KR101829997B1 - 장기 이식 거부반응 또는 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 키트 - Google Patents

장기 이식 거부반응 또는 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 키트 Download PDF

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양철우
정병하
김경운
도경찬
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가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 이식 후 환자의 장기 이식 거부반응 또는 면역상태를 모니터링 하여 면역억제제의 투여량 감소 시기 및 면역억제제의 투여 여부를 판단할 수 있는 새로운 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 장기 이식 거부반응 검사용 키트 또는 이식 후 면역상태 모니터링 키트에 관한 것으로서, 본 발명에서 제공하는 키트를 사용 시 장기 이식 후 개체 내의 면역상태를 손쉽고 정확하게 판단할 수 있어 이식 후 처방되는 면역억제제의 과다 사용을 줄일 수 있는 효과가 있고, 환자 개개인에 대한 면역상태를 편리하게 관리할 수 있는 효과가 있다.

Description

장기 이식 거부반응 또는 이식 후 면역 상태를 모니터링하는 키트{Kit for organ transplant rejection or monitor the status of immune rejection}
본 발명은 이식 후 환자의 장기 이식 거부반응 또는 면역상태를 모니터링 하여 면역억제제의 투여량 감소 시기 및 면역억제제의 투여 여부를 판단할 수 있는 새로운 진단 키트에 관한 것이다.
면역은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절·비장·편도 등으로 순환하는 백혈구다. 면역반응에 관여하는 세포로서, B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성하며, B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. 또한, T세포는 흉선에서 생성되어 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.
한편, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.
이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가면역질환이 발생하게 되며, 뿐만 아니라 이식과 같은 시술 이후 면역거부 반응이 발생하게 된다.
한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다.
이식면역 거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식 거부반응이 발생하게 된다.
최근 외과적 시술 및 HLA 유형(type) 판독기법의 발달과 면역억제제의 개발에 의해 이식 성공률은 높아졌지만 여전히 면역거부반응과 면역억제제의 부작용에 의한 사망률이 높아 효과적이고 안전한 새로운 면역억제제의 개발이 요구되고 있다.
기존에 사용하고 있는 모든 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것으로서, 임상적으로 이식 후 T 세포-매개 급성거부반응을 막기 위해 매일 비특이적 면역억제제가 투여된다(Pirsch, J. D., curr. opin. organ. transplant., 2, 76-81, 1997). 일반적으로 사용되는 면역억제제는 글루코코티코스테로이드(glucocoticosteroids)을 포함하여 DNA 합성을 차단하여 T 세포의 증식을 억제하는 아자치오프린(azathioprine)과 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이 있으며, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 사이크로스포린 A(cyclosporine A)와 타크로리무스(tacrolimus) 등이 있다.
이들 약재는 비록 장기이식을 수혜 받은 환자의 면역거부반응을 극복하는데 많은 발전을 이루었지만 치료효과가 일시적이고 높은 독성이 나타나는 문제점을 가지고 있다.
따라서 이식 거부 반응을 억제하기 위한 면역억제제의 개발도 중요하지만 뚜렷한 치료 효과를 보이는 면역억제제의 개발이 미흡한 현 시점에서 면역억제제의 투여로 인해 발생하는 부작용을 최소화 시킬 수 있는 가장 효과적이면서도 빠른 방법은 면역억제제의 투여량을 감소시키는 것이다.
그러나 이식 받은 환자에게 부작용의 두려움으로 인해 면역억제제를 아무 기준 없이 감소하여 투여할 경우, 이식거부 반응으로 인한 고통이 증가할 수 있으므로, 보편적인 판단 기준을 가지고 이식 받은 환자 체내에서의 면역 상태를 확인하여 면역 상태가 좋은 환자에게는 면역억제제의 투여량을 감소시키고 그렇지 않은 환자에게는 기존 처리된 양으로 면역억제제를 처리할 수 있는 방법이 개발된다면 면역억제제로 인한 환자의 고통을 감소시킬 수 있을 것이다.
미국등록특허 6,358,751
따라서 본 발명의 목적은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 이식 후 면역상태 모니터링 키트를 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 목적은 (a) 이식 수술을 받은 개체에서 분리된 말초혈액에 대해 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수를 측정하는 단계; 및 (b) CCR7+CD8+T세포의 측정값을 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수 측정값으로 나눠 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)를 각각 계산하는 단계; 를 포함하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 이식 후 면역상태 모니터링 키트를 제공한다.
