CN101603030B - 一种体外扩增调节性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种扩增细胞的方法，尤其是一种体外扩增调节性T细胞的方法，属于生物医学技术领域。本发明采用Rapamycin联合TGF-β在体外诱导人的T细胞成为具有免疫抑制功能的调节性T细胞，具有以下优点：1)数量充分；2)能抵抗向Th17细胞分化。克服了自然的调节性T细胞的诸多缺陷，在炎症性疾病的治疗，自身免疫性疾病治疗和器官移植的免疫排斥的预防方面有更大的治疗优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种扩增细胞的方法，尤其是一种体外扩增调节性T细胞的方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
近半个世纪以来，免疫抑制药物显著延长同种异体移植物存活时间的同时，也由于自身的毒副作用、昂贵的价格及药物诱导的非特异性免疫抑制所引发的临床并发症等一系列严重问题，极大限制了临床器官移植的进一步发展。通过诱导移植物特异性免疫耐受或达到类似应用免疫抑制剂的“临床几乎耐受”状态，从而减少甚至不用免疫抑制剂，成为移植免疫学研究领域的基本课题之一。虽然许多研究者已在不同动物中成功地诱导了同种异体移植的免疫耐受状态，但由于目前尚不清楚的原因，至今尚未找到一种有效方法，能够在临床前期的大动物模型中重复这些实验成果，更谈不上应用于临床。因此发展有效诱导针对供体特异性免疫耐受的治疗策略已成为实验和临床研究的主要方向，其特点不仅仅是延长移植物的存活率，同时应最大限度消除免疫抑制剂非特异性广泛抑制的缺点[1]。国内外学者一直在寻求可以替代免疫抑制药物的途径[2-4]。如：(1)阻断共刺激通路：虽然在移植动物模型中，通过阻断协同刺激通路使同种移植物存活时间明显延长，但该方法并不能达到持续稳定的耐受。(2)非成熟的异体树突状细胞(DC)：目前体外诱导产生的非成熟的DC在某些情况下诱导体内外抗原特异性T细胞无反应，体内输注能明显延长同种异体移植物的存活，但只能获得短期的耐受。(3)混合性嵌合：大量实验研究进展说明，混合性嵌合诱导免疫耐 受已经非常接近于临床应用，但一个关键的问题就是供者细胞输注，会诱发移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。上述措施并未达到令人满意的效果。同时又有研究表明上述途径诱导免疫耐受的机制与继发性诱导CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)有关。
1995年Sakaguchi等研究发现小鼠被祛除CD4+CD25+调节性T细胞会引发多种自身免疫性疾病，而将这些调节性T细胞回输则可抑制疾病的发生[5]。在正常人和小鼠的外周血及淋巴组织中的CD4+T细胞中约有5％～10％的细胞持续高表达CD25分子(IL-2受体α链)，同时这一亚群细胞是CD45RB分子低表达的。调节性T细胞亚群由胸腺或由外周活化的细胞发展而来，其T细胞受体(TCR)的表达不同于常规T细胞，与常规CD4+T细胞一起在外周与特异性抗原发生反应。胸腺产生的CD4+CD25+调节性T细胞进入外周后需要外周自身抗原的刺激等多种因素的影响才能成为功能性调节性T细胞。胸腺上皮细胞对CD4+CD25+调节性T细胞的分化可能起着主要作用，抗原提呈细胞(APCs)特别是树突状细胞(DCs)的成熟或活化对CD4+CD25+调节性T细胞的功能发挥调节作用[6]。其中，转录因子Foxp3是该调节性T细胞的特征性标记，是调节性T细胞发育和功能的特异性转录因子，CD28及其信号通路，IL-2和IL-2受体信号途径等均是其生存所必须的信号分子。转导Foxp3基因到CD4+和CD8+细胞均能使它们转变为调节性T细胞[7，8]。CD4+CD25+调节性T细胞已证实具有控制I型糖尿病和预防造血干细胞的急性GVHD[9，10]。在同种异体器官移植中已证明了它潜在的对移植物的保护作用[11，12]。但是，目前有关调节性T细胞的应用仍受到以下条件的限制[13-17]：1)自然产生的调节性T细胞(天然Treg)数量少。