JP7024145B2 - 末梢血原料の採取／凍結融解工程における単球純化法 - Google Patents

Description

本開示は新規単核球調製技術に関する。より特定すると、本開示は、末梢血原料の採取/凍結融解工程における単球純化法に関する。特に、本開示は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）治療に適した樹状細胞製剤（特に、Tax抗原ペプチドをパルスした再生医療等製品）の
製造に最適な技術を提供する。

一般臨床において造血幹細胞移植で用いられているアフェレーシス原料の組成は、主に血球成分であるリンパ球、単球および採取に伴い混入する好中球、赤血球、血小板、血漿がある。

アフェレーシス原料の凍結融解による影響は成分毎に異なり、特に好中球、リンパ球、赤血球は凍結ストレスによる脆弱性の問題、血小板は活性化に伴う凝固誘発による凝集塊形成により単球の損失につながる。したがってアフェレーシスによる原料採取では、可能な限りこれらの成分の混入を避け単球純度の高い原料を採取することが、その後の製品の収量、品質に大きく関わってくる。

本開示は、ＡＴＬ治療製品である樹状細胞製品（例えば、ＡＴＬ－ＤＣ－１０１）の製造に関するものであり、末梢血単核球採取工程および凍結原料融解後の比重遠心工程における単球純化法を含む。本開示の樹状細胞製品は、末梢血単核球成分（アフェレーシス原料）に含まれる単球から樹状細胞を誘導し、標的となるＴａｘ抗原ペプチドをパルスした再生医療等製品を含む。本開示の製品は自家の樹状細胞製品となるため、患者アフェレーシス原料を製造施設へ搬送する工程が生じるが、新鮮原料の場合、搬送による原料の品質変化、搬送中のリスク（交通事情、人的事故、自然災害等）による搬送時間延長に伴う品質劣化、原料内のＨＴＬＶ－１ウイルス感染拡大が問題となる（ＡＴＬ患者アフェレーシス検体にはＨＴＬＶ－１感染細胞が含まれる）。そこで治療の普及には、患者アフェレーシス原料を凍結して製造施設へ搬送し、凍結原料から樹状細胞を調製する製造法の確立が必要となる。本開示により凍結原料からの単球の純化を図ることが可能となれば、製造施設から遠隔地の患者に対しても治療普及が可能となる。

本開示は例えば、以下を提供する。
（項目１）血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と、
２）該血液試料を、比重および細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程と
を包含する方法。
（項目２）前記工程２）は、前記血液試料を、比重に基づき単球を濃縮し、次いで細胞サイズに基づき単球を濃縮する、上記項目に記載の方法。
（項目３）血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血球濃度が所定値より低い血液試料を得る工程と、
２）該血液試料を、比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程と
を包含する方法。
（項目４）前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）前記採取プレファレンスは
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）前記採取プレファレンスは
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
μl）］＋１０～２０に設定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０（例えば、３０、４０、５０）である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）前記採取プレファレンスは、所定値より１０～２０高く設定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）前記採取プレファランスは４０～７０（例えば、４０、５０、６０、７０）に設定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）前記濃縮工程において、スピルオーバーさせることを包含する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と、
２）該血液試料から比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程であって、該濃縮工程において、リンパ球画分を取り除くように、リンパ球画分をスピルオーバーさせることを含む、工程と
を包含する、方法。
（項目１３）前記スピルオーバーは、スピルオーバーとしてチャンバーから赤血球が継続的に溢れ出した時点での処理血液量（基準処理血液量）の値を１とした場合、前記スピルオーバーは、処理血液量を基準処理血液量より大きい値に設定して実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）前記処理血液量は、前記基準処理血液量の少なくとも１．２倍である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）前記単球試料は、前記被験者から得られる血球試料から直接得るものであることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）前記濃縮は、前記血液試料を前記被験者から得た後５時間以内に行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）前記細胞サイズによる分離は、前記比重による分離の後３時間以内に行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）前記単球試料は、全有核細胞に対して約３０％以上の濃度の単球を含むことを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）被験者から血液試料を得る工程と、２）該血液試料に凍結保護剤を添加する工程と、３）該凍結保護剤を加えた該血液試料を比重により分離し、リンパ球より重い画分を得る工程とを包含する、方法。（項目２０）前記血液試料は、アフェレーシス分離を経たものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）前記凍結保護剤は、ヒドロキシエチルスターチ、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、トレハロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、およびデキストランからなる群より選択される成分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）前記濃縮は、凍結保存後になされることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）前記比重による分離は、１．０７４～１．０７６、好ましくは１．０７５の比重で遠心分離することを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）前記比重による分離は、以下の遠心分離条件によりなされる
遠心分離１回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ３００×ｇ～４００×ｇ（例えば、３５０×ｇ） ５分 室温
遠心分離２～３回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ２５０×ｇ～３５０×ｇ（例えば、３００×ｇ）５分 室温
項目１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）前記濃縮は、上記項目のいずれか一項に記載されるアフェレーシス処理がなされた後になされる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）得られた血液試料から、凍結保護剤を含む単球試料を得る工程と
２）該単球試料を、クエン酸ナトリウム水和物を含有する血液保存液Ａ液ＡＣＤ－Ａ液を１０％以下で含む洗浄液で洗浄をする工程とを包含する方法。
（項目２７）前記ＡＣＤ－Ａ液は６％以下で存在する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）前記ＡＣＤ－Ａ液は５．５％で存在する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）前記血液試料を、５．５％ＡＣＤ－Ａ液／１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＲＰＭＩ－１６４０の組成を有する洗浄液で洗浄することを包含する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）死細胞除去処理を行うことをさらに包含する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）前記死細胞除去処理は、リンパ球および血小板をも除去することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）前記死細胞除去処理は、比重遠心分離を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）前記比重遠心分離は、密度媒体ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液を用いて行うことを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）前記ヨージキサノール水溶液は６０ｗ／ｖ％で提供される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）前記濃縮は、ＤＮａｓｅの添加なしまたはありで行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）前記ＤＮａｓｅはプルモザイムを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）上記項目のいずれか一項に記載の方法で得られた単球試料から樹状細胞を誘導する工程と、該誘導した樹状細胞に対してＴａｘ抗原ペプチドをパルスする工程と
を包含する、Ｔａｘ特異的樹状細胞を生産する方法。
（項目３８）上記項目のいずれか一項に記載の方法で生産された前記Ｔａｘ特異的樹状細胞を、凍結保護液に懸濁したものを容器（クライオチューブまたはクライオバッグ等）に充填し、再生医療等製品とする工程を包含する、再生医療等製品を生産する方法。
（項目３９）上記項目のいずれか一項に記載される方法で生産される、再生医療等製品。
（項目４０）血球濃度を調整する機能を有するアフェレーシス装置と、
スピルオーバーを実現する手段と、
細胞をサイズ分離するサイズ分離部と、
凍結保護剤を投入する凍結保護剤投入部と、
比重により単球の分離を行う単球分離部と、
死細胞除去手段と
のうち、少なくとも１つを含む、単球含有物を生産するシステム。
（項目４１）上記項目のいずれか一項または複数の項に記載される少なくとも一つの特徴をさらに含む、項目４０に記載のシステム。
（項目４２）
比重による分離部と、細胞を凍結・保存する凍結保存部と、解凍洗浄を行う解凍洗浄部と、比重遠心分離を行う比重遠心分離部とのうち、少なくとも１つをさらに含む、項目４０または４１に記載のシステム。
さらに、本開示は、以下の項目も提供する。
（項目Ａ１）
血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と、
２）該血液試料を、比重および細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程と
を包含する方法。
（項目Ａ２）
前記工程２）は、前記血液試料を、比重に基づき単球を濃縮し、次いで細胞サイズに基づき単球を濃縮する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３）
血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血球濃度が所定値より低い血液試料を得る工程と、
２）該血液試料を、比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程と
を包含する方法。
（項目Ａ４）
前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５）
前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ６）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ７）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
μl）］＋１０～２０に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ８）
前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ９）
前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１１）
前記採取プレファレンスは４０～８０（４０、５０、６０、７０、８０）に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１２）
前記濃縮工程において、スピルオーバーさせることを包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１３）
血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と、
２）該血液試料から比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程であって、該濃縮工程において、リンパ球画分を取り除くように、リンパ球画分をスピルオーバーさせることを含む、工程と
を包含する、方法。
（項目Ａ１４）
前記スピルオーバーは、スピルオーバーとしてチャンバーから赤血球が継続的に溢れ出した時点での処理血液量（基準処理血液量）の値を１とした場合、前記スピルオーバーは、処理血液量を基準処理血液量より大きい値に設定して実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１５）
前記処理血液量は、前記基準処理血液量の少なくとも１．２倍である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１６）
前記単球試料は、前記被験者から得られる血球試料から直接得るものであることを特徴とする、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１７）
前記濃縮は、前記血液試料を前記被験者から得た後５時間以内に行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１８）
前記細胞サイズによる分離は、前記比重による分離の後３時間以内に行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１９）
前記単球試料は、全有核細胞に対して約３０％以上の濃度の単球を含むことを特徴とする、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２０）
血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と、
２）該血液試料に凍結保護剤を添加する工程と、
３）該凍結保護剤を加えた該血液試料を比重により分離し、リンパ球より重い画分を得る工程と
を包含する、方法。
（項目Ａ２１）
前記血液試料は、アフェレーシス分離を経たものである、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２２）
前記凍結保護剤は、ヒドロキシエチルスターチ、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、トレハロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、およびデキストランからなる群より選択される成分を含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２３）
前記濃縮は、凍結保存後になされることを特徴とする、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２４）
前記比重による分離は、１．０７４～１．０７６の比重で遠心分離することを特徴とする、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２５）
前記比重による分離は、以下の遠心分離条件によりなされる
遠心分離１回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ３００×ｇ～４００×ｇ ５分 室温
遠心分離２～３回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ２５０×ｇ～３５０×ｇ ５分 室温
上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２６）
前記濃縮は、上記項目のいずれか1項に記載されるアフェレーシス処理がなされた後になされる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２７）
血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）得られた血液試料から、凍結保護剤を含む単球試料を得る工程と
２）該単球試料を、クエン酸ナトリウム水和物を含有する血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ液）を１０％以下で含む洗浄液で洗浄をする工程と
を包含する方法。
（項目Ａ２８）
前記ＡＣＤ－Ａ液は６％以下で存在する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ２９）
前記ＡＣＤ－Ａ液は５．５％で存在する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３０）
前記血液試料を、５．５％ＡＣＤ－Ａ液／１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＲＰＭＩ－１６４０の組成を有する洗浄液で洗浄することを包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３１）
死細胞除去処理を行うことをさらに包含する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３２）
前記死細胞除去処理は、リンパ球および血小板をも除去することを含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３３）
前記死細胞除去処理は、比重遠心分離を含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３４）
前記比重遠心分離は、密度媒体ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液を用いて行うことを特徴とする、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３５）
前記ヨージキサノール水溶液は６０ｗ／ｖ％で提供される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３６）
前記濃縮は、ＤＮａｓｅの添加なしまたはありで行われる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３７）
前記ＤＮａｓｅはプルモザイムを含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ３８）
上記項目のいずれか1項に記載の方法で得られた単球試料から樹状細胞を誘導する工程と、
該誘導した樹状細胞に対してＴａｘ抗原ペプチドをパルスする工程と
を包含する、Ｔａｘ特異的樹状細胞を生産する方法。
（項目Ａ３９）
項目Ａ３８に記載の方法で生産された前記Ｔａｘ特異的樹状細胞を、凍結保護液に懸濁したものをクライオチューブに充填し、再生医療等製品とする工程を包含する、再生医療等製品を生産する方法。
（項目Ａ４０）
項目Ａ３９に記載される方法で生産される、再生医療等製品。
（項目Ａ４１）
血球濃度を調整する機能を有するアフェレーシス装置と、
スピルオーバーを実現する手段と、
細胞をサイズ分離するサイズ分離部と、
凍結保護剤を投入する凍結保護剤投入部と、
比重により単球の分離を行う単球分離部と、
死細胞除去手段と
のうち、少なくとも１つを含む、
単球含有物を生産するシステム。
（項目Ａ４２）
比重による分離部と、細胞を凍結・保存する凍結保存部と、解凍洗浄を行う解凍洗浄部と、比重遠心分離を行う比重遠心分離部とのうち、少なくとも１つをさらに含む、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ４３）
成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法であって、
１）該患者から血液試料を得る工程と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
を含む、方法であって、
該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
方法。
（項目Ａ４４）
前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ４５）
前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ４６）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ４７）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］＋１０～３０に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ４８）
前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ４９）
前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５０）
前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５１）
前記採取プレファレンスは４０～８０（４０、５０、６０、７０、８０）に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５２）
前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５３）
前記単球を取り出す工程は、項目Ａ１～３６のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５４）
前記リンパ球を取り出す工程は、項目Ａ４３～５１のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含み、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５５）
前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５６）
前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ５７）
成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法をコンピュータに実行させるプログラムであって、該方法は、
１）該患者から血液試料を得る工程と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
を含み、
該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
プログラム。
（項目Ａ５８）
前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ５９）
前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６０）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６１）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］＋１０～３０に設定される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６２）
前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６３）
前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６４）
前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６５）
前記採取プレファレンスは４０～８０（４０、５０、６０、７０、８０）に設定される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６６）
前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６７）
前記単球を取り出す工程は、項目Ａ１～３６のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含む、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６８）
前記リンパ球を取り出す工程は、項目Ａ４３～５１のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含み、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ６９）
前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ７０）
前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、上記項目のいずれか1項に記載のプログラム。
（項目Ａ７１）
成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法をコンピュータに実行させるプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は、
１）該患者から血液試料を得る工程と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
を含み、
該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
記録媒体。
（項目Ａ７２）
前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７３）
前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７４）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７５）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］＋１０～３０に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７６）
前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７７）
前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７８）
前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ７９）
前記採取プレファレンスは４０～８０（４０、５０、６０、７０、８０）に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ８０）
前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ８１）
前記単球を取り出す工程は、項目Ａ１～３６のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含む、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ８２）
前記リンパ球を取り出す工程は、項目Ａ４３～５１のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含み、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ８３）
前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ８４）
前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、上記項目のいずれか1項に記載の記録媒体。
（項目Ａ８５）
成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療するためのシステムであって、
１）該患者から血液試料を得る試料取得部と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する測定部と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る同等試料取得部と
を含み、
該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
システム。
（項目Ａ８６）
前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ８７）
前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ８８）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ８９）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］＋１０～３０に設定される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９０）
前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９１）
前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９２）
前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９３）
前記採取プレファレンスは４０～８０（４０、５０、６０、７０、８０）に設定される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９４）
前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９５）
前記単球を取り出す工程は、項目Ａ１～３６のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含む、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９６）
前記リンパ球を取り出す工程は、項目Ａ４３～５１のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含み、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９７）
前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９８）
前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、上記項目のいずれか1項に記載のシステム。
（項目Ａ９９）
成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療するためのシステムの作動方法であって、該システムは、
１）該患者から血液試料を得る試料取得部と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する測定部と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る同等試料取得部と
を含み、
該方法は、
１）該患者から血液試料を得る工程と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
を含み、
該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
方法。
（項目Ａ１００）
前記所定値はバフィーコートをとるための値である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０１）
前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０２）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］より高い値に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０３）
前記採取プレファレンスは、
６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］＋１０～３０に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０４）
前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０５）
前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０６）
前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０７）
前記採取プレファレンスは４０～８０（４０、５０、６０、７０、８０）に設定される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０８）
前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１０９）
前記単球を取り出す工程は、項目Ａ１～３６のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１１０）
前記リンパ球を取り出す工程は、項目Ａ４３～５１のいずれか1項または複数の項に記載される少なくとも１つの特徴を含み、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１１１）
前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
（項目Ａ１１２）
前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。

本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

本開示により、再生医療等製品として顕著な治療効果が期待される成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）治療を提供することができる。

