CN107519202A - 一种调节性t细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

一种调节性t细胞的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107519202A
CN107519202A CN201710905472.5A CN201710905472A CN107519202A CN 107519202 A CN107519202 A CN 107519202A CN 201710905472 A CN201710905472 A CN 201710905472A CN 107519202 A CN107519202 A CN 107519202A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
kidney
regulatory
transplanted kidney
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710905472.5A
Other languages
English (en)
Inventor
孙启全
郑颂国
廖涛
薛有求
赵大强
李思雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Original Assignee
Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University filed Critical Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Publication of CN107519202A publication Critical patent/CN107519202A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种调节性T细胞的制备方法及其应用，属于分子生物和生物医药领域。本发明调节性T细胞的制备方法包括以下步骤：通过TGF‑β体外诱导制得调节性T细胞。本发明还提供了TGF‑β体外诱导产生的调节性T细胞在制备(a)防治抗体介导的移植肾排斥和损伤，或者(b)改善移植肾存活的药物中的应用。本发明将TGF‑β体外诱导产生的调节性T细胞用于小鼠抗体介导的急性移植肾排斥模型，证明了该调节性T细胞能防治抗体介导的移植肾排斥和损伤、改善移植肾存活及减少炎症细胞浸润。

Description

一种调节性T细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物和生物医药领域，具体涉及一种调节性T细胞的制备方法及其应用。
背景技术
肾移植是目前治疗终末期肾病的首选方法(R.A.Wolfe,V.B.Ashby,E.L.Milfordet al.Comparison of mortality in all patients on dialysis,patientson dialysis awaiting transplantation,and recipients of a first cadaverictransplant.N Engl J Med，1999，341(23)：1725-1730)。新型免疫抑制剂的出现明显降低了T细胞介导的移植肾排斥，但是抗体介导的排斥(AMR)发生率仍然高居不下而且已经证实为移植肾失功的首要原因(A.Djamali,D.B.Kaufman,T.M.Elliset al.Diagnosis andmanagement of antibody-mediated rejection:current status and novelapproaches.Am J Transplant，2014，14(2)：255-271；C.Gosset,C.Lefaucheur,D.Glotz.New insights in antibody-mediated rejection.Curr Opin NephrolHypertens，2014，23(6)：597-604；J.Sellarés,D.G.de Freitas,M.Mengeletal.Understanding the Causes of Kidney Transplant Failure:The Dominant Role ofAntibody-Mediated Rejection and Nonadherence.American Journal ofTransplantation，2012，12(2)：388-399)。在移植肾受者中，30-50％的急性排斥和超过60％的晚期移植肾功能丧失与抗体有关(C.Gosset,C.Lefaucheur,D.Glotz.New insightsin antibody-mediated rejection.Curr Opin Nephrol Hypertens，2014，23(6)：597-604；J.Sellarés,D.G.de Freitas,M.Mengelet al.Understanding the Causes ofKidney Transplant Failure:The Dominant Role of Antibody-Mediated Rejectionand Nonadherence.American Journal of Transplantation，2012，12(2)：388-399；C.Lefaucheur,A.Loupy,D.Vernereyet al.Antibody-mediated vascular rejection ofkidney allografts:a population-based study.Lancet，2013，381(9863)：313-319)。目前普遍认为，AMR是由受体B细胞分泌的抗供体特异性抗体(DSA)所致。DSA与移植肾血管内皮细胞表面抗原结合后，通过经典途径激活补体，形成膜攻击复合物损伤移植肾。另外，C3a、C5a等趋化因子招募巨噬细胞、T细胞、NK细胞等炎症细胞浸润，损伤移植肾(WM RdBaldwin,A.Valujskikh,R.L.Fairchild.Mechanisms of antibody-mediated acute andchronic rejection of kidney allografts.Curr Opin Organ Transplant，2016，21(1)：7-14)。因此目前防治AMR的策略主要是去除DSA及阻断DSA引发的补体激活效应，包括血浆置换、免疫吸附、清除B细胞及浆细胞、阻断补体末端通路等(P.S.Macklin,P.J.Morris,S.R.Knight.A systematic review of the use of rituximab for desensitization inrenal transplantation.Transplantation，2014，98(8)：794-805；T.Abe,D.Ishii,V.Gorbachevaet al.Anti-huCD20antibody therapy for antibody-mediated rejectionof renal allografts in a mouse model.Am J Transplant，2015，15(5)：1192-1204；M.Wahrmann,M.Haidinger,G.F.Kormocziet al.Effect of the proteasome inhibitorbortezomib on humoral immunity in two presensitized renal transplantcandidates.Transplantation，2010，89(11)：1385-1390；J.A.Robinson,R.M.Radvany,M.G.Mullenet al.Plasmapheresis followed by intravenous immunoglobulin inpresensitized patients awaiting thoracic organ transplantation.Ther Apher，1997，1(2)：147-151)。