天然Treg在动物体内约占胸腺和外周血CD4+的5％～10％，而在正常人体中仅仅1-2％的CD25bright细胞具有免 疫抑制功能。因此，缺乏足够数量的Treg制约着临床的应用的可行性；2)扩增后表型和抑制功能可能发生改变。虽然通过体外扩增有可能克服细胞数量的问题，但是，最近有报道显示，体外多轮扩增的Treg失去了免疫抑制能力，并且多克隆扩增的Treg并不能对人造血干细胞移植后的GVHD产生防治作用，同时也发现Treg在一定条件下可向效应T细胞转化；3)自然Treg一旦被抗CD3单抗或PHA等广泛激活，其介导的抑制功能没有抗原特异性，即它们既可抑制具有相同抗原特异性的T细胞，也可抑制对其他抗原特异性的T细胞；4)在致炎因子IL-6等的诱导下，天然Treg细胞能够转化成为Th17细胞。Th17细胞是一类产生IL-17A和IL-17F的Th细胞亚群。IL-17属于促炎因子，与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关。此外，Th17细胞也与移植的排斥反应有密切关系。目前研究已证实TGF-β和IL-6联合使用能使活化的原始CD4+T细胞分化为Th17，由于Treg细胞表达或者产生TGF-β，在存在高水平的IL-6的情况下，天然的Treg细胞本身能够转化成为Th17细胞。这样，在炎症和移植排斥的环境下，因为伴有高水平的IL-6，使用天然的Treg细胞实际上有一定恶化疾病的风险。除了天然Treg外，胸腺外诱导产生的CD4+CD25+调节性T细胞(iTreg)对免疫平衡和自稳也起了重要的作用。目前iTreg中以TGF-β诱导的调节性T细胞最受重视，但是体外诱导的人的Foxp+T细胞具有调节细胞的表型，缺乏免疫抑制功能[18]。
发明内容
本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种体外扩增调节性T细胞的方法，利用该方法产生的调节性T细胞不仅数量多且稳定不易转化，可作为良好的免疫抑制剂使用。
本发明采用雷帕霉素(Rapamycin)联合TGF-β在体外诱导人的T细胞，使之成为具有免疫抑制功能的调节性T细胞，其作用机制是通过Rapamycin联合TGF-β激活T细胞受体(TCR)的信号通路，达到增加Foxp3的转录。Foxp3是调节性T细胞现有的标记，所以Rapamycin联合TGF-β通过增加Foxp3的表达，促进调节T细胞的生成。
为了解决以上技术问题，本发明的方法包括以下步骤：
第一步、采集：采用肝素抗凝常规采血手段采集血液；
第二步、分离：从采集到的血液中离心分离出外周血淋巴细胞，再由外周血淋巴细胞分离得到原始CD4+T细胞；
第三步、培养：将原始CD4+T细胞置于培养基中，在37℃±5℃、5％±1％CO2的条件下，培养7-10天；
第四步、诱导：对培养后的原始CD4+T细胞进行刺激，并加入诱导剂培养原始CD4+T细胞，直至细胞密度扩增至初始培养浓度的10倍，停止诱导，即得调节性T细胞；
第五步、扩增：由调节性T细胞中分选出CD4+CD27+T细胞，移入含有10ng/mL anti-humanCD3的细胞培养板中，加入扩增剂持续刺激，培养至细胞扩增达到10倍，收集细胞，向其中每106个细胞加入1μl的anti-hCD4-PE抗体和每106个细胞加入1μl的anti-hCD27-FITC抗体，再分选得到扩增后的CD4+CD27+调节性T细胞。
其中：
所述步骤三中培养基由完全RPMI-1640培养基中添加青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、2mM左旋谷氨酸、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和50μM二羟基乙醇配制而成。所述步骤四中，刺激的方式为T细胞表面受体刺激，通 过anti-human-CD3CD28磁珠进行T细胞表面受体刺激，磁珠与T细胞比例为1∶10；所述诱导剂包括100IU/mL的rhIL-2、5ng/ml的rhTGF-β和10nM的Rapamycin，其中rhIL-2加入后最终浓度为100IU/mL，rhTGF-β加入后最终浓度为5ng/mL，Rapamycin加入后最终浓度为10nM。