図１は実施例５のプルモザイム処理ありの、融解洗浄後試料のフローサイトメトリー結果を示す。 図２は実施例５のプルモザイム処理ありのＯｐｔｉＰｒｅｐ処理後の単球の質および純度を示す結果である。 図３は実施例５のプルモザイム処理なしの、融解洗浄後試料のフローサイトメトリー結果を示す。 図４は実施例５のプルモザイム処理なしのＯｐｔｉＰｒｅｐ処理後の単球の質および純度を示す結果である。 図５は、実施例６で得られた樹状細胞（プルモザイムあり）の特性を確認したものである。図５は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。図５では、示されるように、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ（生存細胞とダブレットフリー）、ＤＣゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ－ＤＲ、リンパゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４およびＨＬＡ－ＤＲを示す。 図６は、実施例６で得られた樹状細胞（プルモザイムあり）の特性を確認したものである。図６は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。図６では、示されるように、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ（生存細胞とダブレットフリー）、ＤＣゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、リンパゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３を示す。 図７は、実施例６で得られた樹状細胞（プルモザイムあり）の特性を確認したものである。図７は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。図７では、示されるように、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ（生存細胞とダブレットフリー）、ＤＣゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、リンパゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を示す。 図８は、実施例６で得られた樹状細胞（プルモザイムなし）の特性を確認したものである。図８は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。図８では、示されるように、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ（生存細胞とダブレットフリー）、ＤＣゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ－ＤＲ、リンパゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４およびＨＬＡ－ＤＲを示す。 図９は、実施例６で得られた樹状細胞（プルモザイムなし）の特性を確認したものである。図９は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。図９では、示されるように、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ（生存細胞とダブレットフリー）、ＤＣゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、リンパゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８３を示す。 図１０は、実施例６で得られた樹状細胞（プルモザイムなし）の特性を確認したものである。図１０は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。図１０では、示されるように、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ（生存細胞とダブレットフリー）、ＤＣゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、リンパゲートでのＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を示す。 図１１は実施例８のＭＬＲの結果を示す。ＣＦＳＥで標識したＣＤ４細胞（ＣＦＳＥ－ＣＤ４）と樹状細胞（ＤＣ）とを、それぞれ、ＣＦＳＥ－ＣＤ４：ＤＣ＝１：０、１：０．１、１：０．０１、１：０．００１の比率で混合し単独培養または共培養した後に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ４抗体で標識した試料のフローサイトメトリー結果（特に、ＣＤ４）である。Ｐ２Ｅｘｐ１４、Ｐ２Ｅｘｐ２１－Ｓ、Ｐ２Ｅｘｐ２１－Ｐはそれぞれ、従来法を用いた工程で得られた樹状細胞（ＤＣ）、本開示の方法を用いてＤＮａｓｅ処理無しの工程で得られたＤＣ、本開示の方法を用いてＤＮａｓｅ処理有りの工程で得られたＤＣを使用した。 図１２は、実施例４のプロトコール模式図を示す。 図１３は、実施例５の抗体染色の抗体表を示す。 図１４は、本開示の製造法の模式図を示す。

以下に、本開示をさらに詳細に説明する。

本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a
」、「an」、「the」等）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理
解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

（定義）
最初に本開示において使用される用語および一般的な技術を説明する。

（ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）について）
ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）は、ヒトの成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬ）の原因として公知であるレトロウイルスである。ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）に起因する疾患としては、ＡＴＬが代表的であるが、その他にＨＴＬＶ－１関連ミエロパチー、ＨＴＶＬ－１ブドウ膜炎を引き起こす場合もある。ＨＴＬＶには、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＴＬＶ－３などの複数の型が挙げられる。このうちＨＴＬＶ－１は、長さ約９ｋｂのプロウイルス遺伝子を有する。ＨＴＬＶ－１のプロウイルス遺伝子は、Ｔａｘ、Ｒｅｘ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ等の種々のタンパク質をコードする。このうちＴａｘタンパク質は、完全長として約３５３アミノ酸残基を有し、宿主細胞内でＮＦ－κＢ、ＳＲＦ、ＣＲＥＢなどの宿主の転写因子の活性化、ｐ５３等のタンパク質の機能抑制など、多数の機能を有する。

ＨＴＬＶ－１の生体内の感染対象細胞として具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、樹状細胞が挙げられる。これら細胞は、ＨＴＬＶ－１に感染すると、ＨＴＬＶ－１がコードするＴａｘ等のタンパク質の部分ペプチド（例えばＴａｘ部分ペプチド）を、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して提示する。そこで、このＨＴＬＶ－１特異的な部分ペプチドを提示する細胞（すなわちＨＴＬＶ－１感染細胞）を標的とする細胞であって、生体内で免疫応答を惹起できるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＴＬともいう）を用いる免疫療法が、ＨＴＬＶ－１関連疾患、例えばＡＴＬの有用な免疫療法として報告されている（特開２００８－２２７０２、特開２０１４－１３３７１２、Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ２０１３ １２１：４８９４－４９０１など）。

本開示の単球は、樹状細胞を誘導するために用いられ、そのような樹状細胞は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導活性ペプチドなどでパルス刺激されることができる。このようなペプチドとしては、ＨＴＬＶ－Ｉに特異的なＣＴＬを誘導する活性を有するペプチドである限り特に制限されず、中でも、Ｔａｘ特異的なＣＴＬ誘導活性ペプチドを好適に例示することができ、中でも、ＨＬＡ－Ａ２４:０２拘束性ＣＴＬエピトープであるＴａｘ３０１－３０９（国際公開第２００４／０９２３７３号パンフレット参照）などを特に好適に例示することができる。ここで、例えば、ＨＬＡ－Ａ１１：０１に対するＴａｘペプチドは、本樹状細胞療法の標的になるペプチドの一つであり、なお樹状細胞自体は、標的を変えれば各種がんや、免疫制御目的で使用することも可能である。ＴＣＲ改変型Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２４に対するペプチドのみを標的にしているものであり、本開示では、Ｔａｘ ３０１－３０９を標的とすることも含まれる。例えば、本開示では、ＨＬＡ－Ａ２４：０１， ＨＬＡ－Ａ０２：０１，ＨＬＡ－Ａ０２：０７，ＨＬＡ－Ａ１１：０１を対象にすることができ、樹状細胞が体内で標的に対して攻撃可能なＴ細胞をＨＬＡ拘束性に刺激し活性化させたものを利用することができる。

近年、ヘルパーＴ細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞に対する癌抗原エピトープと、ＣＴＬであるＣＤ８＋Ｔ細胞に対する癌抗原エピトープを結合させた融合ペプチド（Ｈｅｌｐｅｒ／Ｋｉｌｌｅｒ－Ｈｙｂｒｉｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｌｏｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を被験対象に投与することによって、被験対象の癌細胞に対する免疫を効果的に高めることが知られている（例えばＣａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）１０３，１５０－１５３など）。本開示においても、適切なアミノ酸配列のペプチドを用いることによって、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを誘導し、ＨＴＬＶ－Ｉに対する免疫を効果的に高めることができる。また、Ｔａｘに対応する適切なアミノ酸配列のペプチドをパルスとして用いてＴａｘパルス樹状細胞を製造することができると考えられる。

（樹状細胞および単球）
樹状細胞（ＤＣ）は、ヒトにおいて細胞性免疫応答の開始および制御のため強力な抗原提示細胞であることが知られる。樹状細胞は、Ｔ細胞の応答性特異的クローンとの相互作用時にその潜在的特性のどちらのセットを発現するかに依存して、免疫賦活性または免疫抑制性のいずれになる場合もあることから、Ｔ細胞媒介性免疫反応における非常に重要な中心的役割を果たすと考えられている。広義だが広く支持された一般論として、未成熟樹状細胞はそれらのより成熟した対応物よりも「免疫寛容原性」であり、一方成熟樹状細胞はそれらの未成熟前駆体よりも「免疫原性」であると考えられている。樹状細胞は、単球からｅｘ ｖｉｖｏで生成され、特定の抗原を有し、いずれの免疫学的方向においても有効に機能する樹状細胞の能力は、患者に戻された後のそれらの生存率および活力に依存する。対抗的な免疫賦活と免疫抑制樹状細胞との間の均衡が、樹状細胞依存性治療用免疫応答の方向および強度の両方の主な決定要因であるとされている。

正常なヒトの血液は、一般に、最も多数あり、かつ最も密度の高い細胞である赤血球（「ＲＢＣ」）と、最も数が少なく、かつ最小密度の細胞である血小板（「ＰＬＴ」）と、最大細胞であり、ＲＢＣとＰＬＴとの間の密度を有する白血球（「ＷＢＣ」）と、血漿と、を含む。これらの３つの細胞画分は、遠心中に別個の集団に分離する。平均して、ＲＢＣは個体の全血球の約９９．９％を構成し、個体内の全血量の約４５％を占めるが、これは個体間で異なり、また同一個体内で時間の経過共に異なることが周知である。ＲＢＣは身体組織に酸素を運ぶ主要手段として重要な機能を果たすが、癌などの特定の病気に対抗するための組織の再生または免疫系の増強には有用ではない。固体の血液量の残りのほぼ全てが全血量の約５５％を占める非細胞性液体である血漿から構成され、その中で、全ての血液細胞が懸濁されている。したがって、通常の血液量の９９％以上が血漿および赤血球で構成されている。

残りの約＜０．６％の正常血液量は、ＷＢＣおよび血小板（ＰＬＴ）から構成されている。ＰＬＴは、ＷＢＣより数が約３０倍多い、不規則な形状の小さい核細胞である。ＰＬＴは、出血を止め、損傷組織を修復および再生する多数の成長因子を放出することによって、止血および治癒において基本的な役割を果たす。しかし、それらの接着性により、希少であり、臨床的に重要な標的細胞の効率的な富化および精製が妨げられる。最も広く行き渡っていない血液細胞はＷＢＣであり、典型的な血液サンプル中の全細胞のわずか約１０分の１％のみを占める。ＷＢＣは、身体の免疫系に不可欠であり、感染症、異物および血液学的および固形腫瘍癌に対する身体の防衛に関与している。免疫療法または再生医療において臨床的に利用されている細胞のほとんど全てが、ＷＢＣ画分内に存在する。ＷＢＣはサブグループに更に分けられてもよい。最大であり、かつ最も密度の高いサブグループは、顆粒球（ＧＲＮ）であり、全ＷＢＣの約６０％を占める。より小さく、かつより密度の低いサブグループは単核細胞（ＭＮＣ）であり、残りの約４０％を構成する。ＭＮＣは、リンパ球および単球に更に分離され得るが、それらは、単一で円形の核の各細胞内に存在するため、集合的にＭＮＣと称される。ＭＮＣは、免疫系の重要な構成要素であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および身体組織の感染部位に移動し、免疫応答を誘発するためにマクロファージおよび樹状細胞に分割し、分化するＮＫ細胞を含む。臨床試験で現在検討されている多くの細胞療法は、ＭＮＣ画分に存在する細胞を利用する。本開示では、さらに、このなかの単球を分離して、樹状細胞誘導の原料とすることが好ましい。

本明細書では「血液試料」は、被験者から得られる任意の血液を対象とすることができる。アフェレーシスの場合は、全血を分画することが通常であることから、血液試料としては全血が包含されるがこれに限定されない。すでに単球を含む画分として調製されたもの（例えば、成分献血後の単球含有試料）も本開示において血液試料として使用することができる。

本明細書において「血球濃度」とは、ある試料において、血球の占める濃度をいう。血球濃度は、本明細書で使用される採取プレファレンスによって表現することもでき、採取プレファレンスが高い場合血球濃度が低く、採取プレファレンスが低い場合血球濃度が高いと表現することができる。

本明細書において「採取プレファレンス」は、アフェレーシス装置において、採取ポート内を流れる血球濃度に影響を与える、血漿ポンプ流量を調整するために使用される参照値のことをいい、採取する血液試料の、特に血球の占める濃度に着目してラベル付けするための指標である。血球が効率的にチャネルからポンプで送り込まれるように、患者の白血球数および血小板数と相関している必要がある。採取プレファレンスが高い場合血球濃度が低く、採取プレファレンスが低い場合血球濃度が高いと表現することができる。通常、患者の血球数が多い場合は、採取プリファレンスを小さくする必要がある（色が濃くなる）。また、患者の血球数が少ない場合は、採取プリファレンスを大きくする必要がある（色が薄くなる）。代表的には、採取プレファレンス＝６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］
で設定することができる。

本明細書において、「単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）」は、白血球の一種で、最も大きなタイプの白血球である。マクロファージや、樹状細胞に分化することができる細胞をいう。単球は、脊椎動物の自然免疫の一部としても、また、適応免疫の過程にも影響をもつ。ヒトの血液には少なくとも３種類の単球が存在するといわれている。

本明細書において「バフィーコート」とは、血液の密度勾配遠心分離後の白血球と血小板のほとんどを含む抗凝固処理された血液サンプルの一部をいう。

本明細書では、単球を含む試料は「単球試料」と称され得る。このような単球試料の品質の指標として有核細胞中の単球の割合を利用することができる。従来使用されるアフェレーシスでは、単球試料の割合は１０％程度であることが多いとされている。

本明細書において「濃縮」（ｅｎｒｉｃｈ、ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）とは、特定の細胞（例えば、単球）のある集団（例えば、有核細胞）における割合を高めることを言い、純化（ｐｕｒｉｆｙ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とも言われる。例えば、操作前の特定細胞の集団に占める割合が１０％であった場合に操作後に３０％に高められる場合、濃縮または純化の概念に該当する。

（Tax抗原ペプチドパルス樹状細胞）
本開示は、アフェレーシス原料に含まれる単球から樹状細胞を誘導し、標的となるＴａｘ抗原ペプチドをパルスした再生医療等製品を製造するための原料を提供することが一つの特徴である。現在、ＡＴＬに対するＨＴＬＶ－１ Ｔａｘを標的とした樹状細胞ワクチンの開発を行っており、高い評価が得られているが、本開示によって提供される単球を用いることでさらに質の良いＴａｘ抗原ペプチドパルス樹状細胞を提供することができる。

（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。

（単球純化および樹状細胞製造）
本開示は、凍結原料から樹状細胞製造を実施するにあたり、アフェレーシス法の改良（リンパ球、好中球、赤血球、血小板混入の低減）および凍結融解後の比重遠心法における単球純化工程を用いた樹状細胞製造法を提供する。本製造法は以下の工程を含む。
自家末梢血単核球採取法（アフェレーシス改良法）
アフェレーシス原料の凍結保存・搬送
原料融解・洗浄・遠心分離法
比重遠心分離法(単球純化)
接着法 接着処理後の上清、浮遊細胞の除去法
樹状細胞誘導
樹状細胞成熟化・活性化
まず最初に、アフェレーシスにおける工夫により、単球の純度を飛躍的に伸ばすことができる。また凍結したアフェレーシス原料は融解直後の血球サイズ、比重、生存率が凍結前原料と変化する。特に細胞内に貯留した比重の重い凍結保護剤の影響により細胞質の広い単球の比重は重くなる。凍結保護剤を加えると、単球とリンパ球の比重が変動するため、遠心分離などの比重を指標とした分離により分離することができる。この性質を利用して遠心分離による単球の純化を図ることが可能となる。

さらに工程の簡略化、作業時間短縮に伴い作業者に起因する調製ミスが軽減し、製品の均一性を保つことが可能となる。作業者人員削減および作業時間短縮は、上市後の製品製造の人件費削減に結びつき、十分な経済的効果が得られると考えられる。