나아가 본 발명은 (a) 이식 수술을 받은 개체에서 분리된 말초혈액에 대해 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수를 측정하는 단계; 및 (b) CCR7+CD8+T세포의 측정값을 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수 측정값으로 나눠 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)를 각각 계산하는 단계; 를 포함하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)가 1 이상인 경우, 이식 후 개체에 대해 면역억제제의 투여량을 감소시켜 처방하거나 면역억제제를 투여하지 않아도 되는 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)가 1 미만인 경우, 이식 후 개체에 대해 면역억제제의 투여량을 감소시키지 말아야 하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역억제제는 칼시뉴린 억제제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역억제제의 투여량 감소는 최초 면역억제제 투여량을 100%로 할 경우, 50 ~ 75%의 양으로 감소시켜 처방할 수 있다.
본 발명은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 장기 이식 거부반응 검사용 키트 또는 이식 후 면역상태 모니터링 키트에 관한 것으로서, 본 발명에서 제공하는 키트를 사용 시 장기 이식 후 개체 내의 면역상태를 손쉽고 정확하게 판단할 수 있어 이식 후 처방되는 면역억제제의 과다 사용을 줄일 수 있는 효과가 있고, 환자 개개인에 대한 면역상태를 편리하게 관리할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 CD4+ T 세포 아형을 분석한 결과이다.
도 2는 CD4+ T 세포에서 CCR4, CCR6 T 세포를 분석한 결과이다.
도 3은 CD8+ T 세포 및 아형의 비교 분석 결과이다.
도 4는 CD8+ T 세포 분석 결과이다.
도 5는 급성 거부반응에서 CD28nullCD57+ T 세포의 증가를 확인한 결과이다.
도 6은 CCR7+CD8+T세포와 CCR6,CD28,CD57 신호와의 연관성을 확인한 결과이다.
도 7은 CCR7+CD8+T세포 증폭 조건에서 CD57+CD28nullCD8+T, CD8Diff의 감소를 확인한 결과이다.
도 8은 임상군간 CCR7+CD8+ T세포, CD57+CD28nullCD8+ T 세포비율의 차이 및 세포간의 관계를 분석한 결과이다.
도 9는 CCR7+T세포와 CD57+CD28nullCD8+ T세포의 비율을 비교한 결과이다.
본 발명은 장기 이식 수술을 받은 환자들의 면역 상태 또는 이식거부반응 정도를 모니터링할 수 있는 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는 이식 후 면역상태를 모니터링 하는 키트를 제공함에 그 특징이 있다.
이식 수술 뿐만 아니라 많은 면역질환 환자에 투여되고 있는 면역억제제는 체내에서 각종 부작용을 초래하는 문제점이 발생하고 있으나, 특히 이식과 같은 수술을 받은 환자의 경우, 면역 거부 반응의 억제를 위해 불가피하게 부작용이 일어날 수 있음을 감안하고서라도 면역억제제를 처방할 수 밖에 없다.
또한, 현재까지 부작용이 없는 면역억제제가 개발되지 못하고 있어, 현 시점에서 면역억제제로 인한 부작용 감소를 위해서는 처리양을 감소시키는 방법이 최선이지만 어떠한 시점에서 어느 정도로 약물 투여량을 감소시켜야 하는지에 대한 가이드가 제공된 바 없다.
이에 본 발명자들은 이식 후 면역억제제의 과다 복용을 감소시킬 수 있고, 이식 수술을 받은 환자 개개인에 적용이 가능한 이식 후 예후 관리를 위한 이식후 면역 상태 또는 이식거부반응을 모니터링 할 수 있는 마커를 발견하였다.
즉, 본 발명에서 이식 후 면역 상태 또는 이식거부반응을 모니터링 할 수 있는 마커로서 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 사용할 수 있으며 이들의 세포 수를 측정하여 면역상태를 모니터링할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, CCR7+CD8+ T 세포와 CD8 T Diff, CCR4+CCR6+CD4+ T 세포, CD28nullCD57+T세포간의 상관관계를 조사한 결과, CCR7+CD8+ T 세포는 CD28null, CD57+, CCR6+ T 세포 및 CD8+ T Diff 세포와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 보임으로서, 급성 거부반응에서 보이는 CCR7+ 의 감소와 CD28null, CD57+, CCR6+ T 세포의 증가가 서로 연관되어 나타난 반응임을 확인하였다(도 6 참조).