所述步骤五中，扩增剂由20IU/ml的rhIL-2、10nM的Rapamycin和1ng/ml的anti-human CD28配制而成；其中，rhIL-2加入后最终浓度为20IU/mL，anti-human CD28加入后最终浓度为1ng/ml，Rapamycin加入后最终浓度为10nM。所述扩增剂还可以是辐照后的异体树突状细胞，该异体树突状细胞在辐照前与抗原肽混合培养3-5小时。在细胞培养期间，每三天将原有的细胞分为两个孔，同时向每个培养孔中加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基至总体积为1毫升。扩增后的细胞在没有任何刺激的环境下休整48小时。
本发明采用Rapamycin(RAPA)联合TGF-β在体外诱导人的调节性T细胞成为具有免疫抑制功能的调节性T细胞，具有以下优点：1)数量充分，并可根据需要扩增到治疗数量；2)所得的调节性T细胞可以抵抗向Th17细胞分化，克服了自然的调节性T细胞的诸多缺陷。在炎症性疾病的治疗，自身免疫性疾病治疗和预防器官移植的免疫排斥方面有更大的临床应用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为对照组T细胞与调节性T细胞诱导过程中Foxp3+细胞比例的变化曲线对比图；
图2为调节性T细胞对T细胞的抑制效果图；
图3为在含有RAPA的培养条件下，调节性T细胞的Foxp3的表达图；
图4为RAPA联合TGF-β促进诱导细胞的效果图，其中图4a为RAPA联合TGF-β促进诱导细胞数量增加示意图，图4b为RAPA联合TGF-β增加调节性T细胞的Foxp3的达图；
图5为RAPA联合TGF-β诱导的调节性T细胞的表型图；
图6为RAPA联合TGF-β诱导后的调节性T细胞与天然调节性T细胞及用TGF-β单独诱导的调节性T细胞的对T细胞的抑制功能对比图；
图7为RAPA联合TGF-β诱导机制检测图；
图8为含RAPA诱导后调节性T细胞与天然调节性T细胞的繁殖对比图；
图9为异种移植物抗宿主病的病理学检测图；
图10为RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞抵御细胞凋亡的能力检测图；
图11为RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞在免疫抑制中的作用实验图。
图12为RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞比自然调节T细胞能抵抗向Th17分化的能力示意图。
具体实施方式
实施例一
材料：CD4+T细胞分离试剂盒(购自Miltenyi Biotec，USA)，anti-human CD3(BD Com.，USA)包被的培养板(购自VWR，USA)，系统免疫缺陷(SCID)小鼠(购自美国Jackson实验室)。
仪器：磁珠分离器(德国美天旎公司的Auto MACS)，流式细胞仪(BD公司，型号：Vantage SE)。
试剂：诱导剂：anti-CD3CD28-beads(与细胞之比为1∶10， Invitrogen)，rhIL-2(加入后最终浓度为100IU/mL)，rhTGF-β(加入后最终浓度为5ng/mL)购自美国BD公司和Rapamycin(加入后最终浓度为10nM)购自惠氏制药。扩增剂：rhIL-2(20IU/mL)，anti-humanCD28(1ng/ml)，Rapamycin(10nM，惠氏制药)；培养基由完全RPMI-1640培养基中添加100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM左旋谷氨酸，10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠(以上购于BioSource International公司)和50μM二羟基乙醇(购于Sigma-Aldrich公司)配制而成。
实验步骤如下：
1.1用RAPA联合TGF-β在体外扩增调节性T细胞
第一步、采集：采用肝素抗凝常规采血手段采集血液；