本開示の原料採取および凍結融解による単球純化法を用いた樹状細胞製造法によれば、製造販売および治療の全国規模での普及の一助となることができる。そのためには、以下の観点から患者アフェレーシス検体の原料凍結、製造施設への搬送システム整備および凍結原料からの製造法の確立が必要となる。
1) 原料内ＨＴＬＶ－１感染細胞から他の非感染細胞へのウイルス感染拡大防止
2) 搬送による原料の品質劣化防止
3) 搬送時間延長によるリスク軽減：交通事情、人的事故、自然災害
4) 患者アフェレーシス、搬送および製造開始日の計画的調整
5) 人件費・製造費用の削減いずれの点でも、本開示は、改善をみることができる。

（アフェレーシス）
本開示は、単球に関するアフェレーシス改良法を提供し、代表的には、自家末梢血単核球採取法を提供する。ここではアフェレーシスの改良において、比重による分離と、サイズによる分離とを組み合わせることで、単球の純度を上げることを見出すことができた。

ここでは、アフェレーシスの改良のために、例示的な装置としてＴｅｒｕｍｏから提供されるＳｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａなどの、比重とサイズとの組み合わせにより血球を分離する装置を利用することができる。Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａを用いたアフェレーシスは、末梢血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）採取の成分採血装置として使用されており、ほとんどの場合、２次チャンバーを使用しないＣＭＮＣモードで採取がされている。これらの２次チャンバーは、より赤血球、血小板の混入を減らす目的で使用され得る。

一つの実施形態では、遠心型血液成分分離装置（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ：テルモＢＣＴ）を用いた末梢血単核球採取または単球採取が例示される。

１つの代表的な例では、血小板、赤血球の混入を軽減し純度の高い単球分画を採取するため、遠心型血液成分分離装置（例えば、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ（Ｔｅｒｕｍｏ））の２次チャンバー分離方式（ＭＮＣ）プログラムにより、比重に応じた血球分離と細胞サイズに応じた分離の２段階の分離工程を採用する。採取プリファレンスはドナー末梢血情報により装置が自動計算で設定するが、採取プリファレンスを自動設定値より＋１０～２０高く設定することで好中球、赤血球の混入を軽減することが可能である。またチャンバー分離工程時の処理血液量および採取ポンプスピードの調整により血小板混入を軽減する。さらにこの工程ではリンパ球をスピルオーバー（ｓｐｉｌｌｏｖｅｒ）することにより、リンパ球採取率を制御し、より純度の高い単球を採取することが可能となる。より好ましくは、採取プリファレンスを自動設定値より＋２０～３０高く設定してもよい。理論に束縛されることを望まないが、この設定により、リンパ球除去をさらにすることが必要となる場合があり、そのような場合は、単球採取後にリンパ球除去モードとして、プリファレンス自動設定値でアフェレーシスを行うか、または、プリファレンス値を３０～５０に設定してアフェレーシスを行うことを追加してもよい。一例として、用いる機器において、単球採取後にプリファレンスを自動設定値に戻し採取を行った。本工程を追加することで、従来の採取時に除去できていたリンパ球数と同等のリンパ球除去が可能である。

本明細書において「スピルオーバー」とは、チャンバーから赤血球が継続的に溢れ出している状態をいう。

一つの実施形態では、スピルオーバーは、スピルオーバーとしてチャンバーから赤血球が継続的に溢れ出した時点での処理血液量（基準処理血液量）の値を１とした場合、前記スピルオーバーは、処理血液量を基準処理血液量より大きい値に設定して実施してもよい。

1つの実施形態では、記処理血液量は、基準処理血液量の少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍等に設定することができるがこれらに限定されない。

スピルオーバーは適宜条件を設定することができるが、処理血液量設定のために、血小板の混入を下げ好中球の混入を抑えるように設定されることが好ましい。理論に束縛されることを望まないが、通常の処理より上の層を採ることになるため採取回数は１～２回になると考えられる。２回に分けることにした場合、全体の処理血液量を採血流量４０ｍｌ／ｍｉｎ×１８０分で７２００ｍｌとして計算し、それを２回の採取で行うように計算すると１回目が約６割で４３００ｍｌ、２回目が残り４割で２９００ｍｌくらいが例示されるがそれに限定されない。

比重で分離するアフェレーシスと、比重及びサイズによる分離を組み合わせる点が特徴である。これにより、高純度の単球を単離することができる。

比重：血小板＜単球＜リンパ球＜好中球＜赤血球
サイズ：血小板＜赤血球＜単核球（リンパ球＜単球）

本開示の方法は、代表的に以下を含む
・Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａのチャンバーを使用して、サイズ分離を行う。
・Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａは、造血幹細胞移植用の細胞採取に使用されることがほとんどであり、チャンバーを用いて分離することはなされていない。
・本発明者らが従来行っているアフェレーシス（比重のみの分離）の場合は、試料中の単球の割合は１０～１５％程度であるのに対し、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａのチャンバーを用いて比重分離に加えサイズ分離も行うと、３０％程度まで上昇する（採取バッグ中の濃度。Ｍｏ（％）＝単球数／有核細胞数×１００）。

また、血小板および赤血球の割合も少なくなり、製剤にする際に有利となる。
・採取プリファレンスを、自動設定値（バフィーコートを採取ための設定値）より１０～２０高い値にすることで、単球が多く好中球や赤血球の混入が少ない層をとることが可能である。自動設定値の具体的な算出方法は６０－［（０．２×白血球数）＋（０．０８×血小板数）］で決定され、光の透過度により決定されている。ここで、白血球数は被験者の白血球数（×１０００／μＬ）を意味し、血小板数は被験者の血小板数（×１０００／μＬ）を意味する。採取プリファレンスが低ければ比重が高い層、採取プリファレンスが高ければ比重が低い層を採取することとなる。
・サイズの小さい細胞を採取しないために、チャンバーをスピルオーバー（spillover）
させてもよい。代表的な例では、スピルオーバーとしてチャンバーから赤血球が継続的に溢れ出した時点での血液処理量の１．２倍の血液を処理することでスピルオーバー（spillover）させることが望ましくあり得る。

このように、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と、
２）該血液試料を、比重および細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程と
を包含する方法を提供する。ここで、好ましくは、採取プレファレンスを通常よりも高めに設定することで血球濃度が通常より低い部分の該血液試料を濃縮工程に供することが特徴である。

好ましい実施形態の一つは、前記工程２）は、該血液試料について、比重に基づき単球を濃縮し、次いで細胞サイズに基づき単球を濃縮する。これらを実現する装置として、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ（登録）が挙げられる。

別の局面において、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）被験者から血液試料を得る工程と、２）該血液試料中の血球濃度が所定値より低い部分から比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程とを包含する方法を提供する。

好ましくは、前記血球濃度は採取プレファランスを参照して調整される。前記採取プレファランスは６０－［（０．２ｘ白血球数）＋（０．０８ｘ 血小板数）］で設定される（白血球数および血小板数は、×１０００／μｌ）。好ましくは、実際の設定採取プレファランスは、この値より高いことが好ましい。

前記採取プレファレンスは、所定値より１０～２０高く設定される。前記所定値はバフィーコートをとるための値（例えば、デフォルト３０～５０）であり、前記採取プレファレンスは６０－［（０．２×白血球数）＋（０．０８×血小板数）］＋１０～２０に設定される。前記採取プレファレンスは４０～７０に設定されてもよい。

1つの実施形態では、濃縮工程において、スピルオーバーさせることを包含する。スピ
ルオーバーによって余分な血小板およびリンパ球が除去され得る。例示的な実施形態では、スピルオーバーは、例えば、スピルオーバーとしてチャンバーから赤血球が継続的に溢れ出した時点での処理血液量（基準処理血液量）の値を１とした場合、前記スピルオーバーは、処理血液量を基準処理血液量より大きい値に設定して実施される。一部の実施形態では、前記処理血液量は、前記基準処理血液量の少なくとも１．２倍である。

１つの実施形態において、スピルオーバーは、サイズが小さい細胞が優先的にあふれ出す条件下で行われる。特定の実施形態では、スピルオーバーは、スピルオーバーを実現する手段にて行われる。一部の実施形態において、スピルオーバーを実現する手段は、赤血球検出器を有する。

１つの局面において、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）被験者から血球濃度が所定値より低い血液試料を得る工程と、２）該血液試料を、比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程とを含む、方法を提供する。

1つの実施形態では、前記単球試料は、前記被験者から得られる血球試料から直接得るものであることを特徴とし、前記濃縮は、前記血液試料を前記被験者から得た後７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、好ましくは３時間以内に行われる。

別の特徴としては、細胞サイズによる分離は、前記比重による分離の後５時間以内、４時間以内、あるいは３時間以内、２時間以内、１時間以内に行われることが好ましい。

前記単球試料は、約１０％以上、約２０％以上、あるいは約３０％以上の純度（有核細胞に対する比率）で単球を含み得る。約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上の純度で単球を含み得ることも本開示の特徴の一つであり得る。

（凍結保護剤）
１つの局面において、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）被験者から血液試料を得る工程と、２）該血液試料に凍結保護剤を添加する工程と、３）凍結保護剤を加えた該血液試料を比重により分離し、リンパ球より重い画分を得る工程とを包含する、方法を提供する。1つの実施形態では、前記血液試料は、アフェレーシス分
離を経たものである。

代表的には、凍結保護剤は、ヒドロキシエチルスターチ、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、トレハロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン等の成分を含むもの、例えば、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ ＤＭＳＯ Ｆｒｅｅ ＲＭ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標） ＤＭＳＯ Ｆｒｅｅ ＧＭＰ Ｇｒａｄｅ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等を挙げることができる。特にＤＭＳＯを含むもののほか、ＤＭＳＯを含まないものも好ましく使用されうる。

1つの局面において、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）
得られた血液試料から、凍結保護剤を含む単球試料を得る工程と２）該単球試料を、クエン酸ナトリウム水和物等を含有する血液保護剤Ａ（（ＡＣＤ－Ａ液））を通常（１５％程度）より低い濃度、例えば、１０％以下で含む洗浄液で洗浄をする工程とを包含する方法を提供する。通常濃度のＡＣＤ－Ａで使用すると単球試料が劣化することが予想外に見いだされたからであり、これを解決することが通常（１５％程度）より低い濃度、例えば、１０％以下でＡＣＤ－Ａを含むことで達成し得た。好ましくは、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下で含むことが望ましく、一つの好ましい実施例では、約５．５％でＡＣＤ－Ａを含むことが望ましくあり得る。

別の局面において、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）得られた血液試料から単球試料を得る工程と２）該単球試料に凍結保護剤を添加した後に、ＡＣＤ－Ａを通常（１５％程度）より低い濃度、例えば、１０％以下で含む洗浄液で洗浄をする工程とを包含する方法を手供する。

他の局面において、本開示は、血液試料から単球試料を生産する方法であって、１）得られた血液試料から単球試料を得る工程と２）該単球試料に凍結保存後に、ＡＣＤ－Ａを通常（１５％程度）より低い濃度、例えば、１０％以下で含む洗浄液で融解洗浄をする工程とを包含する方法を提供する。

好ましい実施形態では、濃縮は、凍結保存後になされる。凍結保存を行うことで、生存率が有意に改善されるからである。特に一例としては、血液試料は、前記凍結保護剤の添加後に、５．５％ＡＣＤ－Ａ／１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ－１６４０の組成を有する洗浄液で洗浄される。別の一例として、血液試料は、前記凍結保存後に、５．５％ＡＣＤ－Ａ／１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ－１６４０の組成を有する洗浄液で融解洗浄される。ＡＣＤ－Ａは６％以下で存在することが好ましく、さらに好ましくは、ＡＣＤ－Ａは５．５％で存在する。

比重による単球の分離は、比重の違いにより、単球を分離し得る機能を有する限りどのようなものであってもよい。例えば、細胞の洗浄を目的として遠心分離により洗浄をする場合、比重液を用いて比重分離を行う場合等が考えられ、これらが包含される。１つの特定の実施形態では、本開示の比重による濃縮工程は、比重遠心分離法による工程を含み得る。比重遠心分離法では、１．０７４～１．０７６、好ましくは１．０７５の比重液で遠心分離することが好ましい。通常の１．０７０～１．０７３ではなく少し高い比重になるのは凍結保護剤による予想外の影響による。なお、１．０７７以上ではリンパ球の混入がみられるためあまり好ましくはない。

別の実施形態では、比重による分離は、以下の遠心分離条件によりなされる。
遠心分離１回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ３００×ｇ～４００×ｇ、例えば３５０×ｇ ５ｍｉｎ ＲＴ
遠心分離２－３回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ２５０×ｇ～３５０×ｇ、例えば３００×ｇ
５ｍｉｎ ＲＴ
１つの好ましい実施形態では、濃縮は、本開示のアフェレーシス処理がなされた後になされる。

凍結原料の融解洗浄工程の１）洗浄液組成、２）遠心条件が重要な条件の一つである。１） 洗浄液組成 ５．５％ＡＣＤ－Ａ／１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ－１６４０
２） 遠心条件：
遠心１回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ３５０ｇ ５ｍｉｎ ＲＴ
遠心２－３回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ３００ｇ ５ｍｉｎ ＲＴ。
１回目と２回目のこれらの条件は、予想外にリンパ球を除去したり他の血液成分を効率よく除くために有利な条件であり得る。通常は、これより高い重力加速度で遠心分離をする（例えば、５００×ｇ、７００×ｇ）が、そのような高い重力加速度では、十分に除去できない。

（死細胞等除去）
本開示では、リンパ球、血小板および死細胞除去などをさらに除去する工程を包含してもよい。死細胞除去処理のみあるいは、死細胞、リンパ球および血小板を除去してもよい。このような細胞の除去は、比重遠心分離によってなされ得、比重遠心分離は、密度媒体ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液を用いて行うことが好ましく、さらに好ましくは、ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液は６０ｗ／ｖ％で提供され、ＯｐｔｉＰｒｅｐ^ＴＭを用いることができる。１つの特定の実施形態では、本開示の死細胞等除去は、比重遠心分離法による工程を含み得る。比重遠心分離法では、１．０７４～１．０７６、好ましくは１．０７５の比重液で遠心分離することが好ましい。通常の１．０７０～１．０７３ではなく少し高い比重になるのは凍結保護剤による予想外の影響による。なお、１．０７７以上ではリンパ球の混入がみられるためあまり好ましくはない。

（ＤＮａｓｅの有無）
濃縮は、ＤＮａｓｅの添加なしまたはありで行われる。ＤＮａｓｅはプルモザイムを含む。ＤＮａｓｅ処理がなくても単球の質および純度を確保できたことから、実際の臨床現場では、ない場合でも応用可能であることが証明された。もちろん、種々の側面でＤＮａｓｅの好ましい局面もあることから、本開示では両者を否定するものではないことが理解される。

（システム）
1つの局面において、本開示は、血球濃度を調整する機能を有するアフェレーシス装置
と、細胞をサイズ分離するサイズ分離部と、スピルオーバーを実現する手段と、凍結保護剤を投入する凍結保護剤投入部と、比重により単球の分離を行う単球分離部と、死細胞除去手段とのうち、少なくとも1つを含む、単球含有物を生産するシステムを提供する。本
開示のシステムは、これらの２つ、３つ、４つまたはすべてを含む。

本開示のシステムのアフェレーシス装置は、好ましくは、比重分離のほか、細胞サイズ分離の機能を有することが好ましいがこれに限定されない。サイズ分離の機能は別に提供されてもよいことが理解される。そのような例としては、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ（Ｔｅｒｕｍｏ）が挙げられるがこれに限定されない。また、アフェレーシス装置は、それ自らが血球濃度を調整する機能を有していてもよく、追加で血球濃度を調整する機能を有する機能を発揮する部分を備えてもよい。