然而目前临床治疗移植肾AMR的效果总体欠佳，急性AMR一旦发生，15-20％的受者将在1年内发生移植肾失功事件；无论能否通过目前的抗排斥治疗逆转，有超过40％的急性AMR患者将继续进展为慢性AMR，而一旦诊断慢性AMR，5年移植肾存活率往往低于50％(A.Djamali,D.B.Kaufman,T.M.Elliset al.Diagnosis and management ofantibody-mediated rejection:current status and novel approaches.Am JTransplant，2014，14(2)：255-271；Qiquan Sun,Yang Yang.Late and Chronic Antibody-Mediated Rejection:Main Barrier to Long Term Graft Survival.Clinical andDevelopmental Immunology，2013，2013：1-7；M.H.Levine,P.L.Abt.Treatment optionsand strategies for antibody mediated rejection after renaltransplantation.Semin Immunol，2012，24(2)：136-142)。因此，寻找AMR更有效的防治方法势在必行。
调节性T细胞(Treg)是最早被认识到具有免疫调节功能的细胞，特异性表达CD4、CD25和转录因子Foxp3(S.Sakaguchi,N.Sakaguchi,M.Asanoet al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes variousautoimmune diseases.J Immunol，1995，155(3)：1151-1164)。根据其来源的不同，可以分为自然调节性T细胞(nTreg)和适应性调节性T细胞(iTreg)(S.Z.Josefowicz,A.Rudensky.Control of regulatory T cell lineage commitment andmaintenance.Immunity，2009，30(5)：616-625；E.M.Shevach.From vanilla to28flavors:multiple varieties of T regulatory cells.Immunity，2006，25(2)：195-201)。Treg可以通过多种途径抑制免疫反应，包括直接抑制CD4+和CD8+T细胞活化和增值，抑制B细胞活化和抗体的产生以及调节巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和树突状细胞(DC)的功能(F.Issa,K.J.Wood.CD4+regulatory T cells in solid organtransplantation.Curr Opin Organ Transplant，2010，15(6)：757-764；D.A.Vignali,L.W.Collison,C.J.Workman.How regulatory T cells work.Nat Rev Immunol，2008，8(7)：523-532；Q.Lan,H.Fan,V.Quesniauxet al.Induced Foxp3(+)regulatory T cells:apotential new weapon to treat autoimmune and inflammatory diseases？J Mol CellBiol，2012，4(1)：22-28；K.Zhou,Q.Zhong,Y.C.Wanget al.Regulatory T cellsameliorate intracerebral hemorrhage-induced inflammatory injury by modulatingmicroglia/macrophage polarization through the IL-10/GSK3beta/PTEN axis.JCereb Blood Flow Metab，2017，37(3)：967-979；A.Xu,Y.Liu,W.Chenet al.TGF-beta-Induced Regulatory T Cells Directly Suppress B Cell Responses through aNoncytotoxic Mechanism.J Immunol，2016，196(9)：3631-3641)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种调节性T细胞的制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明提供了TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞在制备(a)防治抗体介导的移植肾排斥和损伤，或者(b)改善移植肾存活的药物中的应用。
本发明还提供了TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞在制备减少移植肾内炎症细胞浸润的药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述炎症细胞为(a)B细胞和浆细胞、(b)CD4+细胞和CD8+IFN-γ+细胞、(c)M1型巨噬细胞，或(d)NK细胞和树突状细胞。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述CD4+细胞包括Th1细胞，Th17细胞和Tfh细胞。
本申请发明人利用C3H→Balb/c小鼠在皮肤移植第4天后行肾移植建立移植肾急性AMR模型，在此模型的基础上，利用iTreg尾静脉注射观察其对AMR的防治效果并进行相应机制研究。研究表明：调节性T细胞可以明显减轻移植肾损伤，明显延长受体存活时间并且使得30％小鼠在观察期内长期存活，并可以降低DSA水平和减少移植肾内炎症细胞浸润。
本发明还提供了一种用于防治抗体介导的移植肾排斥/损伤、改善移植肾存活或减少移植肾内炎症细胞浸润的药物，所述药物包括TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞。
作为本发明所述药物的优选实施方式，所述药物还包括药用载体。可将TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞与适当的药用载体制成常见的药物类型，应用于防治抗体介导的移植肾排斥/损伤、改善移植肾存活或减少移植肾内炎症细胞浸润。选择适当的药用载体，可制成口服剂型，外用剂型，栓剂和无菌注射溶液等。药用载体可以是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇，赤藓醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，水，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁或矿物油等。
