CN102614215A

CN102614215A - 一氧化碳分子在皮肤移植后抑制急性排斥反应中的应用

Info

Publication number: CN102614215A
Application number: CN2012100355014A
Authority: CN
Inventors: 孙炳伟; 孙志伟; 孙艳
Original assignee: Affiliated Hospital of Jiangsu University
Current assignee: Affiliated Hospital of Jiangsu University
Priority date: 2012-02-16
Filing date: 2012-02-16
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明公开了一氧化碳分子在皮肤移植后抑制急性排斥反应中的应用，发明人经过大量的细胞试验发现，将所说的一氧化碳释放分子溶解在DMSO溶剂中，然后将其置于生物体内，可以持续性释放CO，故可作为一种外源性CO供体，并以ICR小鼠和BALB/C小鼠皮肤作为供体和受体建立同种异基因急性排斥反应模型，小鼠尾静脉注射外源性CO，进行早期干预，进行试验，发现一氧化碳释放分子对皮肤移植后急性排斥反应有抑制作用。采用所述的一氧化碳释放分子抑制皮肤移植后急性排斥反应，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，可以作为一种特异性强、低毒、高效的免疫抑制剂。

Description

一氧化碳分子在皮肤移植后抑制急性排斥反应中的应用

技术领域

本发明专利涉及一氧化碳释放分子在免疫抑制方面的新用途，具体的说，涉及一种早期应用一氧化碳释放分子治疗皮肤移植后抑制急性排斥反应的方法。

背景技术

同种异基因移植(Allotranspantation)是目前治疗器官衰竭终末期的主要途径。同种异基因皮肤移植作为一种简便的器官移植手段，不仅在抗移植排斥的研究中应用广泛，而且在临床上，一定程度解决了自体皮肤的缺乏以及异种皮肤移植带来的伦理学问题。但是接受了同种异基因组织器官移植的个体，移植物MHC抗原被自身免疫系统识别，产生排斥。早在18世纪，人类就开始了异体皮肤移植的探索。最初的尝试都因为无法迈过最初的急性排斥反应而最终宣告失败。到了近代，免疫学有了突破进展，伴随着免疫抑制剂的出现和免疫耐受诱导概念的提出，使突破这些障碍成为可能。目前的免疫抑制剂虽然在疗效取得一定的突破，但因为缺乏特异性而带来严重的副作用使之仍然无法令人满意，研制高效低毒特异性强的免疫抑制剂仍然是今后艰巨的任务。

由于皮肤的特殊结构，血液循环的建立较之行血管吻合的实质器官晚，其致敏的发生场主要在引流淋巴结，且皮下组织内含有大量的郎罕氏巨细胞(LC)，作为一种专职APC，使同种异基因皮肤移植发生的急性排斥反应尤其剧烈。正因为这样的特性，加上皮肤移植的直观性便于连续观察排斥状况，使其成为研究排斥反应及相应抗排斥手段的最常用模型。目前发现的具有免疫抑制作用的药物主要有以下5类：化学制剂类、激素类、真菌代谢产物类、中药及其有效成分、多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体。环磷酰胺，是最早用于临床的烷化剂类免疫抑制剂，作用强大，破坏DNA的结构功能，抑制细胞分裂增殖，从而起到杀伤免疫细胞的作用，但副作用极大，多用于自身免疫性疾病的研究和治疗，对于在皮肤移植研究中的应用尚无特别报道。环孢素A(CsA)，为11个氨基酸组成的环状多肽，最早是从真菌代谢产物中提取，可人工合成，选择性抑制Th细胞产生的细胞因子，特别是对IL-2及其受体的表达，从而一起对IL-2不能反应；对体液免疫及炎症反应也有一定作用。他克莫司(FK506)，为新一代真菌肽类免疫抑制剂，作用机理类似CsA，但效能更强大，主要抑制IL-2、IL-3、IFN-γ等致炎因子。AG490，为人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位置。雷帕霉素，为大环内酯类抗生素，1989年经证实有强大的免疫抑制作用，主要是通过阻止IL-2、IL-4对T细胞活化的信号传导从而抑制了T细胞增殖周期的G1期向S期分化，并对体液免疫也有抑制作用，而对非特异性免疫无明显影响。但是，由于非特异性抗免疫排斥的局限，在长期服用传统免疫抑制剂的情况下会出现诸多致命的并发症，如肿瘤、全身免疫力低下、中枢及肝肾功能损害等等。因此，研究高效、低毒、特异性免疫抑制剂成为当今移植领域的研究热点。