スピルオーバーを実現する手段は、液量をコントロールすることができるものである限りどのようなものであってもよい。

細胞をサイズ分離するサイズ分離部は、細胞をサイズにより分離することが可能である限りどのようなものであってもよい。

凍結保護剤を投入する凍結保護剤投入部は、凍結保護剤を保管し、適宜試料に投入することができる機能を有する限りどのようなものであってもよい。
比重により単球を分離する単球分離部は、比重の違いにより、単球を分離し得る機能を有する限りどのようなものであってもよい。例えば、細胞の洗浄を目的として遠心分離により洗浄をする場合、比重液を用いて比重分離を行う場合等が考えられ、これらが包含される。凍結保護剤により比重が変更される場合単球の分離には通常の洗浄を目的として遠心分離により洗浄をすることでも目的が達成されることから、この場合遠心分離部装置であってもよい。比重液を用いて比重分離を行う場合は、遠心分離機に加え、比重液もこの単球分離部に備えられ得る。

死細胞除去手段は死細胞を除去し得る任意の手段が適切であり、比重遠心分離によるものが通常であり、例えば、密度媒体ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液を用いたものが用いられる。ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液は６０ｗ／ｖ％で提供されることが好ましい。

このシステムは、さらに、比重による分離部と、細胞を凍結・保存する凍結保存部、解凍洗浄を行う解凍洗浄部または凍結した細胞を融解する細胞融解部、上述した比重遠心分離を行う比重遠心分離部、樹状細胞を誘導する手段、パルス刺激する手段、再生医療等製品を調製する手段などを１または複数あるいは全部備えていてもよい。

これらのシステムは、コンピュータによる自動制御あるいは手動で制御されてもよい。

システムは、本明細書に記載される方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを備えていてよく、例えば、そのようなプログラムを格納した記録媒体を備え得る。また、プログラムによって指示される命令を実行するための計算装置（例えば、コンピュータ）を備えていてよい。計算装置は、物理的に一体としていても、あるいは、物理的に分離した複数の構成要素からなっていてもよい。これらの計算装置の内部において、学習部、計算部および取得部等に対応する機能が必要に応じて備えられ得る。

本開示のシステムは、複数の構成部を１個のチップ上に集積して製造された超多機能ＬＳＩとして実現することができ、具体的には、マイクロプロセッサ、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などを含んで構成されるコンピュータシステムであり得る。ＲＯＭには、コンピュータプログラムが記憶されている。前記マイクロプロセッサが、コンピュータプログラムに従って動作することにより、システムＬＳＩは、その機能を達成する。

なお、ここでは、システムＬＳＩとしたが、集積度の違いにより、ＩＣ、ＬＳＩ、スーパーＬＳＩ、ウルトラＬＳＩと呼称されることもある。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限るものではなく、専用回路または汎用プロセッサで実現してもよい。ＬＳＩ製造後に、プログラムすることが可能なＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）、あるいはＬＳＩ内部の回路セルの接続や設定を再構成可能なリコンフィギュラブル・プロセッサを利用してもよい。さらには、半導体技術の進歩または派生する別技術によりＬＳＩに置き換わる集積回路化の技術が登場すれば、当然、その技術を用いて機能ブロックの集積化を行ってもよい。バイオ技術の適用等が可能性としてありえる。

なお、上記各実施の形態において、各構成要素は、専用のハードウェアで構成されるか、各構成要素に適したソフトウェアプログラムを実行することによって実現されてもよい。各構成要素は、ＣＰＵまたはプロセッサなどのプログラム実行部が、ハードディスクまたは半導体メモリなどの記録媒体に記録されたソフトウェアプログラムを読み出して実行することによって実現されてもよい。

本明細書において「プログラム」は、当該分野で使用される通常の意味で用いられ、コンピュータが行うべき処理を順序立てて記述したものであり、法律上「物」として扱われるものである。すべてのコンピュータはプログラムに従って動作している。現代のコンピュータではプログラムはデータとして表現され、記録媒体または記憶装置に格納される。

本明細書において「記録媒体」は、本開示を実行させるプログラムを格納した記録媒体であり、記録媒体は、プログラムを記録できる限り、どのようなものであってもよい。例えば、内部に格納され得るＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置でありうるがこれらに限定されない。

本明細書において「システム」とは、本発明の方法またはプログラムを実行する構成をいい、本来的には、目的を遂行するための体系や組織を意味し、複数の要素が体系的に構成され、相互に影響するものであり、コンピュータの分野では、ハードウェア、ソフトウェア、ＯＳ、ネットワークなどの、全体の構成をいう。

（Ｔａｘ抗原ペプチドパルス樹状細胞の製造）
本開示は、本開示の工程により調製された単球試料から樹状細胞を誘導する工程と、該誘導した樹状細胞に対してTax抗原ペプチドをパルスする工程とを含む、Tax特異的樹状細胞を生産する方法を提供する。

本開示はまた、Tax特異的樹状細胞を、凍結保護液に懸濁したものをクライオチューブ
、クライオバッグ等の容器に充填し再生医療等製品とする工程を包含する、再生医療等製品を生産する方法を提供する。

また、本開示は、本開示の方法によって製造される再生医療等製品を提供する。

（治療）
本開示の再生医療等製品は、有効成分量換算で、適宜の位置に治療で投与することができ、非経口的、局所的または経粘膜的、例えば経鼻、経直腸または経皮的に、あるいは局所的に投与される場合も同様に換算することができる。本開示の方法で投与される医薬組成物の量は、治療される対象、障害または障害の症状の重症度、投与法、投与頻度および医師の判断に応じて決まる。投与頻度は、ほぼ毎時間の投与から毎月の投与までの範囲内である。具体的実施態様において、投与は、例えば、１×１０^６～１×１０^７、好ましくは、５×１０^６細胞でなされ得、投与回数は、代表的に１～５回（好ましくは、３回）投与され得、投与間隔としては、例えば、１～４週間おき、好ましくは２週間おきに投与され得る。代表的には、５×１０^６細胞で２週毎３回投与され得る。この治療は予防にも使用されうる。
好ましい実施形態では、本開示は、被験体から単球を採取した後の、アフェレーシスによるリンパ球除去を含みうる。本開示のリンパ球除去は、アフェレーシスによる単球採取後等に、自動設定値でアフェレーシスを行うことにより被験体内のリンパ球を除去し、抗腫瘍免疫の賦活を誘導する。類似技術として、遠心分離法によるリンパ球除去療法と吸着法による白血球除去療法、顆粒球除去療法などが挙げられる治療サイタフェレ―シス（Therapeutic cytapheresis）があり、これらはいずれも採用することができる。この技術は、炎症抑制を目的とする、主に細胞障害性の活性化好中球成分除去の側面もある。活性化好中球を除去した結果、炎症性サイトカインの低下を得ることができる。加えて、本開示の原料採取時のアフェレーシスおよびその後のリンパ球除去用アフェレーシスは、遠心分離法によって樹状細胞の原料である単球を採取する際に、同時に10⁹細胞レベルのリンパ球を除去することができる。この結果、がん患者の免疫寛容状態を構成するTregなどのリンパ球を除去し、抗腫瘍免疫の賦活を誘導することができる。このようなある意味での併用を狙った療法も本開示の範囲内にある。

一局面において、本開示は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法であって、
１）被験者から血液試料を得る工程と
２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
３）該血球濃度が所定値より低い場合、被験者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
を含む、方法であって、
該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
方法を提供する。この治療は予防にも使用されうる。

一部の実施形態において、前記所定値はバフィーコートをとるための値であってもよい。一部の実施形態において、前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整されてもよい。一部の実施形態において、前記採取プレファレンスは、６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］より高い値に設定される。一部の実施形態において、前記採取プレファレンスは、６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］＋１０～２０に設定される。一部の実施形態において、前記採取プレファレンスの所定値は、３０～５０である。一部の実施形態において、前記採取プレファレンスは、所定値より１０～３０高く設定される。好ましい実施形態において、前記採取プレファレンスは、所定値より２０～３０高く設定される。一部の実施形態において、前記採取プレファレンスは４０～８０（あるいは、下限は５０、６０等の中間の値でよく、上限も６０または７０等の中間の値でもよい。）に設定される。

別の実施形態では、本開示の方法では、血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む。リンパ球を取り出す工程は任意の時間継続し得るが、好ましくは20分以上、さらに好ましくは30分以上行うことが有利である。一部の実施形態では、リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施されてもよい。

あるいは、別の実施形態では、本開示の方法では、単球を取り出す工程は、本明細書に記載された単球の処理に関する任意の特徴またはそれらの組み合わせであってもよい。

別の局面において、本開示は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法をコンピュータに実行させるプログラムであって、該方法は、１）該患者から血液試料を得る工程と２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程とを含み、該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、プログラムを提供する。ここで使用される方法は、本明細書の他の個所に記載される任意の更なる特徴またはその組み合わせを含みうる。

さらに別の局面において、本開示は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法をコンピュータに実行させるプログラムを記録した記録媒体であって、該方法は、１）該患者から血液試料を得る工程と２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程とを含み、該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、記録媒体を提供する。ここで使用される方法は、本明細書の他の個所に記載される任意の更なる特徴またはその組み合わせを含みうる。

さらに別の局面において、本開示は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療するためのシステムであって、１）該患者から血液試料を得る試料取得部と２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する測定部と、３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る同等試料取得部とを含み、該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、システムを提供する。ここで採用される各種部分または構成要素は、本明細書の他の個所に記載される任意の更なる特徴またはその組み合わせを含みうる。

さらに別の局面において、本開示は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療するためのシステムの作動方法であって、該システムは、１）該患者から血液試料を得る試料取得部と２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する測定部と、３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る同等試料取得部とを含み、該方法は、１）該患者から血液試料を得る工程と２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、３）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程とを含み、該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、方法を提供する。ここで採用される各種部分、構成要素または方法は、本明細書の他の個所に記載される任意の更なる特徴またはその組み合わせを含みうる

（他の実施の形態）
本開示の１つまたは複数の態様に係る判定方法および解析方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、本開示の１つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。

本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上
」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

本実施例では、本開示の単球の純化の方法およびその後樹状細胞の誘導、Ｔａｘペプチドパルスを行って製剤化する一連の実験を説明し、その中で、特徴的である単球の純化について詳述する。以下の実施例では、ヘルシンキ宣言などの医療的な倫理規定、ＧＣＰなどの規則、ならびに、国立病院機構その他で規定される規定を遵守し、発明者が所属する組織に関係する倫理委員会の承認のもとで行った。必要なインフォームドコンセントを取得した上で以下の実験を行った。
図１４に、本実施例で検討した代表的な単球純化の方法の模式図を示す。このうち、いくつか（例えば、凍結、融解、比重遠心分離）は任意工程であり、割愛してもよいことが理解される。

（実施例１：アフェレーシスの実施）
本実施例では、アフェレーシスの改良を試みた。以下に手順を示す。

（プロトコール）
・アフェレーシスの実施に際しては、ドナーの健康状態を第一に考え、一般臨床医療と同様の医学的対応を行った。
・事前にドナーより採血を行い、血算および機械分類を測定しておいた。
・機器はＳｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ （テルモＢＣＴ）を使用した。
・プログラムはＭＮＣプログラムとした。
・脱血用および返血用に末梢静脈路を２ルート確保した。
・採取条件は以下のとおりとした。
採血流量 ４０ｍｌ／ｈ以下
血漿量 最終検体が約２００ｍｌとなるように調整
採血量：ＡＣＤ－Ａ液量比 １２：１
採取プリファレンス 自動設定値＋１０～２０
※自動設定値＝６０－（０．２ｘ白血球数［１０＾３／μｌ］）－（０．０８ｘ血小板数［１０＾３／μｌ］）≒３０
全血処理量 赤血球検出の処理量 約７２００ｍｌ
・採取終了後は、採取検体より約１ｍｌのサンプルを採取し、血算および機械分類を測定した。

（凍結処理）
＜準備物品＞
検体（ＰＢＭＣ採取バッグ）
ダブル分離バッグ（カワスミ血液分離用バッグ ＫＢＰ－６６ＤＣ） １個
コッヘル、チューブシーラー、ローラベンチ
無菌接合機（ＴＳＣＤ）
ＡＣＤ－Ａ液 ５００ｍＬ（使用量は少量）
献血アルブミン２０％静注１０ｇ／５０ｍＬ（ＪＢ） １個
ＣＰ－１ ４０ｍｌ １個（正晃）
フリーズバッグ（ニプロフローズバッグ Ｆ－１００） １個
エタノールスプレー
黄色ガウン、帽子
ＰＢＭＣ凍結工程記録書。

（１．移し替え）
（１）ダブルバッグへの移し替え
１．ビニール袋を開ける前に、ダブル分離バッグの針部分を袋の上からコッヘルで止め、ビニール袋を開けて、チューブシーラーで針に近い部分で切り離した。

２．ダブル分離バッグの親バッグと子バッグの間をクレンメで止めた。

３．コッヘルで止めたＰＢＭＣ採取バッグとダブル分離バッグをＴＳＣＤで接合した。

４．採取バッグ内のＰＢＭＣ液をダブル分離バッグに移した。

５．チューブシーラーでシールして（チューブは長めに残しておく）採取バッグを切り離した。

いつでもＰＢＭＣの入ったバッグはチューブ類をクレンメで止めておくよう留意した。

（２）ＡＣＤ－Ａ液の添加（凝集の発生を予防するため）
（ｉ）ＰＢＭＣのバッグ込み重量を測定した。

（ｉｉ）ＡＣＤ－Ａ液の添加量を計算する（ＰＢＭＣ内容量に対して２％ｗ／ｗ）。

（ｉｉｉ）ダブル分離バッグとＡＣＤ－Ａ液バッグをＴＳＣＤで接続した。バッグ根元にはクレンメを配置した。

（ｉｖ）秤で重量を確認しながら、計算量のＡＣＤ－Ａ液を添加した。

（ｖ）セグメント５本分の位置において、チューブシーラーでシールしてＡＣＤ－Ａ液バッグを切り離した。

（ｖｉ）ＡＣＤ－Ａ液をよく混和した後に、ダブル分離バッグのチューブをローラベンチで数回ローリングし、ＣＢＣ用にセグメント１個分を切り離した。

（ｖｉｉ）セグメントを切り離したのち重量を測定し、実際のＡＣＤ－Ａ液添加量を記録した。

（２．血算）
（１）セグメント内の血液をサンプルチューブに移した。

（２）ＣＢＣおよび機械分類を測定した。

（３．凍結バッグ数の決定・容量の調整）
（１）凍結バッグ数
凍結バッグ数＝２
容量調整後のバッグ込みの重量（目標）＝５０ｇ＋３５ｇ＝８５ｇ
（２）容量の調整
（ｉ）容量が多い場合は遠心する。１２００ｒｐｍ （３７０Ｇ）、１２ｍｉｎ、１０℃、Ａｃｃｅ１９、Ｄｅｃｅ１６。バッグごとエアクッションで保護して、バッグがねじれないように遠心機へセットした。

（ｉｉ）遠心分離後、ＰＢＭＣバッグを分離スタンドに挟み、上清部（ＰＲＰ）を子バッグに移注する。

沈殿部分の有核細胞が入らないように注意。

バッグはシール側が裏になるようにセットしないと内容が見えない。

（ｉｉｉ）ＰＢＭＣバッグを秤に載せ、重量を測定しながらＰＲＰを戻し、目的の重量に調整した。

（４．必要物品の消毒）
（ｉ）ＡＣＤ－Ａ液、分離バッグ（ビニール袋の上からクランプ２か所を閉めておく）、ＣＰ－１、アルブミン、分離バッグ（カワスミＫＢＰ－６６ＤＣ）、凍結バッグ（ニプロＦ－１００）、連結管（カワスミＴ－８）、２０ｍｌシリンジ、アルコール綿と、先ほど調整したＰＢＭＣバッグをエタノールスプレーで１度消毒を実施した（安全キャビネットには入れない）。