따라서 본 발명자들은 상기의 결과를 통해 각 표면 마커들의 조합을 이용하여 이식 후 환자의 면역상태를 모니터링할 수 있는 지표로 활용할 수 있으며, 보다 구체적으로는CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 “CCR7+CD8+T세포” 및 “CD57+CD28nullCD8+T세포”를 측정할 수 있는 물질은 이에 제한되지는 않지만 바람직하게는 항체로서, “CCR7+CD8+T세포”는 CCR7에 대한 항체 및 CD8에 대한 항체를 이용하여 각각에 대한 생성량을 측정할 수 있고, “CD57+CD28nullCD8+T세포”는 CD57에 대한 항체, CD28에 대한 항체 및 CD8에 대한 항체를 이용하여 각각의 생성량을 측정할 수 있다.
나아가 본 발명자들은 이러한 결과를 토대로 본 발명에서 제공하는 2가지 마커를 이용하여 이식 후 환자의 면역상태를 모니터링하여 면역억제제의 투여 여부 및 투여량 조절을 보다 정량적이면서 정확하게 결정할 수 있는 방법으로 상기 2가지 마커, 즉 CCR7+CD8+T세포의 세포수 측정값에 대해 이들 값을 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수 측정값으로 나눈 비율(ratio)을 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서는 상기 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)가 1 이상인 경우, 면역억제제의 감량에도 면역 상태가 비교적 잘 유지 및 조절 가능함으로, 면역억제제의 투여량을 감소시켜 처방하거나 면역억제제를 투여하지 않아도 되는 면역 저항군 또는 면역 안정군으로 판정할 수 있으며, 반면 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)가 1 미만일 경우 면역 상태가 좋지 않으며, 면역 거부 반응이 있는 것으로 판단하여 면역억제제의 투여량을 줄이지 않는 것이 바람직한 환자 치료 처방이라는 것을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명은 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 이식 후 면역상태 모니터링 키트 또는 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명에서 제공하는 2가지의 마커를 이용하여 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법을 제공할 수 있는데 바람직하게는 (a) 이식 수술을 받은 개체에서 분리된 말초혈액에 대해 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수를 측정하는 단계; 및 (b) CCR7+CD8+T세포의 측정값을 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수 측정값으로 나눠 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)를 각각 계산하는 단계; 를 포함할 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 면역억제제는 당업계에서 사용되고 있는 모든 면역억제제일 수 있으며, 바람직하게는 칼시뉴린 억제제를 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
급성 거부반응 면역세포/분자 분석 및 바이오 마커 개발
본 발명자들은 본 기관(가톨릭대 병원) 및 공동연구기관 (강동경희대 병원, 경희의료원, 경북대병원)에서 연구기간동안 이식 환자로부터 채취된 검체 중 각 임상군을 대표할 수 있는 검체 104개를 먼저 선별하였다.
본 거부반응 면역세포 / 분자 분석을 통한 바이오 마커 개발 연구에는 냉동 보관 검체를 이용하므로, 본 발명에서 탐색하고자 하는 마커는 모두 세포 표면마커 (surface marker) 만을 이용하여 구성하였고, 최종 선정된 마커는 표 1과 같다.
T 세포 아형 분석에 이용된 표면 마커
T cell subset
Surface Marker
CD4+ T cell / CD8+ T cell
 CD4+/ CD8+
Regulatory T cell
 CD4+ CD25high CD127low
Chemokine receptor (CCR4, CCR6)
 CCR4+CCR6+
Naive T cell
CD4+ (or CD8+)CCR7+CD45RA+
Central memory T cell
CD4+ (or CD8+)CCR7+CD45RA-
Effector memory T cell
 CD4+(or CD8+)CCR7-CD45RA-
CD4+ TDiff (TEMRA)
 CD4+(or CD8+)CCR7-CD45RA+
Immunosenescence CD4+T cell
 CD4+ CD28null CD57+
Immunosenescence CD8+T cell
 CD8+ CD28null CD57+
IL-17-producing T cells marker
 CD4+ CD28null CD57+ CD161+
앞서 본 마커들을 이용한 면역세포 분석을 신선검체와 냉동검체를 이용 각각 진행하였고, 그 결과 서로 유의한 차이가 없었다. 연구가 진행된 임상군은 하기 표 2와 같다.