一氧化碳(CO)常温常压下是一种双原子、小分子的气态物质，由于一氧化碳可与机体内血红蛋白结合生成碳氧血红蛋白(HbCO)，使得血液运输氧的能力发生障碍，高浓度时还可与还原性细胞色素氧化酶的两价铁结合，抑制组织呼吸，故CO在以往被认为是有毒气体，对CO的研究仅局限于它的生物学毒性。近年来，大量的研究证实一氧化碳(CO)与一氧化氮(NO)相类似，也是一种重要的气体细胞信使分子，在细胞功能和通讯的调节力一面发挥信号转导的重要作用。到1990年代初，Snyder等[6]提出至少在一种类型的神经细胞内，CO将不仅仅是副产物且作为cGMP的调节分子，它将和NO一样激活生物信号。Snyder等研究证明，cGMP在中枢神经系统的嗅觉信号传导中起了重要的作用，而这种作用可被HO的抑制剂阻断，从而提出了CO的分子信号作用。

外源性一氧化碳释放分子(Carbon monoxide-releasing molecules，CORMs)是近年来新合成的一种一氧化碳复合物，该一氧化碳复合物的制备方法和理化性能参数，在Motterlini R等所著文献(Curr.Pharm.2003；9：2525-39)中有详细的报道，该一氧化碳复合物通常可用于制备缓释的一氧化碳。

上世纪九十年代初，Mahin Maines等提出Heme在大脑内由HO-1降解产生的CO激活了3’，5’-cGMP。CO将不仅仅是副产物，而且是作为cGMP的调节分子。HO-1作为体内唯一一种催化血红素(heme)分解代谢的限速酶，对细胞的保护作用最早在急性肺损伤和内毒素休克动物模型上被证实：当HO-1被抑制剂锌原卟啉所抑制或不被诱导，移植的心脏很快被排斥；而利用一定浓度的外源性CO处理移植的心脏后，即使HO-1的活性被抑制的情况下，也可防止急性排斥的发生，并达到与HO-1表达一样的效果。HO-1或外源性CO可抑制心血管系统白细胞浸润及平滑肌细胞的增殖，从而抑制了移植物微血管新生内膜的形成。此作用是通过顺序激活cGMP、p38MARK途径，从而表达细胞周期抑制因子p21，使平滑肌细胞周期停留在G1/S阶段。

根据我们的前期研究已经证实，外源性CO对脓毒症早期的炎症反应有抑制作用。如能够将所述的一氧化碳释放分子用于抑制同种异体移植排斥反应中，将为研究开发新型低毒、高效的免疫抑制剂开辟新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一氧化碳释放分子在皮肤移植后抑制急性排斥反应中的应用，以满足临床应用的需要。

将所述一氧化碳释放分子溶解在溶剂中，然后将其置于细胞培养液或生物体内，中可以持续性释放CO，作为一种外源性CO供体，动物试验发现，可用于抑制皮肤移植后急性排斥反应，可作为一种抑制皮肤移植后急性排斥反应的药物，所述的急性排斥反应，包括同种异基因小鼠皮肤移植后，脾脏淋巴细胞分泌功能的增强，或者是：同种异基因小鼠皮肤移植后脾脏淋巴细胞体外增值能力的增强。