（ｉｉ）黄色ガウンと帽子を着用
清潔操作となるので黄色ガウンと帽子を着用し、清潔を保つため、その姿では調整室から出ないよう注意した。

（ｉｉｉ）再度必要物品の消毒
上記で消毒した必要物品はすべて乾いてから、再度エタノールスプレーで消毒しながら、安全キャビネットに入れるよう注意した。

（ｉｖ）滅菌手袋の装着
滅菌手袋を装着し、安全キャビネットの中に手を入れて作業した。

１度手を出すと滅菌では無くなるので作業が終了するまでは手を出さないよう注意した。

（５．安全キャビネット内での操作）
（１） 凍害保護液の準備
（ｉ）ＣＰ－１とアルブミンは、プラキャップをはずして上部をアルコール綿で消毒した後、エア針を刺した。

（ｉｉ）２０％アルブミンを１６ｍｌシリンジにとった。

（ｉｉｉ）５０ｍｌ用ＣＰ－１ （３４ｍＬ） に２０％アルブミン１６ｍｌを添加した。

（ｉｖ）泡立たないように転倒混和した。

＊ＣＰ－１とアルブミンを混和した際の発熱に備えて、保冷剤で冷却しながら行った。

（２）凍害保護液の添加
（ｉ）連結管を袋から出し、クランプを閉じた。

（ｉｉ）凍結管の輸血口用プラスティック針（薄黄色）をＰＢＭＣバッグにスパイクした。

（ｉｉｉ）連結管のゴム専用プラスティック針（白色）をボトルホルダーにセットした凍害保護液のゴムキャップにスパイクした。

（ｉｖ）凍害保護液のボトルホルダーを安全キャビネットのフックにかけ、連結管のクランプを開けた。ローラベンチで流出を促す。ボトルホルダーを捨てないように注意した。

バッグは保冷剤で挟み、冷却混和しながら、凍害保護液を規定量ゆっくり入れた（総量２００ｍＬで１０分、１００ｍＬで５分を目安とした）。

後の作業でチューブ内の液を押し出すためのエアーも少し入れておいた。

凍害保護液を入れた後は、作業は冷却下で迅速に行わないと細胞が死滅してしまうため留意した。

（３）フリージングバッグへの移注
（ｉ）２つのフリージングバッグにそれぞれ原料番号＋「（１）」、原料番号＋「（２）」と記入した。

（ｉｉ）２つのフリージングバッグのチューブの端をチューブシーラーで切った。

ＰＢＭＣバッグと２つのフリージングバッグをＴＳＣＤで接続した。

（ｉｉｉ）フリージングバッグのクレンメを開け、ＰＢＭＣをフリージングバッグへ移注した。

（ｉｖ）フリージングバッグのエアを元のバッグに移してエア抜きを実施した。エア混入はバッグ破損の原因となるので、できる限りエアは抜いた。

バッグが２－３個の場合は、できるだけ等量になるように工夫するが、時間がかからないようにした。

（ｖ）セグメント２個分ＰＢＭＣをチューブに戻し、チューブシーラーでＰＢＭＣ本体は、黒ラインの間で留め、ＣＢＣ用と保存用にセグメント２本作った。

（ｖｉ）ＣＢＣ測定した。

（ｖｉｉ）フリージングバッグの重量を測定した。

（ｖｉｉｉ）１バッグずつアルミプロテクターに入れ、原料番号を記載したシールで封をする。解凍時に剥がしやすくするために、シール端は折り返しをつけた。

（６．凍結）
（１）プログラムフリーザー（ＣＲＹＯＭＥＤ Ｆｒｅｅｚｅｒ［Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ］）で以下のプログラムにて凍結処理を行った。
１ Ｓａｍｐｌｅ＝４℃までｃｈａｍｂｅｒ＝２℃で待機
２ Ｓａｍｐｌｅ＝－４℃まで１℃／ｍｉｎで調整
３ Ｃｈａｍｂｅｒ＝－７０℃まで６０℃／ｍｉｎで調整
４ Ｃｈａｍｂｅｒ＝－１５℃まで２０℃／ｍｉｎで調整
５ Ｓａｍｐｌｅ＝－４０℃まで１℃ずつ冷却
６ Ｓａｍｐｌｅ＝－８０℃まで１℃ずつ冷却
７ Ｅｎｄ

（２）凍結検体の保存
プログラムフリーザーでの凍結が終了したら、チャンバーから凍結バッグ入りプロテクターを取り出し、液体窒素タンクに入れて保存した。

液体窒素タンクに掛けている「細胞治療科保存検体リスト（臨床研究）」に情報を記入した。

（結果）
以下に試料中の単球純化の程度などを示す表を提示する（表中、Ｍｏは単球、Ｌｙはリンパ球、ＰＢＭＣは末梢血単核球、Ｎｅｕｔは好中球、Ｈｔはヘマトクリット値、Ｐｌｔは血小板、Ｐｔは患者を示す。）。

以下の表に記載されるデータのうち、以下の表示はそれぞれ、右の説明に記載されるものに該当する。
ＣｏｍＴｅｃ：従来法によって原料採取および凍結保存を実施したデータ
Ｏｐｔｉａ：本開示の方法によって原料採取および凍結保存を実施したデータ
ＨＤ２３：実施例１のデータ
ＨＤ２４：実施例２のデータ
ａｐｈｅｒｅｓｉｓ採取検体：原料採取工程にて採取した検体
凍結保存検体：凍結保存工程における凍結直前の検体（［０１３３］の（３）（ｖ）に該当）

上記のように、実施例１（ＨＤ２３）では、本開示の方法を用いて単球純度が３０％程度になった。また、Ｈｔ（ヘマトクリット値）及びＰｌｔ（血小板）が従来法よりも減少した。

実施例１では、採取プレファレンスは通常通りの値から始めた。（下記表２、ＡＣはＡＣＤ－Ａを示し、Ｈｃｔはヘマトクリット値、ＴＢＶは循環血液量を示す。）

本実施例の結果から、アフェレーシス（比重分離のみ）実施した場合に比べ、比重およびサイズによる分離を組み合わせたところ、１０％程度であった単球純度が、約３０％にまで上昇することが確認された。

なお、スピルオーバー処理を行うと純度が上昇する傾向がみられた。

下記に示すように、凍結保護剤処理、死細胞処理、リンパ球および血小板除去（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）処理も行うと、純度はさらに上昇した。

（実施例２：アフェレーシスの更なる改良）

実施例1と同様にアフェレーシスを行った。

実施例２では、実施例１と同様のプロトコールを用いたが、採取プレファレンス値を自動設定値より２０高く設定した。

（結果）
本開示の方法（採取プレファレンスを通常値より高く設定すること、比重及びサイズによる分離を実施すること）によって単球の純度が顕著に上昇することが分かった（約４０％）（表１）。

（実施例３：ＤＮａｓｅの処理）
本実施例では、実施例1において凍結保存した凍結保存原料を用いてＴａｘ特異的樹状
細胞の試験製造を実施したが、ＤＮａｓｅの処理を行ったものと行わないものとを用意した。

（プロトコール）
（目的）
・製造工程初日（Ｄａｙ０）に発生する凝集塊によって単球回収率や単球純度が低下している可能性がある。本実施例では、ＤＮａｓｅ（プルモザイム）添加有りと添加無しの２群に分けて実施し、ＡＴＬ－ＤＣの回収率や品質を比較検証した。

（使用原料）
内容量は約５０ｍＬ、通常製造のハーフスケール
＜採取、凍結日＞ ２０２０年１月２７日
＜アフェレーシス機器＞ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａ （テルモＢＣＴ）
＜ドナー＞ 健常人（ＨＤ２３）
＜採取条件＞
・単核球採取（ＭＮＣ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）プロトコルを用いた。
・ＡＣＤ－Ａ液の使用量は、血液処理量：ＡＣＤ－Ａ液＝１２：１とした。
・１サイクル当たりの処理血液量は、チャンバー内への血球の充填量によってサイクルごとに決定した。
・サイクル間に全血算測定を行い、単球としてｌｘｌ０＾９個を目標に全血液処理量を決定した。採取検体には血漿を加えて約２００ｍＬに調製した。
＜凍結条件＞
・日常診療における造血幹細胞移植の患者およびドナーの末梢血造血幹細胞の凍結保存方法に準じて実施した。（ＡＣＤ－Ａ液を２％（Ｗ／Ｗ）添加した。遠心分離を行って上清を除去し、容量を５０ｍＬに調製した。５０ｍＬのＣＰ－１／ＨＳＡ混合液を添加し、２個のフローズバッグに分注した。プログラムフリーザーを用いて－８０℃以下まで冷却後に、液体窒素タンクにて保存した。）
＜採取・凍結時の全血算データ＞

(方法）
原料の解凍洗浄工程を以下のようにＤＮａｓｅ添加ありと添加なしの2群に分け、その
後2群の細胞を別々にＴａｘ特異的樹状細胞の試験製造工程にかけた。本実施例における
製造工程の一部（原料の解凍洗浄工程）を図１２に示す。方法の詳細は実施例４に記載した通り。

なお本実施例では、解凍洗浄工程に使用する培地のｐＨ調整（大気下でのガス交換による酸の中和）を実施せず。Ｏｐｔｉ－Ｐｒｅｐ重層前、フラスコ播種前に細胞を十分に懸濁するために１０ｍＬピペットを用いてピペッティングを行った。

（結果）
結果（表４及び表５）より、ＤＮａｓｅ処理の有無の両条件にて得られたそれぞれのＤＣの収量、生細胞率及び表面形質には顕著な差を認めず、投与可能なＤＣを製造することが可能と考えられた。

（実施例４：凍結保護剤を用いた単球純化の改善）
本実施例では、凍結保護剤を用いた場合の単球の純化の改善を調べた。

（材料および方法）
（試薬の調製）
以下に従って、試薬を調製した。

Ｄａｙ ０
（（０）試薬の準備）
必要量
ＲＰＭＩ１６４０：５００ｍｌボトル ５本
ＰＢＳ ：５００ｍｌボトル １本、ＯｐｔｉＰｒｅｐ希釈用 １０６．５ｍｌ
２５％ＨＳＡ ：９０ｍｌ
ＡＣＤ－Ａ液 ：６０ｍｌ
ＯｐｔｉＰｒｅｐ：３０ｍｌ

（試薬の調製）
以下のように、工程（１）解凍・洗浄（２）分離と培養に必要な試薬を調整した。
※以下の試薬は、クリーンベンチ内で無菌的に調整するよう留意した。

（Ｍｅｄｉｕｍ（１）（洗浄用）の調製）
Ｍｅｄｉｕｍ（１）（洗浄用）：５．５％ＡＣＤ－Ａ／１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ１６４０
ＲＰＭＩ１６４０ ５００ｍｌのボトルにＡＣＤ－Ａ液３０ｍｌを添加した後、２５％ＨＳＡ２０ｍｌを添加した。

ＡＣＤ－Ａ液 ３０ｍｌ
ＲＰＭＩ１６４０ ５００ｍｌ／Ｔｏｔａｌ ５３０ｍｌ×２本
↓
２５％ＨＳＡ ２０ｍｌ／Ｔｏｔａｌ ５５０ｍｌ×２本
↓
ＲＰＭＩ１６４０が入っていた５００ｍｌボトルに以下のように移し、密閉して運搬した。
（１）５６０ｍｌ→３８℃用
（２）５４０ｍｌ→室温用

（Ｍｅｄｉｕｍ（２）（洗浄・培養用）の調製）
Ｍｅｄｉｕｍ（２）（洗浄・培養用）：１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ１６４０
ＲＰＭＩ１６４０ ５００ｍｌのボトルに２５％ＨＳＡ ２０ｍｌを添加した。

２５％ＨＳＡ ２０ｍｌ
ＲＰＭＩ１６４０ ５００ｍｌ／Ｔｏｔａｌ ５２０ｍｌ×２本
↓
洗浄用として１本は室温のまま、もう一本は分離用として４℃で保冷しておいた。

（分離液（比重：１．０７５）の調製）
ＯｐｔｉＰｒｅｐ比重液を以下のように２２５ｍｌ遠沈管に調整した。

※調整前に、ＯｐｔｉＰｒｅｐは室温に戻しておいた。

比重：１．０７５→ＰＢＳ １０６．５ｍｌ＋ＯｐｔｉＰｒｅｐ ３０ｍｌ
※ＯｐｔｉＰｒｅｐは粘度が高いので、分取する際は注意して正確に行うこと
※ピペット内部にＯｐｔｉＰｒｅｐが残らないようにピペッティングすること
↓
穏やかに転倒混和し、５０ｍｌ遠沈管８本に１５ｍｌずつ分注した。

（洗浄用ＰＢＳの調製）
洗浄用ＰＢＳ：０．５％ＨＳＡ／ＰＢＳ（４℃で保冷しておく）
ＰＢＳ ５００ｍｌのボトルに２５％ＨＳＡ １０ｍｌを添加した。
２５％ＨＳＡ １０ｍｌ
ＰＢＳ ５００ｍｌ／Ｔｏｔａｌ ５１０ｍｌ×１本

（フラスコ洗浄用ＲＰＭＩ１６４０）
フラスコのインキュベート開始時にＲＰＭＩ１６４０ ５００ｍｌのボトルをそのまま３７℃（インキュベーター内）で温めておいた。

（（１）凍結検体の解凍・洗浄工程：プルモザイム処理あり）
以下に凍結保護剤を用いた処理方法を記載する。

Ｄａｙ ０
（１．機器の準備）
Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈを３８℃に温めた。
遠心機の設定（遠心特性設定を確認）を行った（バランスの作成も行う）。
セルカウンターの設置
（２．遠沈管の準備）
２２５ｍｌ遠沈管５本に「Ａ」「Ｂ」「Ｃ」「（９）Ｓ」「（９）Ｐ」、５０ｍＬ遠沈管１本に「Ｄ」とラベルを付けて準備した。
別に廃液用ボトルも準備した。

（３．試薬の準備）
上記工程で調製したＭｅｄｉｕｍ（１）（５６０ｍｌボトル）を以下のように分注した。

Ｍｅｄｉｕｍ（１）：５．５％ＡＣＤ－Ａ／１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ１６４０
２２５ｍｌ遠沈管２本（Ａ、Ｂ）に１８０ｍｌずつ
２２５ｍｌ遠沈管１本（Ｃ） に１６０ｍｌ
５０ｍｌ遠沈管１本（Ｄ） に４０ｍｌ（共洗い用）
分注し、Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ温めておいた。

ボトル残り１本（５４０ｍｌ）は室温のままおいておいた。

Ｍｅｄｉｕｍ（２）：１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ１６４０
洗浄用として１本は室温のまま、もう一本は分離用として４℃で保冷しておいた。

（４．サンプルチューブ準備）
サンプリング、カウントに使用するエッペンチューブを準備した。

（５．Ｍｅｄｉｕｍの準備 ５．５％ ＡＣＤ－Ａ）
温めておいたＭｅｄｉｕｍ（１）（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を全て取り出した。

（６．凍結検体の準備）
フローズバッグ（凍結アフェレーシス検体）を液体窒素から取り出した。

（７．凍結検体の解凍）
フローズバッグを３８℃Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈで速やかに解凍した（約２分）。

（８．細胞の回収１回目）
フローズバッグをクリーンベンチに入れて、接続部が不潔にならないよう（宙に浮くようにして）バッグスパイクと５０ｍｌシリンジを接続して回収した。（１回目）