本发明还提供了一种调节性T细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：通过TGF-β体外诱导制得调节性T细胞。
作为本发明所述调节性T细胞的制备方法的优选实施方式，该方法包括以下步骤：向TGF-β中加入初始CD4+细胞、IL-2、抗CD3/CD28磁珠和完全培养液，体外诱导制得调节性T细胞。
作为本发明所述调节性T细胞的制备方法的优选实施方式，所述初始CD4+细胞的制备方法包括以下步骤：(1)将小鼠脾脏置于培养基中，研磨，吸取细胞悬液；(2)离心细胞悬液，弃上清后加入红细胞裂解液，重悬细胞，再进行裂解，然后加入所述培养基，混匀，终止裂解；(3)用所述培养基重悬并计数；(5)分选初始CD4+细胞。
作为本发明所述调节性T细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(5)采用一步阴选分选初始CD4+细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种调节性T细胞的制备方法及其应用。本发明建立的小鼠抗体介导的急性移植肾排斥模型符合国际诊断标准；TGF-β体外诱导产生的iTreg可以明显减轻急性AMR并且延长受体存活；iTreg减轻急性AMR的机制是通过降低DSA水平和减少移植肾内CD4+T细胞(包括Th1、Th17和Tfh)，CD8+IFN-γ+细胞，B细胞，浆细胞，M1型巨噬细胞，NK细胞和树突状细胞浸润。
附图说明
图1为实施例3中预致敏组和非致敏组生存曲线图；
图2为实施例3中在肾移植术后第5天获取血清标本，检测血清中DSA-IgG、IgM水平的结果图；
图3为实施例3中在肾移植术后第5天获取移植肾标本行组织学病理检测结果图；
图4为实施例4中iTreg组和对照组生存曲线图；
图5为实施例4中在肾移植术后第5天获取血清标本，检测血清中DSA-IgG、IgM水平的结果；
图6为实施例4中在肾移植术后第5天获取移植肾标本行组织学病理检测结果图；
图7为实施例4中凋亡细胞染色的TUNEL试验结果图；
图8为利用流式细胞技术检测B细胞和浆细胞表面特异性标志B220+和B220+CD138+的结果图；
图9为移植肾内CD4+(包括Th1、Th17和Tfh)浸润细胞检测的结果图；
图10为移植肾内CD8+和CD8+IFN-γ+浸润细胞检测的结果图；
图11为移植肾内巨噬细胞及其亚型的检测的结果图；
图12为移植肾内NK细胞和DC的检测结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，所采用的材料和方法如下。若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
1 实验材料
1.1 实验小鼠
本实验所使用供体和受体分别为成年雄性C3H(H-2k)和BALB/c(H-2d)小鼠，体重25-30g，均购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。所有小鼠均饲养于无特定病原体(SPF)级环境，所进行动物实验符合国家实验动物护理和使用指南以及中山大学实验动物伦理准则。
1.2 实验仪器和材料
1.3 实验试剂
2 实验方法
2.1 血清抗供体特异性抗体(DSA)的检测
取BALB/c受体小鼠血清2.5ul，与供体C3H小鼠脾脏细胞(约1×106个脾细胞重悬于100ul 1×PBS中)于37℃孵育30min。2ml 1×PBS洗涤细胞两次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体和RRX标记的山羊抗小鼠IgM抗体，4℃孵育1h，期间每间隔15min轻柔振荡细胞。2ml 1×PBS洗涤细胞两次，并用200ul1×PBS重悬细胞，立即上流式细胞仪检测IgG和IgM的平均荧光强度(MFI)，以此评估受体BALB/c小鼠循环DSA(IgG、IgM)水平。
2.2 移植肾病理、免疫组化和免疫荧光
2.2.1 HE和PAS染色
1)标本获取：在肾移植术后第5天获取移植肾标本，利用福尔马林固定后石蜡包埋，切取4um厚度石蜡切片。
2)脱蜡水化：石蜡切片60℃恒温箱中烘烤2h后，浸于二甲苯5min，3次或10min，2次；无水乙醇中5min，2次；95％、85％、75％乙醇中各5min；ddH2O冲洗3次，5min。
3)染色：脱蜡水化后的切片用苏木素-伊红(HE)和过碘酸雪夫氏染色(PAS)。光镜下观察移植肾病理形态。
2.2.2 免疫组化
1)标本切片获取和脱蜡水化同上述步骤
2)消除内源性过氧化物酶：将组织切片置于3％过氧化氢溶液中，10-15min，ddH2O清洗4次，每次3min。
3)抗原修复：切片浸没于柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，微波高火5min，中低火25min。自然冷却至室温，PBS洗涤4次，每次5min。
4)封闭：甩掉并擦干切片上组织周围液体，平放于湿盒中，滴加正常山羊血清封闭液室温孵育15min，甩去封闭液，不冲洗。
5)一抗：滴加山羊抗小鼠C3d抗体和生物素化的抗IgG抗体于组织上，4度过夜(第二天需37度复温45min)，PBS冲洗5min，4次。
6)二抗：擦去切片周围多余的液体，滴加二抗，37℃孵育30min，PBS洗涤4次，每次5min。
7)显色：滴加DAB工作液，显微镜下观察目标分子着色即用蒸馏水冲洗中止显色，蒸馏水/自来水冲洗5min。
8)复染：去除残留液体，苏木素复染1-2min，蒸馏水/自来水冲洗多余染液5min，2次。
9)脱水：75％、85％、95％、100％、100％梯度酒精脱水5min，二甲苯透明5min，2次。
10)封片：用中性树胶滴在组织上，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
2.2.3 免疫荧光
1)标本获取：在肾移植术后第5天获取移植肾标本，利用4％多聚甲醛固定后OTC包埋，切取6um厚度切片；
2)冰冻切片从－20℃取出，65℃烘烤30min，PBS洗3次，每次5min，以除去包埋剂等。滴加0.2％Triton X-100，室温孵育破膜10min，PBS洗5min。
3)用纸吸干玻片反面及组织周围水分，用IHC mark笔圈出样本。滴加山羊血清封闭液，室温孵育40min。甩掉封闭液，直接滴加加适当比例稀释的一抗，4℃过夜；
4)甩掉一抗，PBS洗涤2次，每次5min。滴加荧光素标记的二抗，37℃避光孵育30min。
5)PBS洗涤3次，每次5min。滴加DAPI(终浓度2ng/ml)，室温孵育10-15min。PBS洗涤3次，每次5min。滴加抗荧光淬灭封片剂，封片。
6)利用激光共聚焦拍照
2.3 转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)染色
1)烤片：55℃，30min；
2)脱蜡及复水：二甲苯10min×2，梯度酒精(100％/95％/80％/70％-5min)水化，ddH2O漂洗2min；
3)滴加20ug/ml不含DNase的蛋白酶K，37℃孵育30min，PBS漂洗5min×5；
4)在样品上加50ul TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，PBS漂洗5min×3；
5)用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
2.4 流式细胞检测