因此，所述的一氧化碳释放分子CORM-2，可以用于制备抑制皮肤移植后急性排斥反应的药物；

本发明以ICR小鼠和BALB/C小鼠皮肤作为供体和受体建立同种异基因急性排斥反应模型，小鼠尾静脉注射外源性CO，将所述的一氧化碳释放分子作为一种抑制皮肤移植后急性排斥反应的药物，施加于皮肤移植后的动物，剂量一般7～8mg/kg体重/天，具体可根据患者的具体情况，由医师决定，进行早期干预，进行试验，发现一氧化碳释放分子对皮肤移植后急性排斥反应有抑制作用。

采用所述的一氧化碳释放分子抑制皮肤移植后急性排斥反应，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，可以作为一种特异性强、低毒、高效的免疫抑制剂，能够满足临床应用的需要。

附图说明

图1为移植皮片HE染色光镜下视野(400倍)。

图2为移植皮片真皮层IL-2免疫组织化学切片光镜观察(400倍)。

图3为移植皮片真皮层IL-4免疫组织化学切片光镜观察(400倍)。

图4为移植皮片真皮层IL-10免疫组织化学切片光镜观察(400倍)。

图5为移植皮片真皮层IFN-γ免疫组织化学切片光镜观察(400倍)。

图6为移植皮片真皮层FAS免疫组织化学切片光镜观察(400倍)。

图7为移植皮片真皮层FasL免疫组织化学切片光镜观察(400倍)。

图8为各组小鼠外周血淋巴细胞增值指数。

具体实施方式

实施例1

外源性一氧化碳释放分子CORM-2对同种异基因小鼠皮肤移植后移植物的实验观察试验方法：

(1)动物及同种异基因小鼠皮肤移植模型

以清洁级ICR小鼠、BALB/C小鼠分别作为供体和受体建立异体皮肤移植模型，共分5组：1组假手术组，2组同种异基因皮肤移植组，3组同种异基因皮肤移植+CORM-2组，4组异体皮肤移+iCORM-2组，5组异体皮肤移植+CsA组；术后分别依据每组要求给药，观察移植皮片排斥程度，观察期为7天。于观察期结束时，分别取下移植皮片以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，常规病理HE染色、免疫组化检测。

(2)检测指标

a 外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对同种异基因小鼠皮肤移植后移植物存活时间的观察

1组、2组自模型建立后仅单笼饲养，正常喂食；3组以DMSO溶解CORM-2，给药浓度8mg/kg，按25g体重即每只小鼠注射40M母液8ul，配以152ul生理盐水，尾静脉注射160ulCORM-2稀释液；4组按照3组的方法配制稀释液，在室温下将稀释液敞开放置24小时后用氮气驱赶掉稀释液内的残余CO后则配成失活的CORM(iCORM-2)作为阴性对照，每只小鼠尾静脉注射160ul；5组小鼠按照20mg/kg的剂量腹腔注射CsA作为阳性对照，160ul/只。所有给药均为7天，每天一次，自造模成功后即开始。

b 外源性一氧化碳释放分子CORM-2对同种异基因小鼠皮肤移植物病理学、免疫组织化学观察

移植皮片样本石蜡切片HE染色步骤：

1.取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。

2.切片常规用二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇脱水：二甲苯(I)作用5分钟，100％乙醇脱水2分钟，95％的乙醇脱水1分钟，80％乙醇脱水1分钟，75％乙醇脱水1分钟，最后蒸馏水洗涤2分钟。

3.苏木素染色5min，自来水冲洗。

4.盐酸乙醇分化30s(提插数下)。

5.自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。

6.置伊红液2min。

移植皮片样本石蜡切片免疫组织化学检测步骤：

1 质量分数为4％多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20％蔗糖溶液(4℃)中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min；

2 加入配好的0.3％的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+质量分数为30％过氧化氢)30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min；

3 加入配好的0.3％Triton X100(30％Triton X100+0.01MKPBS 100ml)30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min；

4 加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min；5加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min；6加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min；蒸馏水迅速冲三次；