（９．細胞の分注、Ｗａｓｈ １回目）
１回目の回収液量を測定し、２２５ｍｌ遠沈管（Ａ、Ｂ、Ｃ：Ｍｅｄｉｕｍ（１））に３等分して分注した。

１回目の回収液量：４０ｍｌ（約１３ｍｌずつ）

（１０．細胞の分注、Ｗａｓｈ １回目）
５０ｍＬシリンジに１８Ｇ針を接続して、５０ｍｌ遠沈管（Ｄ）よりＭｅｄｉｕｍ（１）を２２ｍｌ分取した。

（１１．細胞の回収、２回目）
再度フローズバッグへ接続し、バッグ内に残った細胞を洗い回収した。（２回目）

（１２．細胞の回収、２回目）
２回目の回収液量を測定し、２２５ｍｌ遠沈管（Ｃ）に添加した。

２回目の回収液量：２４ｍｌ（遠沈管Ｃには原料が約１５ｍｌ添加された計算となる）

（１３．細胞の回収、２回目）
遠沈管に蓋をして、数回転倒混和した。

（１４．検体の遠心分離、１回目）
遠心分離（２０℃，３５０×ｇ，５分， ブレーキ２）を行った。

（１５．上清の除去）
上清を除去した（５０ｍｌピペット）。廃液は廃液ボトルに廃棄した。

この時、細胞のロスを減らすために上清を約１０ｍｌ程度残しておくことに留意した。

（１６．細胞の懸濁）
遠沈管の底をチューブ立てに当て、横に滑らせてペレットをほぐした。

これ以降の作業は、以下のように条件を分けて別々に作業を行った。

２２５ｍｌ遠沈管Ａ →プルモザイム処理あり
２２５ｍｌ遠沈管Ｂ、Ｃ →プルモザイム処理なし

（プルモザイム処理あり）
以下、プルモザイム処理ありの工程を引き続き行った。

（１７．２２５ｍｌ遠沈管Ａ）（プルモザイム処理あり）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（１）を２０ｍｌ（２５ｍｌピペット）加えてｓｕｓｐｅｎｄした。

（１８．ｗａｓｈ２回目 ５．５％ＡＣＤ－Ａ）（プルモザイム処理あり）
室温Ｍｅｄｉｕｍ （１）で２００ｍｌまでメスアップ（５０ｍｌピペット）して３回程度、転倒混和した。

ここで凝集塊の有無を確認し、凝集塊がないことを確認した。

（凝集塊の有無に関わらず、工程２１以降の遠心・上清除去後細胞懸濁液のプルモザイム処理を行う。）

（１９．検体の遠心分離、２回目）（プルモザイム処理あり）
遠心分離（２０℃，３００×ｇ，５分， ブレーキ２）を行った。

（２０．上清の除去）（プルモザイム処理あり）
残液が約５ｍｌとなるように上清を除去した（５０ｍｌピペット）。

廃液は廃液ボトルに廃棄した。

（２１．細胞の懸濁）（プルモザイム処理あり）
遠沈管の底をチューブ立てに当て、横に滑らせてペレットをほぐした。

（２１．１．プルモザイム処理）（プルモザイム処理あり）
残液で細胞を懸濁し（１０ｍｌピペット）、懸濁液量を計測した。

懸濁液量：２．５ｍｌ
→５ｍｌ－懸濁液量：２．５ｍｌ＝添加量：２．５ｍｌ
（足りない場合はＭｅｄｉｕｍ（１）を添加量分加える）

（２１．２．プルモザイム処理）（プルモザイム処理あり）
プルモザイム（２．５ｍｇ／２．５ｍｌ）を１ｍｌ添加した。

（２１．３．プルモザイム処理）（プルモザイム処理あり）
チューブを揺らしながら、１５分間反応させた。

（２２．ｗａｓｈ３回目、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理あり）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（２）を２０ｍｌ（２５ｍｌピペット）加えてｓｕｓｐｅｎｄした。

室温Ｍｅｄｉｕｍ（２）を１７５ｍｌ加えて２００ｍｌまでメスアップ（５０ｍｌピペット）し、３回程度、転倒混和した。

（２３．サンプリング）（プルモザイム処理あり）
懸濁液をサンプリングした（サンプル（８）Ｐ）（細胞数カウントのみ）。

→エッペンチューブ（×５希釈用）に１０μｌ分取。

（２４．検体の遠心分離、３回目）（プルモザイム処理あり）
遠心分離（２０℃、３００×ｇ、５分、ブレーキ２）を行った。

（２５．１．細胞のカウント）（プルモザイム処理あり）
遠心分離中にサンプル（８）Ｐの細胞数のカウントを行った。

結果は、細胞数記録表に記録して細胞数を計算した。

サンプル（８）Ｐの生細胞数：３．０×１０^８個…［Ａ］

（２５．２．試薬・機器の準備）（プルモザイム処理あり）
工程２４の遠心終了後、遠心機のブレーキの設定をＯＦＦに変更し、４℃に設定して冷やした。

（２５．３．Ｍｅｄｉｕｍ準備、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理あり）
４℃で冷やしておいた冷Ｍｅｄｉｕｍ（２）（５００ｍｌボトル）を準備した。

（２６．上清の除去、サンプリング）（プルモザイム処理あり）
上清を除去した（５０ｍｌピペット）。

（ここでは、１回目のｗａｓｈよりも上清を除去して良い（約５ｍｌ程度））
→上清は２２５ｍｌ遠沈管（（９）Ｐ）に回収した（ＦＣＭのみ）。

（２７．細胞の懸濁）（プルモザイム処理あり）
遠沈管の底をチューブ立てに当て、横に滑らせてペレットをほぐした。

残液で細胞を懸濁し（１０ｍｌピペット）、懸濁液量を計測した。

懸濁液量：４．０ｍｌ…［Ｂ］

（２８．懸濁液量の計算）（プルモザイム処理あり）
カウント結果より、細胞の懸濁液量を以下の式より算出し、細胞濃度を調整した。

（１）（８）Ｐの細胞数が４ｘ１０＾８個未満であるため、懸濁液量は２０ｍｌとした。

（２）［Ｃ：２０ｍｌ］－［Ｂ：４．０ｍｌ］＝添加量：１６．０ｍｌ…［Ｅ］

（２９．懸濁液の調製）（プルモザイム処理あり）
工程２７（細胞の懸濁）の細胞懸濁液に冷Ｍｅｄｉｕｍ（２）を添加量１６．０ｍｌ加え、１０ｍｌピペットを用いてピペッティングした。

（３０．サンプリング）（プルモザイム処理あり）
細胞懸濁液をサンプリングした（サンプル（１０）Ｐ）（細胞数カウント、ＦＣＭ用）。

→１５ｍｌ遠沈管（×２０希釈用）に０．５ｍｌ分取
Ｏｐｔｉｐｒｅｐでの分離に必要な５０ｍｌ遠沈管の本数を確認した（分離本数：１本）
↓
「（２）未熟樹状細胞の調整」の工程へ進む
重層するまでの間、細胞懸濁液は４℃で静置した。

（プルモザイム処理なし）
工程１７以降は以下のようにしてプルモザイム処理なしの工程を引き続き行う。

（１７．２２５ｍｌ遠沈管Ｂ、Ｃ）（プルモザイム処理なし）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（１）を２０ｍｌ（２５ｍｌピペット）加えてｓｕｓｐｅｎｄした。

２本の遠沈管（Ｂ、Ｃ）の懸濁液を２２５ｍｌ遠沈管（Ｃ）１本にまとめた。この際、室温Ｍｅｄｉｕｍ（１）を２０ｍｌ用いて遠沈管を共洗いした。

（１８．Ｗａｓｈ２回目、５．５％ＡＣＤ－Ａ）（プルモザイム処理なし）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（１）で２００ｍｌまでメスアップ（５０ｍｌピペット）して３回程度、転倒混和した。

（１９．検体の遠心分離、２回目）（プルモザイム処理なし）
遠心分離（２０℃，３００×ｇ，５分， ブレーキ２）を行う。

（２０．上清の除去）（プルモザイム処理なし）
上清を除去した（５０ｍｌピペット）。廃液は廃液ボトルに廃棄した。

残液が約５ｍｌとなるように上清を除去したる（５０ｍｌピペット）。

（２１．１．細胞の懸濁、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理なし）
遠沈管の底をチューブ立てに当て、横に滑らせてペレットをほぐした。

（２１．２．細胞の懸濁、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理なし）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（２）を２０ｍｌ（２５ｍｌピペット）加えてｓｕｓｐｅｎｄした。

懸濁液量を計測した。懸濁液量：２７．５ｍｌ

（２１．３．細胞の懸濁、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理なし）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（２）を１２０ｍｌ添加（５０ｍｌピペット）して凝集塊の有無を確認した。（凝集塊：なし）

（２２．Ｗａｓｈ３回目、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理なし）
室温Ｍｅｄｉｕｍ（２）を５２．５ｍｌ加えて２００ｍｌまでメスアップ（５０ｍｌピペット）して、ピペッティングにて細胞を懸濁した。

（２３．サンプリング）（プルモザイム処理なし）
懸濁液をサンプリングした（サンプル（８）Ｓ）（細胞数カウントのみ）。

→エッペンチューブ（×５希釈用）に１０μｌ分取

（２４．検体の遠心分離 ３回目）（プルモザイム処理なし）
遠心分離（２０℃、３００×ｇ、５分、ブレーキ２）を行った。

（２５．１．細胞のカウント）（プルモザイム処理なし）
遠心分離中にサンプル（８）Ｓの細胞数のカウントを行った。

結果は、細胞数記録表に記録して細胞数を計算した。

サンプル（８）Ｓの生細胞数：５．０×１０^８個…［８Ｓ］

（２５．２．試薬・機器の準備）（プルモザイム処理なし）
工程２４の遠心終了後、遠心機のブレーキの設定をＯＦＦに変更し、４℃に設定して冷やした。

（２５．３．Ｍｅｄｉｕｍ準備、１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）（プルモザイム処理なし）
４℃で冷やしておいた冷Ｍｅｄｉｕｍ（２）（５００ｍｌボトル）を準備した。

（２６．上清の除去、サンプリング）（プルモザイム処理なし）
残液が約５ｍｌとなるように上清を除去した（５０ｍｌピペット）。

→上清は２２５ｍｌ遠沈管（（９）Ｓ－１）に回収した（ＦＣＭ）。

（２７．細胞の懸濁）（プルモザイム処理なし）
冷Ｍｅｄｉｕｍ（２）を２０ｍｌ（２５ｍｌピペット）加えてｓｕｓｐｅｎｄした。

懸濁液量を計測した。

懸濁液量：２８ｍｌ…［Ｂ］

（２８．懸濁液量の計算） （プルモザイム処理なし）
カウント結果より、細胞の懸濁液量を以下の式より算出し、細胞濃度を調整した。（「プルモザイム処理あり」と同じ細胞濃度となるように調整した）
（１）［８Ｓ：５０×１０＾７個］／［１．５×１０＾７個／ｍｌ］＝３３ｍｌ…［Ｃ：細胞懸濁液総量］
（２）［Ｃ：３３ｍｌ］－［Ｂ：２８ｍｌ］＝添加量：５ｍｌ…［Ｅ］

（２９．懸濁液の調製）（プルモザイム処理なし）
工程２７（細胞の懸濁）の細胞懸濁液に冷Ｍｅｄｉｕｍ（２）を添加量５ｍｌ加え、１０ｍｌピペットを用いてピペッティングを行った。

（凝集塊の処理）
工程２９において、大きな凝集塊を認めたため、以下の作業を行った。

５０ｍｌ遠沈管に室温Ｍｅｄｉｕｍ（２）を２０ｍｌ加えておいた。
１０ｍｌピペットで凝集塊のみを採取して５０ｍｌ遠沈管に移し、凝集塊をｓｕｓｐｅｎｄしてほぐした。

３０秒程静置して、残った凝集塊が自然に沈むのを待った。

大きな凝集塊が入らないように上清を回収し、工程２９の細胞懸濁液へ戻した。

（３０．サンプリング）（プルモザイム処理なし）
細胞懸濁液をサンプリングした（サンプル（１０））（細胞数カウント、ＦＣＭ用）。

→１５ｍｌ遠沈管（×２０希釈用）に０．５ｍｌ分取
Ｏｐｔｉｐｒｅｐでの分離に必要な５０ｍｌ遠沈管の本数を計算した。

［Ｃ：３３ｍｌ］／２０ｍｌ＝分離本数：２本
（１本目に２０ｍｌを重層後、残液を２０ｍｌにメスアップしてから２本目に重層した）
↓
「（２）未熟樹状細胞の調整」の工程へ進む

（結果）
本実施例において、凍結保護剤（ＣＰ－１）を利用することによって、アフェレーシス直後で約３０％であった単球純度が、解凍洗浄工程後に約５０％に上昇した。さらに、比重遠心分離工程後に、単球純度が約７０％まで上昇した（表４）。

＊解凍洗浄およびＯｐｔｉＰｒｅｐ後のサンプルは、５～２２μｍにゲーティングし、Ｔａｘパルス前および最終凍結前のサンプルは７～２２μｍにゲーティングした。

ＤＮａｓｅ添加無し群では、Ｄａｙ０の製造工程において凝集塊が発生したが、ＤＮａｓｅ添加有り群では、添加処理後には凝集塊が発生しなかった。また両群において、Ｄａｙ０の単球のフラスコへの接着、Ｄａｙ７に回収したＤＣの純度・表面形質に明らかな差を認めなかった。

今回のＳｐｅｃｔｒａ Ｏｐｔｉａを用いた採取条件では、目的の細胞である単球を十分に採取可能であり、リンパ球、赤血球、血小板などの混入を軽減することができた。これらの目的外の細胞の混入を減らすことでＡＴＬ－ＤＣ回収率や品質の向上につながると考えられる。

今回の検証では、解凍洗浄工程に用いる洗浄液のｐＨ調整を実施しなかったが、フルスケール製造に換算した場合に投与可能となるＤＣの収率が得られ、ＤＣの純度も良好であった（表５）。

（実施例５：Ｄａｙ０単球・リンパ球解析）
本実施例は、以下の通り行った。

（染色）
１．１％ＦＢＳ／ＰＢＳにて懸濁し、１ｘ１０＾７／ｍＬ程度に調整した。
２．ＦＡＣＳ Ｔｕｂｅに抗体を分注し、細胞懸濁液を１００μＬずつ添加した。
３．２０ｍｉｎ、氷上で遮光にてインキュベートした。
４．冷ＰＢＳを４ｍＬずつ添加し、４４０ｇ、６ｍｉｎ、４℃で遠心した
５．デカントにて上清除去し、１％ＦＢＳ／ＰＢＳ適量（２５０μＬ以上）にて細胞を懸濁した。
６．測定まで、氷上、遮光で保管後、フローサイトメトリーに供した。
抗体による染色は図１３に示す通り行った。

（結果）
結果を図１～４に示す。図１～２はプルモザイム処理あり、図３～４はプルモザイム処理なしの試料のＤａｙ０の単球・リンパ球解析の結果である。図１および３は、ＯｐｔｉＰｒｅｐ前の試料、図２および４はＯｐｔｉＰｒｅｐ後の試料である。

（実施例６：最終凍結前検体のＤＣ解析）
本実施例は、以下の通り行った。

（抗体分注）
１）染色用のＦＣＭチューブを１８本に、「Ｐ、Ｓ」（２通り）－「１～９」（９通り）のラベルを作成して貼った。
２）抗体ｍｉｘ作成用のＦＣＭチューブ９本「Ａｂ１～９」に、各Ｓｔａｉｎの抗体ｍｉｘを作成した。
３）軽くボルテックスして混和した。
４）各Ｓｔａｉｎの抗体を各チューブに分注した。
５）使用するまで、遮光して４℃にて保管した。

（染色）
１）回収した細胞懸濁液（２ｘ１０＾６ｃｅｌｌｓ程度）を受け取った。
２）１％ ＦＢＳ／ＰＢＳを添加し全量を１０ｍｌにして混和した。
３）遠心分離（４℃， ４００ｇ， ５分）した。
４）上清を除去した。
５）１％ ＦＢＳ／ＰＢＳを７００μｌ添加し、ピペッティングしてペレットを懸濁した。
６）ボルテックスにて混和した。
７）抗体を分注したＦＣＭチューブに細胞懸濁液を５０μｌずつ分注した。
８）ボルテックスにて混和した。
９）４℃、遮光にて３０分間インキュベートした。（１５分の時点で軽くボルテックスした。）
１０）１％ ＦＢＳ／ＰＢＳ２ｍｌを加えて、ボルテックスにて混和した。
１１）遠心分離（４℃、４００ｇ、５分）した。
１２）デカンテーションにて上清を除去した。
１３）１％ ＦＢＳ／ＰＢＳを４００μｌずつ添加して、ボルテックスにて混和した。
１４）測定まで４℃、遮光にて保管した。