1)样本制备：在肾移植术后第5天，摘取整个移植肾标本，迅速浸入含1％胎牛血清的培养基中。取200目的尼龙膜覆盖在6cm培养皿表面，把移植肾组织转移至尼龙膜上，并用10ml注射器针芯将组织轻轻碾磨，使单个细胞穿透尼龙膜而进入培养皿。然后将细胞悬液吸取至50ml的离心管中，4℃、380g离心8min，弃掉上清。加入10ml PBS重悬细胞并进行细胞计数。
2)细胞荧光染色：分装细胞使每个流式管中细胞约为1×106个/100ul，加入荧光素标记的一抗(CD45、CD3、CD4、CD8a、B220、CD138、CD11b、F4/80、CD86、CD206、CD279、CD278、CD185、CD11c、I-A/I-E、CD49b、IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3)于4℃孵育30min。其中，检测胞内分子如IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3时，细胞需要加激活剂预处理5h，然后与抗细胞表面分子抗体于4℃孵育30min，PBS洗涤后固定破膜，最后再与抗胞内分子抗体于4℃孵育30min。上述所有孵育过程中，均需每隔15min即轻轻混匀细胞，以防细胞沉淀。与抗体孵育完毕后，加入2ml PBS，4℃、380g离心8min，重复2次。用200ulPBS重悬细胞后立即上流式仪检测。
2.5 半定量PCR
1)RNA提取：对于液氮中保存的移植肾组织，切取约半米粒大小的组织块，迅速用液氮研磨后加入一定比例的Trizol试剂(每50mg组织加入1ml Trizol)，剧烈振荡混匀裂解混合物，并室温静置15min。按裂解液：氯仿为:5：1的比例加入预冷氯仿，充分振荡混匀，待其分层后，4℃、12000g离心15min；吸取水相到新的EP管中并加入等体积异丙醇，充分混匀后室温静置10min，4℃、16000g离心30min；弃上清，用1ml 70％预冷乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次4℃，16000g离心15min，弃上清；室温干燥至乙醇挥发干净，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，于-80℃保存备用。
2)反转录：使用罗氏公司的MLV逆转录试剂盒、采用随机引物进行逆转录，具体操作按照说明书进行：取一PCR管，加入2μg RNA及1μl oligo(dT)18，并用RNase free的去离子水将体系补至12μl，充分轻轻混匀后置于PCR仪上70℃反应5min，将反应物迅速置于冰上。然后依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl反转录酶，并用移液器抽吸混匀。42℃反应60min，并80℃反应5min以灭活反转录酶。
3)半定量PCR：目标基因mRNA表达水平的检测则以cDNA为模板，用特异引物于480(Roche Diagnostics)实时定量PCR仪进行real-time PCR反应，以β-actin作为内源对照。每个样品均设计3个复孔，尽量将复孔间的PCR循环反应阈值(cyclethreshold，Ct)偏差控制在0.3以内。iNOS、GM-CSF和内参基因β-actin的引物序列如下所示：
β-actin：正义链5'-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3'反义链5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAA-3'
iNOS:正义链5'-CCGCCGCTCTAATACTTA-3'反义链5'-TTCATCAAGGAATTATACAGGAA-3'
GM-CSF:正义链5'-CAGTTGGAAGGCAGTATA-3'反义链5'-AAATAAATATAATGGTCCCTATCA-3'
2.6 统计学方法
统计学处理：采用SPSS 13.0软件分析数据，数据以均数±标准差表示，两组间的差异比较采用t检验，小鼠移植肾存活组间比较采取对数分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
下述实施例中，利用C3H→BALB/c小鼠在皮肤移植致敏后第4天行肾移植，建立小鼠抗体介导的急性移植肾排斥模型，C3H→BALB/c没有皮肤移植致敏直接行肾移植作为对照组。利用受体存活时间、血清抗供体特异性抗体(DSA)水平和组织学表现对模型进行判定。
下述实施例还研究了iTreg对移植肾急性AMR的防治效果：利用小鼠急性AMR模型，分成2组，分别通过尾静脉注射iTreg 3x106(0.2ml)和等量PBS 4次，注射时间点为皮肤移植前1天、皮肤移植当天、肾移植当天和肾移植后第3天。两组分别命名为iTreg组和Control组。观察并比较两组小鼠受体存活时间，比较两组受体移植肾损伤程度，炎症细胞浸润和肾小管坏死程度。
下述实施例还探讨iTreg防治急性AMR的具体作用机制：利用小鼠急性AMR模型，利用上述方案建立iTreg组和Control组，比较在肾移植术后排斥同一个时间点两组受体的血清DSA水平，移植肾内DSA和C3d沉积程度。利用流式细胞技术，检测比较两组受体移植肾内各种炎症细胞浸润程度。在此基础上，进一步利用免疫荧光、qPCR等试验技术进一步验证iTreg对移植肾内炎症细胞浸润的影响。
实施例1 初始CD4+细胞的分选以及iTreg的诱导(以一只5-8w BALB/c小鼠脾脏为例)
一、细胞准备
1)解剖小鼠脾脏，置于盛有70um滤网和2mL含10％FBS 1640的60mmdish。
2)用1mL注射器研磨脾脏，分别用含10％FBS的1640冲洗干净残留在注射器和滤膜上的细胞，吸取细胞悬液到15mL离心管。
3)300g，4℃，离心5min，弃上清，加1mL的红细胞裂解液，重悬细胞，室温静置裂解20-30s，加入5mL左右的含10％FBS的1640，混匀终止裂解。
4)用2mL含10％FBS的1640重悬并计数(通常5w B6得到140million SPcells)，置冰上。
二、一步阴选分选方法
1)用含10％NCS(或FBS)的1640重悬细胞至500ul，加入以下Anti-Biotin抗体：
轻柔混匀，4℃孵育15min
2)5ml 10％NCS(或FBS)的1640，300g，4℃，离心5min，弃液体，500ul Automacsbuffer重悬细胞。
3)加入15ul Anti-Biotin-Microbead，轻柔混匀，4℃孵育15min
4)5ml 10％NCS(或FBS)的1640，300g，4℃，离心5min，弃液体，500ul Automacsbuffer重悬细胞。
5)Automacs上机分选：选择deplet S模式
6)收集的阴性细胞，再标记上Biotin-CD62L，孵育15min，由Automacs分选出CD4+CD62L+细胞，即为CD4+细胞(大概3-5million，纯度>85～90％)
7)300g，4℃，离心5min，用2ml淋巴细胞培养液悬浮细胞，计数。
三、iTreg的诱导
四、iTreg的鉴定
加了刺激因子的iTreg，三天后，吹打收集所有孔的细胞到15ml离心管，用磁珠磁铁吸附掉beads，即得到iTreg，用于后续实验。取1个孔(0.3millionCD4,CD25,Foxp3染色鉴定)。
实施例2 小鼠抗体介导的急性移植肾排斥模型的建立和干预