7 加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；

8 梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

局部移植物免疫组化检测指标

本实验选择了白细胞介素2、4、10、IFN-γ及凋亡相关蛋白FAS及其配体FasL共5项指标进行免疫组化检测。

结果如下：

a外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对同种异基因小鼠皮肤移植后移植物存活时间的观察：

表1示50％皮片平均存活时间(median survival time，MST)的观察：在同种异基因小鼠皮肤移植模型中，经外源性一氧化碳释放分子CORM-2注射7天的小鼠，其皮片生存时间接近经环孢素A(CsA)腹腔注射7天的小鼠，与对照组相比，皮片生存时间明显延长。

b外源性一氧化碳释放分子CORM-2对同种异基因小鼠皮肤移植物病理学、免疫组织化学观察：

图1示5组移植皮片HE染色光镜下视野(400倍)：除了炎性渗出，可见呈蓝紫色深染的细胞核分布于皮肤全层，包括皮肤固有的角质细胞、成纤维细胞、毛细血管内皮细胞，炎症细胞包括单核细胞，中性粒细胞、淋巴细胞等。假手术组组炎症细胞浸润程度最低，同种异基因皮肤移植组、异体皮肤移+iCORM-2组明显增加，特别是在炎性渗出强烈的区域，同种异基因皮肤移植+CORM-2组、异体皮肤移植+CsA组比较假手术组也明显增加，但相对同种异基因皮肤移植组、异体皮肤移+iCORM-2组，炎性细胞浸润相对减弱。

图1-1，炎症细胞浸润程度最低，图1-2、图1-4明显增加，特别是在炎性渗出强烈的区域，图1-3、图1-5组比较图1-1组也明显增加，但相对图1-2、图1-4，炎性细胞浸润相对减弱。

图2示5组移植皮片真皮层IL-2免疫组织化学切片光镜观察(400倍)：图2-1真皮层呈棕黄色染色的IL-2阳性细胞非常稀疏，图2-1、图2-4显示真皮层出现大片深染阳性细胞，胞浆染色均匀，图2-3、图2-5组显示也有不同程度的深染细胞，主要在近皮下部分的真皮层，但明显少于图2-2、图2-4组，说明IL-2在图2-3、图2-5组移植物内的表达比较图2-2、图2-4组有所减弱。

图3示5组移植皮片真皮层IL-4免疫组织化学切片光镜观察(400倍)：图3-1 显示真皮层呈棕黄色染色的IL-4阳性细胞非常稀疏，图3-2、图3-4组显示，真皮层出现大片深染阳性细胞，胞浆染色均匀，图3-3、图3-5显示，也有不同程度的深染细胞，主要在近皮下部分的真皮层，但明显少于图3-2、图3-4组，说明IL-4在图3-3、图3-5组移植物内的表达比较图3-2、图3-4组有所减少。

图4示5组移植皮片真皮层IL-10免疫组织化学切片光镜观察(400倍)：图4-1显示真皮层呈棕黄色染色的IL-10阳性细胞胞浆染色均匀，分布广泛，图4-2、图4-4组显示真皮层也有部分深染阳性细胞，但明显数量较少，图4-3、图4-5组显示，也有不同程度的深染细胞，主要在近皮下部分的真皮层，但明显多于图4-2、图4-4，说明IL-10在3、5组移植物内的表达比较图4-2、图4-4组有所增加。

图5示5组移植皮片真皮层IFN-γ免疫组织化学切片光镜观察(400倍)：图5-1显示真皮层呈棕黄色染色的IFN-γ阳性细胞非常稀疏，图5-2、图5-4组显示真皮层出现大片深染阳性细胞，胞浆染色均匀，图5-3、图5-5显示组也有不同程度的深染细胞，主要在近皮下部分的真皮层，但明显少于图5-2、图5-4组，说明IFN-γ在图5-3、图5-5组移植物内的表达比较图5-2、图5-4组有所减少。

