3×10^8
HD25：19.8×10^8
HD04：21.8×10^8
认为，在设定为比自动设定值高的值时，单核细胞分级、血小板分级增加，在设定为低值时，嗜中性粒细胞、红细胞分级增加，从而淋巴细胞除去率降低。此外认为：对于单核细胞采集工序后的淋巴细胞除去，为了在密度梯度离心分离层稳定后进行采集，优选实施20分钟以上(如果可能，则为30分钟以上)。
以下，示出表示单核细胞分级(取出)工序及淋巴细胞分级(取出)工序的比较的数据。
[表9]
Figure BDA0003797881500000752
其结果可以期待：将构成癌症患者的免疫耐受状态的Treg等的抑制系统的免疫细胞除去，进而利用通过维持生物体恒常性而新产生的淋巴细胞、细胞因子来诱导抗肿瘤免疫的赋活。
(注释)
综上所述，使用本发明的优选的实施方式来例示了本发明，但是可理解为本发明应当仅通过权利要求书来解释其范围。在本说明书中引用的专利、专利申请及其他文献可理解为与其内容本身被具体记载于本说明书的情况同样地援引该内容作为针对本说明书的参考。本申请对在2020年2月20日申请的日本特愿2020-27595及在2020年5月1日申请的日本特愿2020-81523主张优先权，它们的内容整体作为参考被援引于此。
产业上的可利用性
本发明所提供的技术可以在成人T细胞白血病等的治疗药的制造业中进行利用。

Claims (112)

1.一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；以及
2)将该血液试样基于比重及细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述工序2)将所述血液试样基于比重进行单核细胞浓缩，接着，基于细胞尺寸进行单核细胞浓缩。
3.一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血细胞浓度低于规定值的血液试样的工序；以及
2)将该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～20。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好的规定值为30～50。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
11.根据权利要求5～10中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为40～80。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，在所述浓缩工序中，包括进行溢出的步骤。
13.一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；以及
2)从该血液试样基于比重和/或细胞尺寸进行单核细胞浓缩的工序，在该浓缩工序中，包括使淋巴细胞级分溢出以将淋巴细胞级分除掉。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，对于所述溢出，在作为溢出将红细胞从腔室持续地溢出的时刻的处理血液量(基准处理血液量)的值设定为1的情况下，所述溢出能够将处理血液量设定为比基准处理血液量大的值来实施。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述处理血液量为所述基准处理血液量的至少1.2倍。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其特征在于，所述单核细胞试样由从所述受试者获得的血细胞试样直接获得。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述浓缩在从所述受试者获得所述血液试样之后5小时以内进行。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，所述基于细胞尺寸的分离在所述基于比重的分离之后3小时以内进行。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其特征在于，所述单核细胞试样包含相对于全部有核细胞为约30％以上的浓度的单核细胞。
20.一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)从受试者获得血液试样的工序；
2)向该血液试样中添加冷冻保护剂的工序；以及
3)将加有该冷冻保护剂的该血液试样基于比重进行分离，获得比淋巴细胞重的级分的工序。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述血液试样是经过单采分离的试样。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述冷冻保护剂包含选自羟乙基淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇、丙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨糖醇及葡聚糖中的成分。
23.根据权利要求20～22中任一项所述的方法，其特征在于，所述浓缩在冷冻保存后进行。
24.根据权利要求20～23中任一项所述的方法，其特征在于，所述基于比重的分离以1.074～1.076的比重进行离心分离。
25.根据权利要求20～24中任一项所述的方法，其中，所述基于比重的分离通过以下的离心分离条件进行：
第1次离心分离 225mL离心管 300×g～400×g 5分钟室温；
第2～3次离心分离 225mL离心管 250×g～350×g 5分钟室温。
26.根据权利要求20～25中任一项所述的方法，其中，所述浓缩在进行权利要求1～19中任一项所述的单采处理之后进行。
27.一种方法，其是由血液试样生产单核细胞试样的方法，所述方法包括：
1)由所得到的血液试样获得包含冷冻保护剂的单核细胞试样的工序；以及
2)将该单核细胞试样用洗涤液进行洗涤的工序，所述洗涤液包含10％以下的含有柠檬酸钠水合物的血液保存液A液(ACD-A液)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述ACD-A液以6％以下存在。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述ACD-A液以5.5％存在。
30.根据权利要求20～29中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述血液试样用洗涤液进行洗涤，所述洗涤液具有5.5％ACD-A液/1％人血清白蛋白(HSA)/RPMI-1640的组成。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括进行死细胞除去处理。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述死细胞除去处理包括将淋巴细胞及血小板也除去。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中，所述死细胞除去处理包括比重离心分离。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述比重离心分离使用密度介质碘克沙醇(Iodixanol)水溶液来进行。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述碘克沙醇水溶液以60w/v％来提供。