采用异氟烷诱导及维持麻醉。手术在SPF级小动物手术室进行，供者和受者分别选取MHC不同的C3H(H-2k)和BALB/c(H-2d)小鼠。皮肤移植取供体尾巴皮肤移植于受体背部，大小约1x1cm。皮肤移植4天后进行肾移植，肾移植方法参照国际报道及我们改进的方法。动脉用12-0无损伤尼龙单丝线(宁波灵桥，宁波医用缝针有限公司)间断6针缝合，行供肾动脉带小段供体腹主动脉同受体腹主动脉端侧吻合。静脉用12-0尼龙线连续吻合，行供肾静脉同受体下腔静脉端侧吻合。尿路重建采用10-0尼龙线连续吻合，行供肾输尿管带供体膀胱瓣同受体膀胱顶全层连续吻合。手术全程动物置于36℃恒温手术台，在显微镜下采用标准显微操作技术。供肾采用含普通肝素75U/ml，0～4℃，0.5～1.0ml高渗枸橼酸盐嘌呤(HCA)移植肾脏灌注保存液进行灌注和移植前保存。术中切除受体自体双肾，移植肾置于受体右侧。术毕皮下补液0.5ml，无应用抗生素。小鼠术毕于恒温手术台至清醒后置于36℃恒温电热毯上饲养笼内保温，给予自由进食饮水，2h后转移入SPF级小鼠饲养室。iTreg治疗组在皮肤移植前1天、皮肤移植当天、肾移植当天、肾移植后第3天尾静脉注射iTreg 3x106个(0.2ml)，Control组注射等量PBS。
实施例3 利用皮肤移植预致敏建立抗体介导的急性移植肾排斥小鼠模型
该模型中，我们利用C3H小鼠为供体，BALB/c小鼠为受体，在皮肤移植预致敏后第4天行肾移植，作为预致敏组(presensitized)；不用皮肤移植预致敏作为非致敏组(nonpresensitized)。观察移植肾存活，检测特定时间点血清中DSA水平和组织学表现。)预致敏组和非致敏组生存曲线如图1所示(二者生存曲线比较，**p＜0.01，)；在肾移植术后第5天获取血清标本，检测血清中DSA-IgG、IgM水平的结果图如图2所示(预致敏组和非致敏组IgG水平差异有统计学意义(*p＜0.05)，而IgM无统计学差异(p＞0.05))；在肾移植术后第5天获取移植肾标本行组织学病理检测结果如图3所示。
如图1所示，预致敏组移植肾在术后很快发生排斥(6.2±1.8天)，而非致敏移植肾均长期存活。由图2可见，在肾移植术后第5天发生排斥的时候，预致敏组循环中DSA-IgG明显升高，而且升高程度明显高于非致敏组；而IgM无明显升高。进一步，组织学检查提示预致敏组病理表现完全符合急性AMR的诊断，包括：(1)间质毛细血管炎、血栓和水肿(图3-e)；(2)肾小管坏死(图3-f)；(3)移植肾内毛细血管C3d(图3-g)和IgG(图3-h)沉积。图3中，HE染色可见移植肾间质毛细血管炎，血栓和水肿(a,e)；PAS染色可见肾小管坏死(b,f)；抗C3d和IgG抗体检测可见移植肾内C3d(c,g)和IgG沉积(d,h)。预致敏组和非致敏组每组4个，展示图片为代表性图片(*p＜0.05)。
上述病理表现在预致敏组中都明显比非致敏组重。
实施例4 iTreg治疗减轻抗体介导的移植肾排斥和损伤以及改善移植肾存活
考虑到预致敏组严重的排斥反应，我们评估iTreg的免疫调节功能在这个模型中是否可以抑制排斥。根据上述方法建立小鼠AMR模型，利用iTreg给予防治组定义为iTreg组，等量PBS组为对照组。iTreg组和对照组生存曲线如图4所示(差异具有统计学意义，*p＜0.05)；在肾移植术后第5天获取血清标本，检测血清中DSA-IgG、IgM水平的结果如图5所示(iTreg组和对照组IgG水平差异有统计学意义(*p＜0.05)，而IgM差异无统计学意义(p＞0.05))；在肾移植术后第5天获取移植肾标本行组织学病理检测结果如图6所示；图6中，HE染色(a,e)，PAS染色(b,f)，抗C3d抗体(c,g)和抗IgG抗体(d,h)检测。iTreg组和对照组病理提示的间质毛细血管炎，肾小管坏死，C3d和IgG沉积差异均有统计学意义(*p＜0.05)。iTreg组和对照组每组3个，展示为代表性图片。
我们发现，预致敏组在给予iTreg防治后可以明显延长移植肾存活，使得高达30％的受体在14天观察期内长期存活(图4)。iTreg治疗组的受体循环内DSA-IgG明显低于对照组，IgM无明显变化(图5)。接下来，我们利用组织学检查评估发现iTreg治疗可以明显减少移植肾内炎症细胞浸润，肾小管坏死和C3d、IgG的沉积(图6)。
另外，我们利用凋亡细胞染色的TUNEL试验证实iTreg治疗组的细胞死亡程度明显轻于对照组，证实iTreg可以减轻移植肾的损伤，实验结果如图7所示。图7A表明iTreg组移植肾内细胞凋亡量明显少于对照组，图7B表明两组细胞凋亡程度差异具有统计学意义(**p＜0.01)。
实施例5 iTreg治疗减少移植肾内B细胞和浆细胞的浸润
我们利用流式细胞技术，在肾移植术后第5天获取整个移植肾标本检测里面B细胞和浆细胞的比例和数量。利用流式细胞技术检测B细胞和浆细胞表面特异性标志B220+和B220+CD138+的结果如图8所示。流式细胞点状图展示的为CD45+总细胞中B220+细胞(A)，总B220+细胞中CD138+细胞(D)。iTreg组B220+占CD45+比例(B)和CD138+占B220+比例(E)明显低于对照组，差异均有统计学意义(*p＜0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。iTreg组B220+细胞和B220+CD138+细胞数量低于对照组，差异均有统计学意义(**p＜0.01)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。
由图8我们发现，iTreg治疗组内B220+细胞占CD45+总细胞比例低于对照组(图8A-B)，而且B220+总细胞数量明显低于对照组(图8C)。然后我们检测了浆细胞，发现iTreg治疗组移植肾内浆细胞占B细胞的比例以及浆细胞的总细胞数量也明显低于对照组(图8D-F)。
实施例6 iTreg治疗减少移植肾内CD4+细胞(包括Th1，Th17和Tfh)和CD8+IFN-γ+细胞浸润
我们在肾移植术后第5天获取标本并利用流式细胞技术检测移植肾内T细胞的浸润情况。对于CD4+细胞，我们进一步检测了其亚型Th1(CD4+IFN-γ+)，Th2(CD4+IL-4+)，Th17(CD4+IL-17A+)和Tfh(CD4+CD278+PD-1+CXCR5+)在移植肾内的浸润情况。移植肾内CD4+(包括Th1、Th17和Tfh)浸润细胞检测的结果如图9所示；移植肾内CD8+和CD8+IFN-γ+浸润细胞检测的结果如图10所示。
图9中，流式细胞点状图展示的为CD45+总细胞中CD4+细胞(A)，总CD4+细胞中IFN-γ+细胞(D)，总CD4+细胞中IL-17A+细胞(G)，总CD4+CD278+PD-1+细胞中CXCR5+细胞(J)。iTreg和对照组移植肾内CD4+占CD3+细胞比例(B)(p＞0.05)，INF-γ+细胞占CD4+细胞比例(E)(p＞0.05)，IL-17A+细胞占总CD4+细胞比例(H)(***p＜0.001),CXCR5+细胞占CD4+CD278+PD-1+细胞(K)(*p＜0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。iTreg组和对照组移植肾中CD4+细胞数量(C)(*p＜0.05)，CD4+IFN-γ+细胞数量(F)(***p＜0.001)，CD4+IL-17A+细胞数量(I)(*p＜0.05),CD4+CD278+PD-1+CXCR5+细胞数量(L)(*p＜0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。由图9可见，iTreg治疗可以明显减少CD4+细胞在移植肾内的浸润数量，但是对CD4+细胞占CD3+细胞比例无明显变化(图9A-C)。为了进一步研究iTreg治疗对CD4+细胞亚型的变化，我们进一步检测了移植肾内Th1、Th2、Th17和Tfh的浸润情况。发现iTreg治疗可以减少Th1的细胞数量但是对其比例无明显影响(图9D-F)；移植肾内未检测到Th2浸润。另外，iTreg治疗可以明显减少Th17、Tfh的细胞数量和比例(图9G-L)。