임상군의 정의
이식환자 임상군
Normal control (CON) (n = 16)
T cell mediated rejection (TCMR) (n=24)
Antibody mediated rejection (AAMR) (n=14)
Long term good outcome (LTGO) (n= 27)
Chronic allograft dysfunction AD (n=13)
Tolerance (n=7)
< 실시예 2>
본 발명 실험을 위한 환자의 말초 혈액 단핵세포 분리와 배양 방법
환자로부터 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 혈액을 PBS (Phosphate-Buffered Saline)와 1:1로 섞어 Ficoll과 혈액+PBS을 1:4의 비율로 Ficoll층이 흐트러지지 않게 50 ml tube에 천천히 띠운 다음 혈액을 2000 rpm, 30분간 원심 분리하였다. Buffy coat층만을 따서 새 tube에 담은 후 PBS로 세척하고 세포 수를 세어 5X105개씩을 48 웰 플레이트(NUNCTM,Denmark)에서 배양하였다.
< 실시예 3>
본 발명 실험을 위한 세포자극 및 FACs 분석 방법
상기 실시예 2의 방법대로 분리한 PBMC 세포에서 Regulatory T cell을 보기위한 마커로는 CD4-PE/Cy7 (RPA-T4, IgG1; BioLegend, San Diego, CA), CD25-APC (M-A251, IgG1, k; Pharmingen), CD127-FITC (eBioRDR5, IgG1,κ; Pharmingen, San Diego, CA), Chemokine receptor를 보기위한 마커로는 CCR4-PE (1G1, IgG1, κ; Pharmingen, San Diego, CA), CCR6-APC (11A9, IgG1, κ; Pharmingen San Diego, CA), Naive T cell, central memory T cell, Effector memory T cell, differentiated T cells를 보기위한 마커로는 CD4-PE/Cy7 (RPA-T4, IgG1; BioLegend, San Diego, CA), CCR7 (2H4, IgM, κ; Pharmingen San Diego, CA), CD8-APC (RPA-T8, IgG1,κ; Pharmingen, San Diego, CA), CD45RAFITC (HI100, IgG2b, κ; Pharmingen, San Diego, CA), Immunosenescence CD4+T cell을 보기위한 마커로는 CD4-PE/Cy7 (RPA-T4, IgG1; BioLegend, San Diego, CA), CD28-PE (CD28.2, IgG1,κ; eBiosience, San Diego, CA), CD57-FITC (TB01, IgM; eBiosience, San Diego, CA), Immunosenescence CD8+T cell을 보기위한 마커로는 CD8-APC (RPA-T8, IgG1,κ; Pharmingen, San Diego, CA),CD28-PE (CD28.2, IgG1,κ; eBiosience, San Diego, CA), CD57-FITC (TB01, IgM; eBiosience, San Diego, CA),IL-17-producing T cells을 보기위한 마커로는 CD4-PE/Cy7 (RPA-T4, IgG1; BioLegend, San Diego, CA), CD28-PE (CD28.2, IgG1,κ; eBiosience, San Diego, CA), CD57-FITC (TB01, IgM; eBiosience, San Diego, CA), CD161-APC (HP-3G10, IgG1; eBiosience, San Diego, CA)로 각 세포 표면을 염색(staining)하고 4℃에서 30분간 반응시켰다. 또한, FACs buffer로 씻어준 후 유세포 분석기(FACs Calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)로 측정하였다.
< 실시예 4>
이식 후 거부반응과 Tnaive , TEM , TCM , TDiff (CD4 + T or CD8 + T 세포) 확인
본 발명의 바이오마커를 이용하여 이식 후 거부반응과 Tnaive, TEM, TCM, TDiff (CD4+ T or CD8+ T 세포)를 확인하였다. 이를 위한 구체적인 방법은 상기 실시예 2 및 3의 방법을 준용하였다.
그 결과, CD4+ T 세포의 세포수 및 전체 세포에서의 비율은 각 임상군별로 차이를 보이지 않음을 알 수 있었다(도 1 참조). 또한 CD4+ TCM (CD4+CCR7+CD45RA-), CD4+ TEM (CD4+CCR7-CD45RA-), CD4+ TDiff (TEMRA)(CD4+CCR7-CD45RA+) 의 CD4+ T 세포 내에서의 비율 역시 각 임상군 별로 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다.