图6示5组移植皮片真皮层FAS免疫组织化学切片光镜观察(400倍)：图6-1显示组真皮层呈棕黄色染色的FAS阳性细胞非常稀疏，图6-2、图6-4组显示真皮层出现大片深染阳性细胞，胞浆染色均匀，图6-3、图6-5组显示也有不同程度的深染细胞，主要在近皮下部分的真皮层，但明显少于图6-2、图6-4组，说明FAS在图6-3、图6-5组移植物内的表达比较图6-2、图6-4组有所减少。

图7示5组移植皮片真皮层FasL免疫组织化学切片光镜观察(400倍)：图7-1组显示真皮层呈棕黄色染色的FasL阳性细胞非常稀疏，图7-2、图7-4组显示真皮层出现大片深染阳性细胞，胞浆染色均匀，图7-3、图7-5组显示也有不同程度的深染细胞，主要在近皮下部分的真皮层，但明显少于图7-2、图7-4组，说明FasL在图7 -3、图7-5组移植物内的表达比较图7-2、图7-4组有所减少。

实施例2

外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对同种异基因小鼠皮肤移植后脾脏淋巴细胞功能的影响

小鼠同种异基因皮肤移植后的急性排斥反应，主要以单核细胞介导T淋巴细胞为主的细胞免疫为主要特点。其中，T淋巴细胞的2个亚群之比(CD4⁺/CD8⁺)在反映移植免疫排斥的程度上已经得到一定的认识。CD4⁺T细胞属于是辅助性T淋巴细胞，是移植免疫应答过程中的主要细胞，而CD8⁺T为细胞毒性T淋巴细胞，在移植免疫应答过程中为效应细胞，起到一定调控免疫细胞的作用。CD4⁺/CD8⁺比值的升高与急性排斥的程度密切相关，因而可以作为衡量排斥程度的一项重要指标。

另外，移植后，淋巴细胞增殖能力，以及淋巴细胞分泌功能均反映了脾脏淋巴细胞的功能，最终反映了受体对移植物的排斥能力。

同种异基因急性免疫排斥反应发生时免疫细胞向外周血释放重要炎症因子，如TNF-α、IL-2等，可以加剧受体对移植物的损害。

试验方法：

(1)动物及同种异基因小鼠皮肤移植模型

以清洁级ICR小鼠、BALB/C小鼠分别作为供体和受体建立异体皮肤移植模型，共分5组：1组假手术组，2组同种异基因皮肤移植组，3组同种异基因皮肤移植+CORM-2组，4组异体皮肤移+iCORM-2组，5组异体皮肤移植+CsA组，术后分别依据每组要求经尾静脉给药，共给药7天，每天1次。于观察期结束时，在无菌条件下，分别取每只受体小鼠的外周全血、血清。

(2)检测指标

1.外源性一氧化碳释放分子(C0RM)2对同种异基因小鼠皮肤移后脾脏T淋巴细胞亚群比例的影响：

心脏采集小鼠外周全血，取100ulEDTA抗凝血加20ul荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。

避光室温作用20min，以红细胞裂解液溶去红细胞后，固定剂固定。

流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，设定阳性参数值，计算机将读出阳性值。

2、外源性一氧化碳释放分子(C0RM)2对同种异基因小鼠皮肤移植后脾脏淋巴细胞体外增值能力的影响：

每个样本设4个板孔，1为增殖本底，3个为实验孔，小鼠脾脏淋巴细胞悬液按1×106浓度100ul接种于包括增殖本地在内的每个孔板中，12.5ug/ml刀豆蛋白A10ul及经丝裂霉素C预处理30min的ICR和KM鼠脾淋巴细胞悬液按1×105浓度10ul分别接种于3个实验孔中；37℃、5％CO2培养培养48小时，结束培养前4小时每个培养孔内加入0.01mol/L pH 7.2PBS配制的5g/L MTT染液10μl。培养结束后弃去上清液，每孔内加入DMSO液150μL，摇床振荡10min，使蓝紫色结晶充分溶解，使用酶标仪570nm下测定各孔吸光度。细胞增值率等于测定组吸光度值与对照组吸光度值的比值。

1.外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对同种异基因小鼠皮肤移植后脾脏淋巴细胞分泌功能的影响