36.根据权利要求1～35中任一项所述的方法，其中，所述浓缩在无添加DNase或添加DNase的情形下进行。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述DNase包含阿法链道酶。
38.一种生产Tax特异性树突状细胞的方法，其包括：
由通过权利要求1～37中任一项所述的方法获得的单核细胞试样诱导树突状细胞的工序；以及
对该诱导的树突状细胞进行Tax抗原肽脉冲的工序。
39.一种生产再生医疗等制品的方法，其包括下述工序：将使通过权利要求38所述的方法生产的所述Tax特异性树突状细胞悬浮于冷冻保护液中而得到的物质填充到冻存管中，制成再生医疗等制品。
40.一种再生医疗等制品，其是通过权利要求39所述的方法生产的。
41.一种生产单核细胞含有物的系统，其包含具有调整血细胞浓度的功能的单采装置、实现溢出的机构、将细胞进行尺寸分离的尺寸分离部、投入冷冻保护剂的冷冻保护剂投入部、基于比重进行单核细胞分离的单核细胞分离部、和死细胞除去机构中的至少一者。
42.根据权利要求41所述的系统，其中，所述系统还包含基于比重的分离部、冷冻保存细胞的冷冻保存部、进行解冻洗涤的解冻洗涤部、和进行比重离心分离的比重离心分离部中的至少一者。
43.一种方法，其是治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
45.根据权利要求43所述的方法，其中，所述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
48.根据权利要求45～47中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好的规定值为30～50。
49.根据权利要求45～48中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
51.根据权利要求45～50中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为40～80。
52.根据权利要求43～51中任一项所述的方法，其中，所述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述取出单核细胞的工序包含权利要求1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中，所述取出淋巴细胞的工序包含权利要求43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，所述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
56.根据权利要求52～55中任一项所述的方法，其中，所述取出淋巴细胞的工序将所述采集偏好设定为30～50来实施。
57.一种程序，其是使电脑执行治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法的程序，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
58.根据权利要求57所述的程序，其中，所述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
59.根据权利要求57所述的程序，其中，所述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
60.根据权利要求59所述的程序，其中，所述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
61.根据权利要求59或60所述的程序，其中，所述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
62.根据权利要求59～61中任一项所述的程序，其中，所述采集偏好的规定值为30～50。
63.根据权利要求59～62中任一项所述的程序，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
64.根据权利要求63所述的程序，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
65.根据权利要求59～64中任一项所述的程序，其中，所述采集偏好被设定为40～80。
66.根据权利要求57～65中任一项所述的程序，其中，所述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
67.根据权利要求66所述的程序，其中，所述取出单核细胞的工序包含权利要求1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
68.根据权利要求66或67所述的程序，其中，所述取出淋巴细胞的工序包含权利要求43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，所述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
69.根据权利要求68所述的程序，其中，所述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
70.根据权利要求66～69中任一项所述的程序，其中，所述取出淋巴细胞的工序将所述采集偏好设定为30～50来实施。
71.一种记录介质，其是存储有如下程序的记录介质，所述程序使电脑执行治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的方法，该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
72.根据权利要求71所述的记录介质，其中，所述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
73.根据权利要求71所述的记录介质，其中，所述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
74.根据权利要求73所述的记录介质，其中，所述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
75.根据权利要求73或74所述的记录介质，其中，所述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
76.根据权利要求73～75中任一项所述的记录介质，其中，所述采集偏好的规定值为30～50。
77.根据权利要求73～76中任一项所述的记录介质，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