Chemokine receptor analysis (CCR4, CCR6)에서 CCR4+CCR6-CD4+ T 세포는 정상 조직군, 세포매개성 거부반응, 항체매개성 거부반응 세 군간에 차이를 보이지 않았으나, CCR4-CCR6+CD4+T 세포와 CCR4+CCR6+CD4+T 세포는 급성거부반응군에서 증가되는 양상을 보임을 확인하였다. 특히 CCR4-CCR6+ T 세포는 항체매개성 거부반응보다 세포매개성 거부반응에서 증가되는 양상을 보여, 이는 두 거부반응군을 감별할 수 있는 마커로 제시될 수 있음을 알 수 있었다(도 2 참조).
따라서, 상기 결과는 CCR6+CD4+ T 세포의 증가가 거부반응과 유의한 상관관계를 보임을 시사하는 것이며 본 발명의 마커가 급성 거부반응을 효과적으로 확인할 수 있는 마커로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에서는 CD8+ T 세포의 경우도 전체 세포 수 및 CD8+ Tnaive TCM, TEM 은 각 임상군별로 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 그러나 CD8+ TDiff아형(CD8+CCR7-CD45RA+) 세포의 CD8+ T 세포 전체 내에서의 비율이 급성 거부반응군에서 정상조직군과 비교하여 유의하게 증가가 되며, 반대로 CCR7+CD8+T 세포의 림프구(lymphocyte) 전체에서의 비율이 의미 있게 감소됨을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 급성 거부반응에서 CCR7 negative 세포 비율이 증가하고 CCR7 positive 세포의 비율이 감소하는 양상은 CCR7 을 통한 신호가 거부반응 발생에 중요한 역할을 함을 시사하고 있다.
< 실시예 5>
이식 후 거부반응과 CD28 null 또는 CD57 + T 세포 확인
본 발명의 바이오마커를 이용하여 이식 후 거부반응과 CD28null 또는 CD57+ T 세포를 확인하였다. 이를 위한 구체적인 방법은 상기 실시예 2 및 3의 방법을 준용하였다.
그 결과, CD28null/Lymphocytes 특히 CD28null/CD8+ T 세포가 세포매개성 거부반응 및 항체매개성 거부반응에서 모두 증가하는 양상을 보임을 알 수 있었다. 또한 CD57+/Lymphocytes 와 CD57+/CD8+ T 세포 역시 세포매개성 거부반응 및 항체매개성 거부반응에서 모두 증가된 양상을 보이고, 같은 샘플에서 측정된 두 세포 (CD28null/Lymphocytes와 CD57+/Lymphocytes) 의 림프구 전체 분획 내에서의 비율은 유의한 상관관계를 보임을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
CD28nullCD57+ T / CD8+ T 세포 혹은 CD28nullCD57+T/lymphocytes 역시 급성 세포거부반응 및 급성항체매개성 거부반응에서 정상조직군과 비교하여 유의하게 증가됨을 확인하여, CD28nullCD57+ T 세포의 증가가 급성거부반응과 유의한 상관관계를 보임을 알 수 있었다.
상기의 결과로부터 급성거부반응에서 T 세포 내에서 up-regulation 되는 마커로서 CCR6, CD57 신호가 있으며, down-regulation 되는 마커로서 CD28, CCR7 관련 신호를 고려할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 6>
이식 후 거부반응과 CCR7 signaling 연관 T 세포 확인
본 발명자들은 이식환자에서 분리한 말초혈액단핵구 (PBMC)를 이용한 Ex vivo 실험에서 CCR6, CD57 신호의 증가와 CD28, CCR7 신호의 감소가 거부반응과 밀접한 연관성을 보임을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 동일한 검체에서 측정된 CCR7+CD8+ T 세포와 CD8 T Diff, CCR4+CCR6+CD4+ T 세포, CD28nullCD57+T세포간의 상관관계를 조사하였다.
그 결과, 도 6에서 나타나듯이, CCR7+CD8+ T 세포는 CD28null, CD57+, CCR6+ T 세포 및 CD8+ T Diff 세포와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 보임으로서, 급성 거부반응에서 보이는 CCR7+ 의 감소와 CD28null, CD57+, CCR6+ T 세포의 증가가 서로 연관되어 나타난 반응임을 확인하였다. 이는 각 표면 마커들의 조합을 통하여 급성 거부반응의 바이오마커 탐색이 가능함을 시사한다.