酶联免疫吸附试验(ELISA)操作步骤

加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，37℃反应120分钟。弃去液体，甩干，每孔加检测溶液A工作液100ul(取1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃，60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，轻拍将孔内液体拍干。每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100ul，37℃，60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，轻拍将孔内液体拍干。依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30分钟内)依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。结果计算：所有OD值减去空白后再计算。绘制标准曲线，查出浓度。

统计学处理

数据用x±s差表示，均数的比较采用t检验。P＜0.05为有统计学差异。差异显著性检验采用SPSS 13.0统计软件。

结果如下：

1、T淋巴细胞亚群CD4+T、CD8+T的比较：图8示小鼠外周血T淋巴细胞亚群FCM分析：每组FCM图片各2张，左侧右下象限为CD4+T占CD3+T相对百分比(以彩点密度表示)，左上象限为CD8+T占CD3+T相对百分比(以彩点密度表示)，右侧为流式细胞原始图像，所设门在T淋巴细胞团，即图中黑圈所在位置，左侧团块为B淋巴细胞群，上部细胞团为中性粒细胞、单核细胞、NK细胞等。

2、各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+：表2示同种异基因皮肤移植后的小鼠，经外源性CO干预后脾脏T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的比值比较对照组显著下降，与CsA干预的效果比较接近(表2)。

3、淋巴细胞刺激指数SI＝OD(刺激细胞/ConA+反应细胞)/OD(增殖底)*100％：图8示在ConA(蓝色条柱)刺激下，1-5组小鼠脾淋巴细胞均出现了相对于增值本底的细胞增殖现象，尤其是在2、4组的淋巴细胞，SI超过了4，3组CORM-2实验组超过3，5组CsA对照组最低，低于2，1组sham组约2.5左右；在ICR鼠脾淋巴细胞(红色条柱)刺激下，各组小鼠脾淋巴细胞也发生了相对本底的增值现象，以1、2、4组最为明显，3、5组相对明显抑制，接近1，特别是5组CsA组低于1，即出现显著抑制现象；在KM鼠脾淋巴细胞(黄色条柱)刺激下的情况基本与ICR脾细胞刺激大体趋势相似。

4、各组小鼠外周血TNF-a、IL-2含量：表3示在外源性CO释放分子干预7天后，同种异基因小鼠皮肤移植受体外周血TNF-a、IL-2浓度比较对照组有明显减低，但仍高于CsA组水平。

图8为5组小鼠体外培养脾脏淋巴细胞增殖刺激指数(SI)：

在ConA刺激下，1-5组小鼠脾淋巴细胞均出现了相对于增值本底的细胞增殖现象，尤其是在2、4组的淋巴细胞，SI超过了4，3组CORM-2实验组超过3，5组CsA对照组最低，低于2，1组sham组约2.5左右；在ICR鼠脾淋巴细胞(红色条柱)刺激下，各组小鼠脾淋巴细胞也发生了相对本底的增值现象，以1、2、4组最为明显，3、5组相对明显抑制，接近1，特别是5组CsA组低于1，即出现显著抑制现象；在KM鼠脾淋巴细胞刺激下的情况基本与ICR脾细胞刺激大体趋势相似。

表150％皮片平均存活时间(median survival time，MST)的观察

*、#与2、4组比较，移植物存活时间明显延长，P＜0.05；1组在实验中未出现排斥现象.

表2各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+

*、#与2、4组比较，CD4/CD8显著降低，P＜0.05

表3各组小鼠外周血TNF-a、IL-2含量

*、#分别与2、4组比较，P＜0.05

Claims

1.一氧化碳分子在制备皮肤移植后抑制急性排斥反应药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的急性排斥反应，为同种异基因小鼠皮肤移植后，脾脏淋巴细胞分泌功能的增强。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的急性排斥反应，为同种异基因小鼠皮肤移植后脾脏淋巴细胞体外增值能力的增强。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，剂量为7～8mg/kg体重/天。