图10是肾移植术后第5天获取整个移植肾标本，利用流式细胞技术检测iTreg组和对照组移植肾内CD8+细胞和CD8+IFN-γ+细胞。流式细胞点状图展示的为CD45+总细胞中CD8+细胞(A)，总CD8+细胞中IFN-γ+细胞(D)。iTreg和对照组移植肾内CD8+占CD3+细胞比例(B)(p＞0.05)，INF-γ+细胞占CD8+细胞比例(E)(*p＜0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。iTreg组和对照组移植肾中CD8+细胞数量(C)(p＞0.05)，CD8+IFN-γ+细胞数量(F)(*p＜0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。如图10所示，iTreg治疗对总CD8+细胞的数量和比例均无明显影响(图10A-C)。我们进一步检测效应性T细胞的浸润情况，发现iTreg治疗可以明显减少效应性T细胞的数量和比例(图10D-F)。
实施例7 iTreg治疗减少移植肾内M1型巨噬细胞的浸润，对M2型巨噬细胞无影响
巨噬细胞分为经典活化的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代活化的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)。目前普遍认为，在急性排斥中，巨噬细胞以M1型为主。为了探讨iTreg治疗在这个模型中对巨噬细胞的影响，我们在肾移植术后第5天获取整个移植肾标本，利用流式细胞技术检测巨噬细胞(F4/80+CD11b+)及其亚型M1型巨噬细胞(F4/80+CD86+)和M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)；利用免疫荧光检测移植肾内巨噬细胞(CD68+)和M1型巨噬细胞(CD68+MHC-II+)；利用qPCR技术检测M1型巨噬细胞特异性产物iNOS和GM-CSF的mRNA表达水平。移植肾内巨噬细胞及其亚型的检测的结果如图11所示。流式细胞点状图展示的为CD45+总细胞中F4/80+CD11b+细胞(A)，总F4/80+细胞中CD86+细胞(C)，总F4/80+细胞中CD206+细胞(E)。iTreg组和对照组移植肾中F4/80+CD11b+细胞数量(B)(*p＜0.05)，F4/80+CD86+细胞数量(D)(**p＜0.01)，F4/80+CD206+细胞数量(F)(p＞0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。(G)免疫荧光检测iTreg组和对照组中巨噬细胞和M1型巨噬细胞浸润，巨噬细胞由细胞核DAPI染色和CD68(红色)确定，M1型巨噬细胞由CD68(红色)和MHC-II(绿色)叠合而成的黄色确定。(H)iTreg组和对照组中M1型巨噬细胞表达产物iNOS和GM-CSF的mRNA水平(*p＜0.05)。
由图11可见，iTreg治疗可以明显减少巨噬细胞(F4/80+CD11b+)浸润数量但是对其所占CD45+总细胞比例无明显影响(图11A-B)。为了确定被减少的巨噬细胞的亚型，我们进一步检测了M1型(F4/80+CD86+)和M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)的浸润情况，发现iTreg治疗明显减少了M1型巨噬细胞的浸润(图11C-D)，而对M2型巨噬细胞的浸润数量无明显影响(图11E-F)。
另外，我们利用免疫荧光技术染巨噬细胞和M1型巨噬细胞表面的标记分子并利用激光共聚焦拍照和分析，证实该模型移植肾内大量巨噬细胞浸润而且以M1型巨噬细胞为主，iTreg治疗可以明显减少移植肾内巨噬细胞和M1型巨噬细胞的浸润。免疫荧光的发现与流式细胞的结果是一致的。我们进一步利用qPCR技术检测移植肾内M1型巨噬细胞的特异性mRNA：iNOS和GM-CSF，发现iTreg治疗可以明显减少其表达，进一步证实iTreg对M1型巨噬细胞的影响。
实施例8 iTreg治疗减少移植肾内NK细胞和树突状细胞的浸润
最近，天然炎症细胞特别是NK细胞在抗体介导的排斥中的作用越来越受到关注，为了探索在这个模型中iTreg治疗对NK细胞和DC的影响，我们在肾移植术后第5天获取整个移植肾标本，利用流式细胞技术检测NK细胞(DX5+CD3-)和DC(CD11c+I-A/I-E+)，考察NK细胞和DC的浸润情况。移植肾内NK细胞和DC的检测结果如图12所示。图12中，流式细胞点状图展示的为CD45+总细胞中DX5+CD3-细胞(A)，总CD11b+细胞中CD11c+I-A/I-E+细胞(D)。iTreg和对照组移植肾内DX5+CD3-占CD3+细胞比例(B)(*p＜0.05)，I-A/I-E+细胞占CD45+细胞比例(E)(p＞0.05)。数据为平均值±标准差，每组有4个样本。iTreg组和对照组移植肾中DX5+CD3-细胞数量(C)(*p＜0.05)，CD11c+I-A/I-E+细胞数量(F)(*p＜0.05)。数据为平均值±标准差，每组有5个样本。
由图12我们发现，iTreg治疗组移植肾内NK细胞的数量和其所占CD45+总细胞比例均明显低于对照组(图12A-C)；iTreg治疗组移植肾内DC的数量明显低于对照组，但是其比例无明显变化(图12D-F)。
在本发明中，我们在小鼠模型中证实了TGF-β体外诱导产生的iTreg对移植肾AMR具有独特的功效，它可以有效地减轻抗体介导的排斥和损伤、延长受体移植肾存活。我们进一步发现iTreg治疗可以减少移植肾内多种炎症细胞的浸润以及减少DSA水平。
我们利用MHC完全不相容的两种品系小鼠在皮肤移植预致敏后肾移植，建立急性AMR模型。进一步利用血清学和病理学证据判定该模型：血清DSA阳性，移植肾间质毛细血管炎，肾小管坏死，C3d和IgG沉积，符合国际诊断标准(M.Haas,B.Sis,L.C.Racusenetal.Banff 2013meeting report:inclusion of c4d-negative antibody-mediatedrejection and antibody-associated arterial lesions.Am J Transplant，2014，14(2)：272-283)。另外，我们全面检测了移植肾内浸润的炎症细胞的亚型并发现主要为巨噬细胞和T细胞，这与其他研究结论是一致的(A.B.Magil.Infiltrating cell types intransplant glomerulitis:relationship to peritubular capillary C4ddeposition.Am J Kidney Dis，2005，45(6)：1084-1089；T.Fahim,G.A.Bohmig,M.Exneretal.The cellular lesion of humoral rejection:predominant recruitment ofmonocytes to peritubular and glomerular capillaries.Am J Transplant，2007，7(2)：385-393)。我们在移植肾内也检测到B细胞、浆细胞、NK细胞和DC，提示这些细胞也参与了急性AMR的进展。