（結果）
図５～７は、プルモザイム処理ありの種々の抗体を用いて得られた樹状細胞の特性を確認したものである。図５～７は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。

図８～１０は、プルモザイム処理なしの種々の抗体を用いて得られた樹状細胞の特性を確認したものである。図８～１０は、各々のマーカーに対する抗体を用いたＦＣＭを示す。

（実施例７：パルス細胞の製造までのフロー）
ＡＴＬ－ＤＣ製造工程フローを以下に示す。

以下のフローの一部は上述したものであり、樹状細胞の分化以降については、簡潔に示す。

（プロトコール）
Ｄａｙ０
（１）解凍洗浄工程
・３８℃恒温槽で凍結保存検体を解凍する。
・ＡＣＤ－Ａ／ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０を用いる洗浄工程（２～３回）
・ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０を用いる洗浄工程（０～１回）
・洗浄工程におけるプルモザイムによる凝集塊の懸濁
・ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０ を用いた細胞懸濁液の作製工程

（２）比重遠心分離工程
・ＯｐｔｉＰｒｅｐを用いた単球／リンパ球分離工程
・ＨＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０を用いた単球懸濁液の作製工程

（３）接着処理工程、培養開始
・Ｔ－１７５フラスコにて、ＡＺＴ存在下で１２０分間静置
・非接着細胞の回収と接着細胞の洗浄工程
・樹状細胞への分化工程：ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＡＺＴを添加したＨＳＡ含有ＲＰＭＩ－１６４０を用いて５日間培養

Ｄａｙ５
・ＫＬＨパルス工程
・ＫＬＨ、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＡＺＴ、ＨＳＡを含有したＲＰＭＩ－１６４０を添加して１日間培養
Ｄａｙ６
・ＯＫ４３２（）処理工程：
・ピシバニール／抗悪性腫瘍溶連菌製剤であるＯＫ４３２を培養液中に添加し、更に１日間培養

Ｄａｙ７
・成熟樹状細胞の回収工程
・Ｔａｘペプチドパルス工程（室温２２±３℃， ９０分間）
・遠心による洗浄工程（２回）

これにより、Ｔａｘペプチドパルス樹状細胞が得られる。
・最終製剤化工程：
・細胞密度の調製（１ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
・細胞凍結保存液との混合（５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
・クライオチューブ等への充填（２．５ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ｔｕｂｅ）
・クライオチューブ（凍結保存細胞）および添付融解剤（生理食塩水）のアンプルへのラベリング
・製剤の保存：凍結保存細胞（≦－８０℃）
生理食塩水（室温）

最終製剤（凍結保存細胞＋添付融解剤）が得られる。

出荷時は以下を行う。

規格試験（製造機関）：
生細胞数、生細胞率、表面形質解析（ＦＣＭ）、無菌試験、エンドトキシン、マイコプラズマ（ＰＣＲ法）
(結果）
以上のようにしてＴａｘペプチドパルス樹状細胞が製造されることを確認した。

（実施例８：得られた細胞の特性分析およびＭＬＲ）
上記実施例で得られた樹状細胞（Ｐ２Ｅｘｐ２１のＤＣ製品（Ｓ／Ｐ＝プルモザイムなし／あり）の機能を確認するため、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）解析を行った。ＭＬＲ解析では、同種ＣＤ４陽性細胞と共培養しリンパ球刺激能を評価した。

ＭＬＲの手順は以下の通りである。

（材料および方法）
［必要物品］
１５ｍＬ コニカルチューブ
キャップ付きＦＡＣＳチューブ
ブルーチューブ
２／５／１０ｍＬ ピペット
ＰＢＳ
ＰＢＳ／ＦＢＳ：ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、ＰＢＳ／１％ＦＢＳ
ＲＰＭＩ
Ｒ１０：ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ
９６ｗｅｌｌ Ｕ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ Ｃａｔ＃１６３３２０）
ＢＤ ＩＭａｇ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｅｔ－ＤＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃５５７９３９）
ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃１５０３４７５９４）
※１ｍＭに調整分注して－２０℃で凍結保存。凍結融解は４回したら破棄する（フタに正の字を記入）
Ｖ４５０－Ａｎｔｉ ＣＤ３ Ａｂ（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｃａｔ＃５６０３６５）
ＡＰＣ Ｃｙ７－Ａｎｔｉ ＣＤ４ Ａｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃３００５１７）
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１
マイクロピペット（２、１０、２０、１００、２００、１０００μＬ）
フィルター付きチップ（１０、２０、１００、２００、１０００μＬ）
ピペットエイド
［必要機器］
品質の保証された遠心機
血球計算盤カウンター
倒立顕微鏡

（Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＣＤ４細胞の分離）
＜ＰＢＭＣの分離＞
１）ヘパリン採血した健常人末梢血１０ｍＬを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた比重遠心分離法にてＰＢＭＣに分離した。

＜ＣＤ４細胞の分離＞
１）１％ＦＢＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ・・・［Ａ］を以下の通り調製した。
ＰＢＳ １６ｍＬ＋ＢＳＡ １６０μＬ＋ＥＤＴＡ ６４μＬ（０．５Ｍ）
２）ＰＢＭＣに１０ｘ１０＾６個／ｍＬとなるように［Ａ］を加えて、Ｐ１０００でＳｕｓｐｅｎｄして蓋付きＦＡＣＳチューブへ移した。
３）Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌを５μＬ／１ｘ１０＾６個添加してＰ１０００でピペッティングし、１５ｍｉｎ、ＲＴでｉｎｃｕｂａｔｅした。
４）［Ａ］を添加して４ｍＬにメスアップして、遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ブレーキ１）し、上清除去した（Ｐ１０００チップ使用）。
５）Ｐ１０００で［Ａ］を１ｍＬ添加してｓｕｓｐｅｎｄし、さらに［Ａ］を３ｍＬ添加した。
６）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ブレーキ１）し、上清除去した（Ｐ１０００チップ使用）。
７）Ｓｔｅｐ５）～６）をもう一度実施した。
８）ＢＤ ＩＭａｇ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｌｕｓ－ＤＭをボルテックス後、５μＬ／１ｘ１０＾６個添加した。
９）Ｐ１０００でＳｕｓｐｅｎｄ（ほぐれなければＰ２００を使用）して、３０ｍｉｎ、ＲＴでインキュベートした
以下、特に泡立てないように注意して行った。
１０）［Ａ］を１．６ｍＬ添加した（２ｍＬに調整、２０～８０ｘ１０＾６個／ｍＬの範囲となるように）（チューブ［１］）。
１１）チューブ［１］をＭａｇｎｅｔへ６ｍｉｎ静置。
１２）２ｍＬピペットでチューブ［１］の奥に接触しないように上清を新たなチューブ［２］に回収した。
１３）チューブ［１］に［Ａ］を２ｍＬ添加してｓｕｓｐｅｎｄし、チューブ［１］および［２］をＭａｇｎｅｔへ６ｍｉｎ静置した。
１４）２ｍＬピペットでチューブ［２］→１５ｍＬチューブに上清回収後、チューブ［１］の上清→チューブ［２］へ回収した。
１５）チューブ［２］をＭａｇｎｅｔへ６ｍｉｎ静置、１５ｍＬチューブはｏｎ ｉｃｅで静置した。
１６）２ｍＬピペットでチューブ［２］から１５ｍＬチューブに上清をまとめた。
１７）Ｒ１０（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ）で１４ｍＬにメスアップした。
１８）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ）後に、上清を除去した。
１７）ＲＰＭＩ １０ｍＬにＳｕｓｐｅｎｄして細胞数をカウントした。
１８）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ）後、上清を除去した。
１９）ＭＬＲセットアップの前日以前に分離し、すべての細胞を凍結。ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１で５ｘ１０＾６個／ｍＬに調整して、５ｘ１０＾６個／ｔｕｂｅずつ分注し、バイセルに入れて－８０℃で保存する。

（ＭＬＲ１日目）
＜ＤＣ製剤の解凍＞
１）ＤＣ製剤の解凍、樹状細胞数のカウントはＡＴＬ－ＤＣ－１０１最終投与製剤の調製に準じて行った（ただし生理食塩水の代わりにＰＢＳを使用）。
２）カウントした樹状細胞数に基づき、Ｒ１０（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ）を用いて０．３ｍＬ程度の２ｘ１０＾５個／ｍＬ ＤＣ細胞懸濁液（Ａ）を調整した。残りのＤＣは細胞表面抗原の染色に使用した。
以下、細胞懸濁液をゆるくＶｏｒｔｅｘをかけてから分取を行った。
３）ＤＣ細胞懸濁液（Ａ）から０．５ｍＬの２ｘ１０＾４個／ｍＬ ＤＣ細胞懸濁液（Ｂ）を調製した。
４）ＤＣ細胞懸濁液（Ｂ）から０．５ｍＬの２ｘ１０＾３個／ｍＬ ＤＣ細胞懸濁液（Ｃ）を調製した。
５）＊＊下図のように、９６ ｗｅｌｌ Ｕ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅのＦ－７、８、Ｅ－７、８、Ｄ－７、８へＤＣ細胞懸濁液（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）をそれぞれ１００μＬずつ入れた。また、Ｃ－５、７、８、Ｄ－５、Ｅ－５、Ｆ－５にＲ１０を１００μＬ入れた。

６）蒸発防止のため、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの最も外側のｗｅｌｌ（３６ｗｅｌｌ）にＭｉｌｌｉ－Ｑ水を２００μＬずつ加えた。
７）ｐｌａｔｅを４℃で冷やした。（以後、取り出す際には、ふたの水滴がＢｕｆｆｅｒにつかないように注意した）
＊＊鏡検用に同様のｐｌａｔｅをもう１ｓｅｔ作成。Ｄｏｕｂｌｅｔやｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ用は必要ない。

＜ＣＤ４細胞の解凍とＣＦＳＥ標識＞
１）１５ｍＬコニカルチューブにＲ１０を１４ｍＬ入れ、３７℃ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ内で温めた。
２）Ｒ１０が温まった後、ＣＤ４細胞凍結チューブを３７℃ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ内で急速に溶かした。
３）解凍後すぐにチューブ内の細胞液を、温まったＲ１０に移し、キャップをしっかり閉めて転倒攪拌した。
４）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）
５）アスピレーションピペットで上清を吸引した後、１３ｍＬのＲ１０で細胞をｓｕｓｐｅｎｄした。
６）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）。
７）アスピレーションピペットで上清を吸引した後、１０ｍＬのＲ１０で細胞をｓｕｓｐｅｎｄした。
８）細胞数をカウントした。（ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ： ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ＝１：１）
９）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）
１０）ピペットで上清を吸引した後、Ｒ１０で細胞を２ｘ１０＾６ 個／ｍＬに調整した。
１１）ｐｌａｔｅのＣ－５、Ｅ－５、Ｆ－５に細胞懸濁液を１００μＬずつ加え、再びｐｌａｔｅを４℃で冷やした。
１２）残った細胞をキャップ付きＦＡＣＳチューブに全て移した。
１３）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）
１４）ピペットで上清を吸引した。
１５）４ｍＬのＰＢＳで細胞をｓｕｓｐｅｎｄした。
１６）Ｓｔｅｐ１３）－１５）をさらに２回繰り返した。（新たなキャップ付きＦＡＣＳチューブに移さなくてよい）
１７）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）
１８）Ｐ１０００チップで上清を吸引した
１９）０．５～１ｘ１０＾７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、０．４ｍＬのＰＢＳで細胞をｓｕｓｐｅｎｄした。
２０）クリーンベンチの電気を消した。
２１）ＣＦＳＥ（１ｍＭ）を２μＬ加えて、チューブを振ってよく混ぜた（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ ５μＭ）
２１）細胞をｉｎｃｕｂａｔｏｒで温めた（３７℃、１５ｍｉｎ）。
２２）細胞を簡単にｖｏｒｔｅｘし、Ｒ１０を３．６ｍＬ加え、計４ｍＬとした。
２３）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）
２４）Ｐ１０００チップで上清を吸引した。
２５）簡単にｖｏｒｔｅｘし、４ｍＬのＲ１０を加えた。
２６）Ｓｔｅｐ２３）－２５）をさらに２回繰り返した。
２７）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）
２８）Ｐ１０００チップで上清を吸引した。
２９）細胞をＲ１０で２ｘ１０＾６個／ｍＬに調整した。
３０）ｐｌａｔｅのＤ－５、Ｃ－７、８、Ｄ－７、８、Ｅ－７、８、Ｆ－７、８に細胞を１００μＬずつ加えた（ピペッティングは不要）。
３１）ｐｌａｔｅをアルミホイルで遮光した（密閉しない）。
３１）３７℃で4日間ｉｎｃｕｂａｔｅした。

（ＭＬＲ５日目）
＜回収・洗浄、ＦＣＭ解析＞
１）ブルーチューブ７本に１％ＦＢＳ／ＰＢＳを３ｍＬずつ分注した。
２）９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅよりそれぞれの細胞をブルーチューブに回収した。Ｄｏｕｂｌｅｔは１本にまとめた。（Ｐ２００を使用してしっかりＳｕｓｐｅｎｄして回収する。泡立てないように注意した。）
３）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）した後、デカントにて上清除去し、ボルテックスした。
４）１％ＦＢＳ／ＰＢＳを４ｍＬずつ添加した。
５）Ｓｔｅｐ３）および４）をもう一度繰り返した。
６）遠心（７００ｇ、５ｍｉｎ、ＲＴ）した後、デカントにて上清除去し、ボルテックスした。
７）１％ＦＢＳ／ＰＢＳ １００μＬずつ添加した。
８）それぞれに抗体を添加し、ボルテックスした。
（抗体添加量：Ｖ４５０－ＣＤ３ Ａｂ ５μＬ、ＡＰＣ Ｃｙ７－ＣＤ４ Ａｂ １μＬ）
９）２０ｍｉｎ、４℃で遮光した（ｉｃｅ上にチューブスタンドを置いた）。
１０）１％ＦＢＳ／ＰＢＳ４ｍＬ添加し、４４０ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心した。
１１）デカントにて上清除去し、ボルテックスした。
１２）Ｓｔｅｐ９）および１０）をもう一度繰り返した。
１３）１％ＦＢＳ／ＰＢＳ ４５０μＬでサスペンドしてボルテックスした。
１４）ＦＣＭ解析を実施した。

（使用検体）
ＤＣ：
Ｐ２Ｅｘｐ１４ ＣＥ－ＤＣ１９０６２５（２．５×１０＾６個／本×１本）
Ｐ２Ｅｘｐ２１－Ｓ－ＤＣ２００１２９（２．５×１０＾６個／本×１本）
Ｐ２Ｅｘｐ２１－Ｐ－ＤＣ２００１２９（２．５×１０＾６個／本×１本）
ＣＤ４ ｃｅｌｌｓ：ＨＤ－ＣＤ４－２００１２４（４．８ｘ１０＾６個／本×２本）
（結果）
・Ｐ２ＥＸＰ２１のＤＣ製品（Ｓ／Ｐ）はいずれもＭＬＲ反応陽性であった。また、反応強度はＳのほうがやや高い傾向を認めたが、明らかな差ではなかった。

（結果）
結果を図１１に示す。

示されるように、ＤＮａｓｅ処理の有無にかかわらず、本開示の方法で得られたＤＣにおいて、ＣＦＳＥが減衰したＣＤ４陽性細胞が認められたことから、ＣＤ４陽性細胞刺激能を有することが示された。