第二步、分离：向30ml人淋巴细胞分离液(购于上海欧韦达仪器科技有限公司)上缓慢加入采集的血液20ml，在4℃以1500-2000转/分离心25分钟。吸取离心后中间白色的细胞层得到静脉外周血的淋巴细胞(PBMC)，再将PBMC放入CD4+T细胞分离试剂盒用于去除CD8，CD14，CD16，CD19，CD36，CD56，CD123，TCRγ/δ，CD235a(glycophorin A)和CD45RO，再分离得到原始CD4+T细胞；
第三步、培养：将原始CD4+T细胞置于培养基中，加入诱导剂，在37℃、5％CO2条件下，进行培养；
第四步、诱导：在诱导期第三天向每个细胞培养孔中加入20μl的rhIL-2(1000IU/mL)。通过对培养的原始CD4+T细胞进行T细胞表面受体(TCR)刺激，通过anti-human-CD3CD28磁珠TCR刺激，磁珠与T细胞比例为1∶10，第五天进行细胞计数当细胞密度达到1.5×106/ml时进行分孔培养。第七天，收集细胞，利用磁珠分离器移去anti-CD3CD28-beads，停止细胞TCR刺激后用1×PBS洗3遍。将上述细胞在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中休息48小时，在完全RPMI 1640培养基中加入40μl的rhIL-2(1000IU/mL)一次，收集上述细胞，即为调节性T细胞。收集上述细胞培养后的第1天至第7天的细胞进行细胞内染色检测Foxp3的表达变化并与对照组T细胞对比，结果见图1。
第五步、扩增：将休整48小时后的调节性T细胞由BD流式细胞仪阳性分选出CD4+CD27+T细胞亚群。将上述细胞亚群移入经最终浓度为10ng/mL anti-human CD3包被的48孔平地培养板中，同时向其中加入40μl的rhIL-2(1000IU/mL)，10μl的RAPA(1000nM)，和10μl的anti-human CD28(100ng/mL)。上述刺激因素与细胞持续刺激3天后，在培养板中加入rhIL-2(20IU/mL)，再培养4-5天。用流式细胞仪分选出CD4+CD27+T细胞，在只含有rhIL-2(20IU/mL)的条件下休息48小时。收集上述细胞在体外分析其抑制功能并可以用于体内治疗的研究。将分选得到的CD4+CD27+T细胞(1.5×105)与来自同一抗原或第三方的效应T细胞按照不同比例(1.5×105，7.5×104，3.5×104)在96孔培养板，37℃，5％CO2中进行混合淋巴细胞培养。在收集细胞前12小时向其中加入[3H]-thymidine分析细胞增殖情况，见图2。可根据需要扩增的细胞数量延长或缩短扩增周期。
1.2RAPA联合TGF-β在体外扩增的调节性T细胞的分析鉴定
1.2.1将CFSE标记的T细胞与辐照后的同种异体非T细胞共同培养后，RAPA能明显抑制Foxp3-T细胞亚群的增生并加速其凋亡，同时能促进Foxp3+亚群的增生，见图3。由于TGF-β已被证实能够在体外诱导Naive T细胞成为调节性T细胞，通过实验证明RAPA本身也能诱导调节性T细胞的产生，并能够明显增加TGF-β诱导调节性T细胞的能力，见图4a；只有RAPA联合TGF-β诱导后的这群CD4+ T细胞，能表达57.63％的Foxp3阳性细胞，见图4b。CD103，HLA-DR和CTLA-4等调节性T细胞的标记，由图5可见：在最右侧RAPA联合TGF-β诱导的调节性T细胞一组，CD103，HLA-DR和CTLA-4的表达分别为98％，85％和85％，明显高于培养基组(MED)和TGF-β诱导组的T细胞。结论：RAPA能促使增生的同种异体T细胞的凋亡，同时能诱导Naive T细胞成为Foxp3+T细胞。
1.2.2RAPA联合TGF-β能明显增加体外诱导的调节性T细胞的免疫抑制功能。RAPA联合TGF-β诱导的调节性T细胞，TGF-β单独诱导产生的调节性T细胞，自然调节性T细胞三者按照与CFSE荧光标记的T细胞的比例为1∶5，1∶10或1∶20的比例进行培养，结果如图6所示，Treg-RAPA诱导的调节性T细胞在高浓度时具有与nTreg细胞相似的一致T细胞增殖的能力，在1∶20时，仅Treg-RAPA能抑制T细胞的增殖。结论：RAPA联合TGF-β诱导的调节T细胞比TGF-β单独诱导产生的调节T细胞或者自然调节性T细胞具有更强的免疫调节能力。