TUNEL试验证实iTreg治疗可以明显减轻移植肾损伤，病理表现也证实iTreg治疗可以减少炎症细胞浸润，肾小管坏死，C3d和IgG沉积。更重要的是，iTreg治疗意外地可以使得高达30％受体在没有其它免疫抑制剂的情况下长期存活。其它研究证实在急性AMR模型中，抗排斥使得受体长期存活往往需要多种药物联合使用(R.P.Rother,J.Arp,J.Jiangetal.C5Blockade with Conventional Immunosuppression Induces Long-Term GraftSurvival in Presensitized Recipients.American Journal of Transplantation，2008，8(6)：1129-1142)。
为了进一步研究iTreg防治急性AMR的机制，我们检测了血清DSA水平和移植肾内DSA沉积，发现iTreg治疗可以明显减少移植肾内DSA-IgG水平和移植肾内IgG和C3d的沉积。另外，我们全面检测了移植肾内各种炎症细胞的浸润情况。我们检测了移植肾内B细胞和浆细胞的浸润情况，虽然移植肾内的B细胞和浆细胞在急性AMR中的具体作用不是特别清楚，但是它们的浸润往往预示移植肾预后的不好。结果与期望相同，iTreg治疗可以明显减少移植肾内B细胞和浆细胞的浸润。在本发明中，我们发现iTreg治疗可以明显减少CD4+T细胞浸润，包括Th1、Th17和Tfh。CD4+T细胞在AMR的发生发展中起着关键作用。经过多次试验重复以及有阳性对照，我们没有检测到移植肾内Th2的表达，证实该模型移植肾内无Th2细胞浸润。另外，iTreg治疗没有减少总CD8+细胞的浸润，但是减少了效应性T细胞，提示iTreg可以抑制CD8+T细胞的活化。
在本发明中，我们检测到移植肾浸润的炎症细胞中巨噬细胞比例是最高的。进一步，我们证实了巨噬细胞中以M1型巨噬细胞为主，而不是M2型巨噬细胞。本研究中我们发现，iTreg治疗可以减少M1型巨噬细胞的浸润，这可能是其防治AMR的一条重要机制。除了巨噬细胞，其它的天然炎症细胞，比如NK细胞和DC在AMR中的作用也越来越受到关注。这个研究也证实了iTreg治疗可以减少急性AMR移植肾中NK细胞和DC的浸润，这可能也是其防治AMR机制中的一部分。
总的来说，本发明研究的结果第一次发现iTreg可以通过降低DSA和减少移植肾内B细胞，浆细胞，CD4+T细胞(包括Th1、Th17和Tfh)，CD8+IFN-γ+细胞，M1型巨噬细胞，NK细胞和DC浸润而减轻抗体介导的急性移植肾排斥并延长受体存活时间。有很多iTreg防治自身免疫性疾病的临床研究已经在开展而且其安全性已经得到证实。我们的研究可为iTreg应用于临床防治AMR打下基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞在制备(a)防治抗体介导的移植肾排斥和损伤，或者(b)改善移植肾存活的药物中的应用。
2.TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞在制备减少移植肾内炎症细胞浸润的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述炎症细胞为(a)B细胞和浆细胞、(b)CD4+细胞和CD8+IFN-γ+细胞、(c)M1型巨噬细胞，或(d)NK细胞和树突状细胞。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述CD4+细胞包括Th1细胞，Th17细胞和Tfh细胞。
5.一种用于防治抗体介导的移植肾排斥/损伤、改善移植肾存活或减少移植肾内炎症细胞浸润的药物，其特征在于：所述药物包括TGF-β体外诱导产生的调节性T细胞。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于：所述药物还包括药用载体。
7.一种调节性T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：通过TGF-β体外诱导制得调节性T细胞。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：向TGF-β中加入初始CD4+细胞、IL-2、抗CD3/CD28磁珠和完全培养液，体外诱导制得调节性T细胞。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述初始CD4+细胞的制备方法包括以下步骤：(1)将小鼠脾脏置于培养基中，研磨，吸取细胞悬液；(2)离心细胞悬液，弃上清后加入红细胞裂解液，重悬细胞，再进行裂解，然后加入所述培养基，混匀，终止裂解；(3)用所述培养基重悬并计数；(5)分选初始CD4+细胞。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)采用一步阴选分选初始CD4+细胞。
CN201710905472.5A 2017-06-20 2017-09-28 一种调节性t细胞的制备方法及其应用 Pending CN107519202A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2017104729781 2017-06-20
CN201710472978 2017-06-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107519202A true CN107519202A (zh) 2017-12-29

Family

ID=60736377

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710905472.5A Pending CN107519202A (zh) 2017-06-20 2017-09-28 一种调节性t细胞的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107519202A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109498652A (zh) * 2018-11-21 2019-03-22 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院） 诱导型调节性t细胞来源的外泌体的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1953767A (zh) * 2004-01-08 2007-04-25 加利福尼亚大学董事会 调节t细胞抑制自身免疫
CN101603030A (zh) * 2009-07-14 2009-12-16 吕凌 一种体外扩增调节性t细胞的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1953767A (zh) * 2004-01-08 2007-04-25 加利福尼亚大学董事会 调节t细胞抑制自身免疫
CN101603030A (zh) * 2009-07-14 2009-12-16 吕凌 一种体外扩增调节性t细胞的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAHIRO MIYAJIMA,ET AL: "Early Acceptance of Renal Allografts in Mice Is Dependent on Foxp3+ Cells", 《THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY》 *
SONG GUO ZHENG,ET AL: "Generation Ex Vivo of TGF-b-Producing Regulatory T Cells from CD4+CD25- Precursors", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