図１１では、以下の試料の樹状細胞製品の機能試験結果を示す。
１）Ｐ２Ｅｘｐ１４ ＣＥ－ＤＣ１９０６２５（従来法によるアフェレーシス原料）（陽性コントロールとして使用：従来法を使用したアフェレーシス原料から製造した樹状細胞製品で以前に機能試験を合格している製品）
２）Ｐ２Ｅｘｐ２１－Ｓ－ＤＣ２００１２９（Ｏｐｔｉａ（本開示の方法）によるアフェレーシス原料、ＤＮａｓｅ処理なし）
３）Ｐ２Ｅｘｐ２１－Ｐ－ＤＣ２００１２９（Ｏｐｔｉａ（本開示の方法）によるアフェレーシス原料、ＤＮａｓｅ処理あり）
図１１から、１）２）３）いずれの樹状細胞製品も樹状細胞濃度依存性にＣＤ４＋Ｔ細胞刺激能を有することがわかった。ＤＮａｓｅの有無により樹状細胞の機能に明らかな差を認めなかった。

以上から、本開示の方法で得られた単球で製造したＴａｘペプチドパルス樹状細胞は、機能性であることが証明された。

（実施例９：Ｐ１ ＡＴＬ－ＤＣ最終製剤から投与までの調製フロー）
最終製剤（凍結保存細胞＋添付融解液）は、出荷判定試験：生細胞数、無菌試験、エンドトキシン、マイコプラズマ（ＰＣＲ法）を行ったうえで、患者に投与を行う。

投与時には、細胞融解し、皮下投与用細胞懸濁液を調製し、１回あたり５Ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ投与
２週間毎に３回投与する。

工程内試験（ＣＰＣ）：（最終遠心上清）
無菌試験、エンドトキシン
を行う。

（実施例１０：単球回収及びリンパ球除去）
実施例１０では、実施例１と同様のプロトコールを用いたが、採取プレファレンス値を以下のように変更した。
アフェレーシス開始後０～１時間：採取プレファレンス値＋３０
アフェレーシス開始後１～３時間：採取プレファレンス値＋２０
この条件で採取したところ、高純度の単球を得られた（表７）。高純度の単球が得られたことにより、被験体のリンパ球除去率が低下したため、単球採取後に２次チャンバー分離方式（ＭＮＣ）プログラムのプリファレンス自動設定値でのアフェレーシス（リンパ球除去モード（プリファレンス自動設定値（30~50））を追加することを試みた。具体的には、単球採取後にプリファレンスを自動設定値に戻し採取を行った。

(結果）
本工程を追加することで、従来の採取時に除去できていたリンパ球数と同等のリンパ球除去が可能となった。

（実施例１１：治療）
実施例１０で採用した条件を用いると、樹状細胞の原料採取時のアフェレーシスとして使用しており、遠心分離法によって樹状細胞の原料である単球を採取することが目的であるが、治療用途（Therapeutic cytapheresis）でもある。
そこで、この条件を利用して、Treg等の抗腫瘍免疫を負に制御する免疫細胞を除去する。その後に投与された樹状細胞は、恒常性維持のために産生されるサイトカイン環境下で新たに増殖したナイーブTリンパ球に抗原提示ができる。
本実施例では、リンパ球除去モード（プリファレンス自動設定値（30~50)）を併用することにより、原料採取時のアフェレーシスは、遠心分離法によって樹状細胞の原料である高純度の単球を採取することができ、通常の治療アフェレーシスで達成されるようレベルである10⁹レベルのリンパ球の除去が可能となった（表８）。

なお、表８リンパ球除去は、単球採取工程によりリンパ球除去は含まず、単球採取工程とリンパ球除去工程のリンパ球数を加算した数は以下の通りである。
HD10：29.3X10^8
HD25: 19.8X10^8
HD04: 21.8X10^8
自動設定値より高値に設定すると単球分画、血小板分画が増加し、低値に設定すると好中球、赤血球分画が増加することにより、リンパ球除去率が低下すると考えられる。また単球採取工程後のリンパ球除去は、密度勾配遠心分離層が安定した後の採取となるため20分以上(可能であれば30分以上）の実施が好ましいと考えられる。
以下、単球分画（取り出す）工程およびリンパ球分画（取り出す）工程における比較を示したデータを以下に示す。

この結果、がん患者の免疫寛容状態を構成するTregなどの抑制系の免疫細胞を除去し、さらに生体の恒常性維持により新たに産生されるリンパ球やサイトカインによる抗腫瘍免疫の賦活を誘導することが期待できる。

（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０２０年２月２０日に出願された特願２０２０－２７５９５および２０２０年５月１日に出願された特願２０２０－８１５２３に対して優先権主張を伴うものであり、それらの内容は全体が参考として援用される。

本開示で提供される技術は、成人Ｔ細胞白血病などの治療薬の製造業において利用することができる。

Claims (85)

1. 血液試料から単球試料を生産する方法であって、
   被験者から得られた血液試料を、比重および細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程
   を包含する方法であって、
   該濃縮工程において、スピルオーバーさせることを包含する、方法。
2. 前記濃縮工程は、前記血液試料を、比重に基づき単球を濃縮し、次いで細胞サイズに基づき単球を濃縮する、請求項１に記載の方法。
3. 血液試料から単球試料を生産する方法であって、
   被験者から得られた、６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値より高い血液試料を、比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程
   を包含し、
   該濃縮工程において、スピルオーバーさせることを包含し、
   該所定値が３０～５０である、
   方法。
4. 血液試料から単球試料を生産する方法であって、
   被験者から得られた、６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値より高い血液試料を、比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程
   を包含し、該血液試料の血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整され、
   該所定値が３０～５０である、
   方法。
5. 前記採取プレファレンスは、
   ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
   μl）］より高い値に設定される、請求項４に記載の方法。
6. 前記採取プレファレンスは、
   ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
   μl）］＋１０～２０に設定される、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より１０～３０高く設定される、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より２０～３０高く設定される、請求項７に記載の方法。
9. 前記採取プレファレンスは４０～８０に設定される、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記濃縮工程において、スピルオーバーさせることを包含する、請求項４～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 血液試料から単球試料を生産する方法であって、
    被験者から得られた血液試料から比重および／または細胞サイズに基づき単球を濃縮する工程であって、該濃縮工程において、リンパ球画分を取り除くように、リンパ球画分をスピルオーバーさせることを含む、工程
    を包含し、該スピルオーバーは、スピルオーバーとしてチャンバーから赤血球が継続的に溢れ出した時点での処理血液量（基準処理血液量）の値を１とした場合、該スピルオーバーは、処理血液量を基準処理血液量より大きい値に設定して実施される、方法。
12. 前記処理血液量は、前記基準処理血液量の少なくとも１．２倍である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記単球試料は、前記被験者から得られる血球試料から直接得るものであることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記濃縮は、前記血液試料を前記被験者から得た後５時間以内に行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記細胞サイズによる分離は、前記比重による分離の後３時間以内に行われる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記単球試料は、全有核細胞に対して約３０％以上の濃度の単球を含むことを特徴とする、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 血液試料から単球試料を生産する方法であって、
    １）被験者から得られた血液試料に凍結保護剤を添加する工程と、
    ２）該凍結保護剤を加えた該血液試料を比重により分離し、リンパ球より重い画分を得る工程と
    を包含する、方法。
18. 前記血液試料は、アフェレーシス分離を経たものである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記凍結保護剤は、ヒドロキシエチルスターチ、スクロース、ラクトース、グルコース、マンニトール、トレハロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、およびデキストランからなる群より選択される成分を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 前記濃縮は、凍結保存後になされることを特徴とする、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記比重による分離は、１．０７４～１．０７６の比重で遠心分離することを特徴とする、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記比重による分離は、以下の遠心分離条件によりなされる
    遠心分離１回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ３００×ｇ～４００×ｇ ５分 室温
    遠心分離２～３回目 ２２５ｍＬ遠沈管 ２５０×ｇ～３５０×ｇ ５分 室温
    請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記濃縮は、請求項１～１６のいずれか一項に記載されるアフェレーシス処理がなされた後になされる、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 血液試料から単球試料を生産する方法であって、
    １）得られた血液試料から、凍結保護剤を含む単球試料を得る工程と
    ２）該単球試料を、クエン酸ナトリウム水和物を含有する血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ液）を１０％以下で含む洗浄液で洗浄をする工程と
    を包含する方法。
25. 前記ＡＣＤ－Ａ液は６％以下で存在する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ＡＣＤ－Ａ液は５．５％で存在する、請求項２５に記載の方法。
27. 前記血液試料を、５．５％ＡＣＤ－Ａ液／１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／ＲＰＭＩ－１６４０の組成を有する洗浄液で洗浄することを包含する、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 死細胞除去処理を行うことをさらに包含する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記死細胞除去処理は、リンパ球および血小板をも除去することを含む、請求項２８記載の方法。
30. 前記死細胞除去処理は、比重遠心分離を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
31. 前記比重遠心分離は、密度媒体ヨージキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）水溶液を用いて行うことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ヨージキサノール水溶液は６０ｗ／ｖ％で提供される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記濃縮は、ＤＮａｓｅの添加なしまたはありで行われる、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記ＤＮａｓｅはプルモザイムを含む、請求項３３に記載の方法。
35. 請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法に従って、単球試料を得る工程と、
    該単球試料から樹状細胞を誘導する工程と
    を包含する、樹状細胞を生産する方法。
36. 前記樹状細胞をパルスする工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
37. 請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法に従って、単球試料を得る工程と、
    該単球試料から樹状細胞を誘導する工程と、
    該誘導した樹状細胞に対してＴａｘ抗原ペプチドをパルスする工程と
    を包含する、Ｔａｘ特異的樹状細胞を生産する方法。
38. 請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法で前記樹状細胞を生産する工程と、該樹状細胞を、凍結保護液に懸濁したものをクライオチューブに充填し、再生医療等製品とする工程を包含する、再生医療等製品を生産する方法。
39. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者の治療において使用する樹状細胞製剤の原料である単球試料を生産する方法であって、
    該方法は、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法により血球試料を生産するものであり、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
    方法。
40. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者の治療において使用する樹状細胞製剤を生産する方法であって、
    該方法は、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法により樹状細胞製剤を生産するものであり、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
    方法。
41. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者の治療において使用する再生医療等製品を生産する方法であって、
    該方法は、請求項３８に記載の方法により再生医療等製品を生産するものであり、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための該再生医療等製品を取得するために、アフェレーシスを受ける患者である、
    方法。
42. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法をコンピュータに実行させるプログラムであって、該方法は、
    １）該患者から血液試料を得る工程と
    ２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
    ３）６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
    を含み、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者であり、
    該所定値が３０～５０である、
    プログラム。
43. 前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、請求項４２に記載のプログラム。
44. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］より高い値に設定される、請求項４３に記載のプログラム。
45. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］＋１０～３０に設定される、請求項４３または４４に記載のプログラム。
46. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より１０～３０高く設定される、請求項４３～４５のいずれか一項に記載のプログラム。
47. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より２０～３０高く設定される、請求項４６に記載のプログラム。
48. 前記採取プレファレンスは４０～８０に設定される、請求項４３～４７のいずれか一項に記載のプログラム。
49. 前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、請求項４２～４８のいずれか1項に記載のプログラム。
50. 前記リンパ球を取り出す工程を、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、請求項４９に記載のプログラム。
51. 前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、請求項５０に記載のプログラム。
52. 前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、請求項４９～５１のいずれか1項に記載のプログラム。
53. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療する方法をコンピュータに実行させるプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は、
    １）該患者から血液試料を得る工程と
    ２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する工程と、
    ３）６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る工程と
    を含み、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者であり、
    該所定値が３０～５０である、
    記録媒体。
54. 前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、請求項５３に記載の記録媒体。
55. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］より高い値に設定される、請求項５４に記載の記録媒体。
56. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］＋１０～３０に設定される、請求項５４または５５に記載の記録媒体。
57. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より１０～３０高く設定される、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の記録媒体。
58. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より２０～３０高く設定される、請求項５７に記載の記録媒体。
59. 前記採取プレファレンスは４０～８０に設定される、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の記録媒体。
60. 前記血液試料を得る工程は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む、請求項５３～５９のいずれか1項に記載の記録媒体。
61. 前記リンパ球を取り出す工程を、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、請求項６０に記載の記録媒体。
62. 前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、請求項６０に記載の記録媒体。
63. 前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、請求項６０～６２のいずれか1項に記載の記録媒体。
64. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者を治療するためのシステムであって、
    １）該患者から血液試料を得る試料取得部と
    ２）該血液試料おいて、血球濃度を測定する測定部と、
    ３）６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る同等試料取得部と
    を含み、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者であり、
    該所定値が３０～５０である、
    システム。
65. 前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、請求項６４に記載のシステム。
66. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］より高い値に設定される、請求項６５に記載のシステム。
67. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］＋１０～３０に設定される、請求項６５または６６に記載のシステム。
68. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より１０～３０高く設定される、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のシステム。
69. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より２０～３０高く設定される、請求項６８に記載のシステム。
70. 前記採取プレファレンスは４０～８０に設定される、請求項６５～６９のいずれか一項に記載のシステム。
71. 前記血液試料を得る試料取得部は、単球を取り出す手段と、リンパ球を取り出す手段とを含む、請求項６５～７０のいずれか1項に記載のシステム。
72. 前記リンパ球を取り出す手段が、単球を取り出す工程に引き続きリンパ球の取り出しを実施する場合、少なくとも20分以上リンパ球を取り出す工程を実施するように構成される、請求項７１に記載のシステム。
73. 前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上リンパ球を取り出す工程を実施するように構成される、請求項７２に記載のシステム。
74. 前記リンパ球を取り出す手段は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定してリンパ球を取り出す工程を実施するように構成される、請求項７１～７３のいずれか1項に記載のシステム。
75. 成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者の治療において使用される血液試料を調製するシステムの作動方法であって、該システムは、
    １）該患者から血液試料を得る試料取得部と
    ２）該血液試料において、血球濃度を測定する測定部と、
    ３）６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値より低い場合、該患者から血球濃度が所定値と同等の血液試料を得る同等試料取得部と
    を含み、
    該方法は、
    １）該患者から得られた血液試料において、血球濃度を測定する工程と、
    ２）該血球濃度が所定値より低い場合、該患者から６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／μl）］の値が所定値と同等の血液試料を得るように、システムを作動する工程と
    を含み、
    該患者は、該ＡＴＬを治療するための樹状細胞製剤を取得するために、アフェレーシスを受ける患者であり、
    該所定値が３０～５０である、
    方法。
76. 前記血球濃度は採取プレファレンスを参照して調整される、請求項７５に記載の方法。
77. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］より高い値に設定される、請求項７６に記載の方法。
78. 前記採取プレファレンスは、
    ６０－［（０．２×白血球数（１０００／μl））＋（０．０８×血小板数（１０００／
    μl）］＋１０～３０に設定される、請求項７６または７７に記載の方法。
79. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より１０～３０高く設定される、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記採取プレファレンスは、前記所定値より２０～３０高く設定される、請求項７９に記載の方法。
81. 前記採取プレファレンスは４０～８０に設定される、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記血液試料は、単球を取り出す工程と、リンパ球を取り出す工程とを含む工程により得られたものであることを特徴とする、請求項７５～８１のいずれか1項に記載の方法。
83. 前記リンパ球を取り出す工程を、単球を取り出す工程に引き続き実施する場合、少なくとも20分以上実施される、請求項８２に記載の方法。
84. 前記リンパ球を取り出す工程は、30分以上実施される、請求項８３に記載の方法。
85. 前記リンパ球を取り出す工程は、前記採取プレファレンスを３０～５０に設定して実施される、請求項８２～８４のいずれか1項に記載の方法。
    

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