1.2.3RAPA联合TGF-B诱导调节性T细胞产生的机制。
通过BD流式细胞仪检测在含有RAPA，TGF-β，RAPR+TGF-β培养条件下的三组细胞，在TGF-β型号通路中Smad2/3的表达，由图7可见RAPA并未能增加TGF-β信号，RAPA增加Foxp3+T细胞并非通过TGF-β信号机制来实现的。所以RAPA联合TGF-β诱导调节性T细胞产生的并非通过增强TGF-β信号通路来实现的。
1.2.4将上述含RAPA诱导后的调节性T细胞、TGF-β单独诱导的调节性T细胞或者经流式分选后的自然调节性T细胞进行CFSE荧光标记后，在anti-human CD3CD28-beads的刺激下，三天后用流式细胞仪检测细胞增殖情况。如图8所示，含RAPA诱导的调节性T细 胞和自然调节性T细胞在antiCD3CD28的刺激下自身是不增殖的。结论：RAPA能同时扩增自然调节性T细胞和经诱导后产生的调节性T细胞，同时扩增后的调节性T细胞自身并不增殖。
1.2.5将RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞单独，或者联合同种异体的荧光燃料CFSE标记的T细胞一起经尾静脉注入SCID小鼠体内，RAPA扩增后的调节性T细胞自身并不致病，同时能够抑制效应T细胞的增殖延缓或者预防GVHD的发生，如图9所示，对照组肝脏出现明显的肝硬化小叶，而调节性T细胞组肝脏表现正常。在肾脏，对照组比调节性T细胞组出现明显的肾小管坏死和炎症。对照组肺部出现明显的纤维化。可见RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞相对于其它体外诱导的调节性T细胞，具有更强的体内抑制功能，且无毒副作用。
1.2.6将RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞，以低浓度的IL-2在体外维持7天后，相对于TGF-β或Azac体外扩增后的调节性T细胞更能抵抗凋亡的发生，如图10所示，右上象限代表激活的凋亡细胞，通过比较可见TGF-β联合RAPA比只有TGF-β单独更能抵制凋亡的发生。另外，将RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞转染GFP绿色荧光蛋白后打入SCID小鼠体内，剂量为10×106/mL，该群细胞能在小鼠体内存活达30天以上。由此可见，RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞能抵制凋亡的发生，体内存活时间长。
1.2.7RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞能明显保护移植器官免于排斥反应：在小鼠心脏移植模型(每组6只)中，移植前一天，移植当天和移植后第3天分别注射RAPA联合TGF-B诱导或者TGF-β单独诱导的调节性T细胞。RAPA联合TGF-B诱导的调节性T细胞能明显保护移植心脏免于排斥，如图11所示Treg-RAPA代表 RAPA联合TGF-β诱导的调节性T细胞治疗组；Treg-TGF-β代表TGF-β诱导的调节性T细胞治疗组；对照组(control)为未经过任何治疗的组，小鼠都在两周内死亡，Treg-RAPA组比Treg-TGF-β具有明显的治疗效果，80％以上的小鼠能存活100天以上。
1.2.8RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞比自然调节T细胞能抵抗向Th17分化的能力。图12所示，采用Foxp3基因整合GFP的小鼠(购于美国Jackson实验室)，RAPA联合TGF-B诱导的调节T细胞在Th17诱导的环境下(诱导剂为经过辐照的非T细胞，anti-IFN-γ(10ng/mL)，anti-IL-4(10ng/mL)，soluble的AntiCD3(5ng/mL)和AntiCD8(10ng/mL))，表达极少量的IL-17和IFN-γ。而天然调节T细胞在Th17诱导的环境下部向Th17细胞分化。
1.3临床应用举例