78.根据权利要求77所述的记录介质，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
79.根据权利要求73～78中任一项所述的记录介质，其中，所述采集偏好被设定为40～80。
80.根据权利要求71～79中任一项所述的记录介质，其中，所述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
81.根据权利要求80所述的记录介质，其中，所述取出单核细胞的工序包含权利要求1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
82.根据权利要求80或81所述的记录介质，其中，所述取出淋巴细胞的工序包含权利要求43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，所述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
83.根据权利要求82所述的记录介质，其中，所述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
84.根据权利要求80～83中任一项所述的记录介质，其中，所述取出淋巴细胞的工序将所述采集偏好设定为30～50来实施。
85.一种系统，其是用于治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的系统，该系统包含：
1)从该患者获得血液试样的试样取得部；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的测定部；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的同等试样取得部，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
86.根据权利要求85所述的系统，其中，所述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
87.根据权利要求85所述的系统，其中，所述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
88.根据权利要求87所述的系统，其中，所述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
89.根据权利要求87或88所述的系统，其中，所述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
90.根据权利要求87～89中任一项所述的系统，其中，所述采集偏好的规定值为30～50。
91.根据权利要求87～90中任一项所述的系统，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
92.根据权利要求91所述的系统，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
93.根据权利要求87～92中任一项所述的系统，其中，所述采集偏好被设定为40～80。
94.根据权利要求85～93中任一项所述的系统，其中，所述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
95.根据权利要求94所述的系统，其中，所述取出单核细胞的工序包含权利要求1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
96.根据权利要求94或95所述的系统，其中，所述取出淋巴细胞的工序包含权利要求43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，所述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
97.根据权利要求96所述的系统，其中，所述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
98.根据权利要求94～97中任一项所述的系统，其中，所述取出淋巴细胞的工序将所述采集偏好设定为30～50来实施。
99.一种方法，其是用于治疗成人T细胞白血病(ATL)患者的系统的操作方法，该系统包含：
1)从该患者获得血液试样的试样取得部；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的测定部；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的同等试样取得部，
该方法包括：
1)从该患者获得血液试样的工序；
2)在该血液试样中测定血细胞浓度的工序；以及
3)在该血细胞浓度低于规定值的情况下，从该患者获得血细胞浓度与规定值同等的血液试样的工序，
该患者是为了取得用于治疗该ATL的树突状细胞制剂而接受单采的患者。
100.根据权利要求99所述的方法，其中，所述规定值是用于取得血沉棕黄层的值。
101.根据权利要求99所述的方法，其中，所述血细胞浓度参照采集偏好来调整。
102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比下式高的值，
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为：
60-[(0.2×白细胞数(1000/μl))+(0.08×血小板数(1000/μl)]+10～30。
104.根据权利要求101～103中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好的规定值为30～50。
105.根据权利要求101～104中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高10～30。
106.根据权利要求105所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为比规定值高20～30。
107.根据权利要求101～106中任一项所述的方法，其中，所述采集偏好被设定为40～80。
108.根据权利要求99～107中任一项所述的方法，其中，所述获得血液试样的工序包括：取出单核细胞的工序和取出淋巴细胞的工序。
109.根据权利要求108所述的方法，其中，所述取出单核细胞的工序包含权利要求1～36中任一项或多项所述的至少1个特征。
110.根据权利要求108或109所述的方法，其中，所述取出淋巴细胞的工序包含权利要求43～51中任一项或多项所述的至少1个特征，所述取出淋巴细胞的工序在接着取出单核细胞的工序而实施的情况下，实施至少20分钟以上。
111.根据权利要求110所述的方法，其中，所述取出淋巴细胞的工序实施30分钟以上。
112.根据权利要求108～111中任一项所述的方法，其中，所述取出淋巴细胞的工序将所述采集偏好设定为30～50来实施。
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