TAO LIAO，ET AL: "In Vivo attenuation of antibody-Mediated acute renal allograft rejection by Ex Vivo TgF-β-induced cD4+Foxp3+ regulatory T cells", 《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》 *
廖涛等: "移植肾抗体介导的排斥反应的发病机制研究进展", 《器官移植》 *
杨一芬等: "CD4+CD25+FOXP3+Treg调节性T细胞与移植肾长期存活的关系", 《广东医学》 *
王琦等: "供体抗原特异性CD4+CD25+T reg 细胞对肾移植大鼠免疫状态的影响", 《重庆医学》 *
袁劲等: "TGF-β1诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞", 《免疫学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109498652A (zh) * 2018-11-21 2019-03-22 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院） 诱导型调节性t细胞来源的外泌体的应用
CN109498652B (zh) * 2018-11-21 2022-03-08 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院） 诱导型调节性t细胞来源的外泌体的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Feng et al. Tolerance after liver transplantation: where are we?
Abaza et al. Effect of antilymphocytic serum on the survival of renal homotransplants in dogs
CN108904508B (zh) Polymerase I 抑制剂的新用途
Salgar et al. Infusion of donor leukocytes to induce tolerance in organ allograft recipients
CN107519202A (zh) 一种调节性t细胞的制备方法及其应用
AU2004217938B2 (en) Methods of treating disease by transplantation of developing allogeneic or xenogeneic organs or tissues
Dausset et al. HISTOCOMPATIBILITY STUDIES IN A CLOSELY BRED COLONY OF DOGS: III. Genetic Definition of the DL-A System of Canine Histocompatibility, with Particular Reference to the Comparative Immunogenicity of the Major Transplantable Organs
Muramatsu et al. Detection of chimerism following vascularized bone allotransplantation by polymerase chain reaction using a Y‐chromosome specific primer
CN103114074B (zh) 一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法
KR101829997B1 (ko) 장기 이식 거부반응 또는 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 키트
CN109929804B (zh) 一种人卵巢癌细胞系及其制备方法和应用
Saggi et al. Intragraft cytokine expressionf in tolerant rat renal allografts with rapamycin and cyclosporin immunosuppression
CN102614215A (zh) 一氧化碳分子在皮肤移植后抑制急性排斥反应中的应用
CN112156111B (zh) 脐血血小板线粒体在制备治疗自身免疫疾病药物中的应用
Reittie et al. Differential recovery of phenotypically and functionally distinct circulating antigen-presenting cells after allogeneic marrow transplantation
Cherry et al. The role of complement system in graft versus host disease
Rashad et al. CD62L Percentage in Peripheral T Cells of Kidney Transplant Recipients Children
Naar et al. The immunologic role of IFN-γ in ACI to Lewis kidney transplantation
CN106614260A (zh) 一种C5aR基因敲除小鼠cGVHD模型的建立方法
Linam et al. 680: Extended donor ischemic time is not associated with poor outcome in pediatric heart transplantation
Trzonkowski et al. PHENOTYPE AND FUNCTIONAL PROFILE OF LEUKOCYTES PRESENT IN A RENAL TRANSPLANT PATIENT EXPERIENCING REJECTION AFTER CAMPATH-1H THERAPY.
op den Dries Bile duct injury in liver transplantation: studies on etiology and the protective role of machine perfusion
Febnald et al. Detection of alloantigens on human and chimpanzee skin fibroblasts by in vitro cytotoxicity and colony inhibition tests
Kwiatkowski et al. KIDNEY STORAGE BY HYPOTHERMIC CONTINUOUS PULSATILE PERFUSION LIMITS CHRONIC ALLOGRAFT NEPHROPATHY.
Danko et al. Transplant aspiration cytology for monitoring of kidney xenograft (wolf-dog) under cyclosporin A treatment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171229