以健康志愿者为例，用RAPA联合TGF-β体外扩增调节性T细胞进行有无毒副作用检测的实验：5个健康的志愿者，采集外周静脉血按照1.1方法制备后，按照体表面积计算20×106/M2每月注射一次。观察细胞体内存活周期和毒副作用。注射后的调节性T细胞在体内能存活30天-50天，本身未引起发热，过敏等不良反应。
由以上实验得出本发明的优点如下：
(1)经RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞具有明显的抑制T细胞的增生；
(2)RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞本身没有明显的毒副作用，具有体内长期的保护作用能力。
(3)RAPA联合TGF-β扩增后的调节性T细胞可以代替免疫抑制剂或者减少免疫抑制剂的使用剂量，用于器官移植后期免疫维持治疗，同时可以用于自身免疫性疾病患者或I型糖尿病的治疗，这将是器 官移植免疫治疗史上里程碑性的突破。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
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Claims (3)
1.一种体外扩增调节性T细胞的方法，包括以下步骤：
第一步、采用：采用肝素抗凝常规采血手段采集的血液；
第二步、分离：从采用的血液中离心分离出外周血淋巴细胞，再由外周血淋巴细胞分离得到原始CD4+T细胞；
第三步、培养：将原始CD4+T细胞置于培养基中，在37℃±5℃、5％±1％CO2的条件下，培养7-10天；所述培养基由完全RPMI-1640培养基中添加青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、2mM左旋谷氨酸、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和50μM二羟基乙醇配制而成；
第四步、诱导：对培养后的原始CD4+T细胞进行刺激，并加入诱导剂培养原始CD4+T细胞，直至细胞密度扩增至初始培养浓度的10倍，停止诱导，即得调节性T细胞；刺激的方式为T细胞表面受体刺激，通过anti-human-CD3CD28磁珠进行T细胞表面受体刺激，磁珠与T细胞比例为1∶10；所述诱导剂包括100IU/mL的rhIL-2、5ng/ml的rhTGF-β和10nM的Rapamycin，其中rhIL-2加入后最终浓度为100IU/mL，rhTGF-β加入后最终浓度为5ng/mL，Rapamycin加入后最终浓度为10nM；
第五步、扩增：由调节性T细胞中分选出CD4+CD27+T细胞，移入含有10ng/mL anti-humanCD3的细胞培养板中，加入扩增剂持续刺激，培养至细胞扩增达到10倍，收集细胞，向其中每106个细胞加入1μl的anti-hCD4-PE抗体和每106个细胞加入1μl的anti-hCD27-FITC抗体，再分选得到扩增后的CD4+CD27+调节性T细胞；所述扩增剂为下列二者之一：
(A)所述扩增剂由20IU/ml的rhIL-2、10nM的Rapamycin和1ng/ml的anti-human CD28配制而成；其中，rhIL-2加入后最终浓度为20IU/mL，anti-human CD28加入后最终浓度为1ng/ml，Rapamycin加入后最终浓度为10hM；或者，
(B)所述扩增剂为辐照后的异体树突状细胞，所述异体树突状细胞在辐照前与抗原肽混合培养3-5小时。
2.根据权利要求1所述体外扩增调节性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤五中，在细胞培养期间，每三天将原有的细胞分为两个孔，同时向每个培养孔中加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基至总体积为1毫升。
3.根据权利要求1所述体外扩增调节性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤五中扩增后的细胞在没有任何刺激的环境下休整48小时。
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