본 발명자들은 1단계 연구에서 급성 거부반응 환자에서 CCR7+CD8+ T의 감소와 함께 CD57+CD28nullCD8+T, CD8Diff 세포의 유의한 증가를 관찰하였고, 이들 염증성 세포들은 CCR7+CD8+ T와 유의한 역상관관계를 보임을 확인한 바 있다. 이에 in vitro조건에서도 이러한 관계가 재현되는지를 확인하였다.
먼저 도 1에서 제시된 CCR7+CD8+ T 세포 분화 조건에서 CD57+CD28nullCD8+T, CD8Diff를 유동세포계수법(flow cytmetry)으로 분석한 결과 도 2에서와 같이 CD57+CD28nullCD8+T, CD8Diff 는 모두 CCR7+CD8+T 세포 증폭 조건에서 감소하여 ex vivo의 결과가 in vitro로 재현됨을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
< 실시예 7>
거부반응 및 장기생존 바이오마커 타당성 검증(validation)을 위한 독립적인 코호트 발굴 및 검증
본 발명의 면역세포 바이오마커의 유효성을 검증하기 위해 78명의 독립된 타당성 검증(validation) 코호트를 개발하였다. 하기 표 3에 제시된 Integrated FACS 플랫폼 이용하였으며, 정상 대조군 (STA, n=11), 급성 T세포매개 거부반응군 (TCMR, n=8), 급성 항체매개성 거부반응군 (AAMR, n=6) 칼시뉴린 억제제 신독성군 (CNI toxicity, n=9), 장기생존군 (LGO, n=19), 만성항체매개성 거부반응군 (cAMR, n=15)으로 모집하였다.
본 환자 군에서 얻은 PBMC를 이용하였으며, 다음 표에 제시된 면역세포 surface marker 기반 바이오마커 분석을 시행하였다.
Figure 112016090109088-pat00001
그 결과, 도 8 에서 보듯이, TCMR, AAMR 군에서 STA 군, 혹은 CNI toxiity군과 비교하여 CCR7+CD8+ T 세포가 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다.
반면 CD57+CD8+ T, CD28nullCD8+ T 및 CD57+CD28nullCD8+ T 세포는 TCMR, AAMR 군에서 STA 혹은 CNI toxicity군과 비교하여 유의한 증가를 보이며, 전체 군에서 CCR7+CD8+T와 CD57+CD28nullCD8+T 세포간의 관계를 선형회귀분석 모델로 분석한 결과 통계적으로 유의한 반비례관계를 보이며 이는 1단계 샘플에서 확인한 결과와 일치함을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에서는 급성거부반응군과 정상 조직군간 가장 의미있는 차이를 보인 CCR7+CD8+T세포와 CD57+CD28nullCD8+T세포가 서로 반비례관계를 보이는 특성을 이용하여 그 비율을 구하여 각 임상군간의 비교하였다(도 9 참조).
이에 본 발명자들은 CCR7+CD8+T세포와 CD57+CD28nullCD8+T세포의 두 세포의 비율을 이용했을 때 단일 세포를 비교했을 때보다 유효성이 높은 바이오마커로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 장기 이식 거부반응 검사용 키트.
  2. CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포를 측정하는 물질을 포함하는, 이식 후 면역상태 모니터링 키트.
  3. (a) 이식 수술을 받은 개체에서 분리된 말초혈액에 대해 CCR7+CD8+T세포 및 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수를 측정하는 단계; 및
    (b) CCR7+CD8+T세포의 측정값을 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수 측정값으로 나눠 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)를 각각 계산하는 단계; 를 포함하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)가 1 이상인 경우, 이식 후 개체에 대해 면역억제제의 투여량을 감소시켜 처방하거나 면역억제제를 투여하지 않아도 되는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 CCR7+CD8+T세포의 세포수 대비 CD57+CD28nullCD8+T세포의 세포수의 비(ratio)가 1 미만인 경우, 이식 후 개체에 대해 면역억제제의 투여량을 감소시키지 말아야 하는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 면역억제제는 칼시뉴린 억제제인 것을 특징으로 하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 면역억제제의 투여량 감소는 최초 면역억제제 투여량을 100%로 할 경우, 50 ~ 75%의 양으로 감소시켜 처방해도 되는 것을 특징으로 하는 이식 후 개체의 면역 상태를 모니터링하는 방법.
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