CN104031880A - 一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法 - Google Patents
一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104031880A CN104031880A CN201410284437.2A CN201410284437A CN104031880A CN 104031880 A CN104031880 A CN 104031880A CN 201410284437 A CN201410284437 A CN 201410284437A CN 104031880 A CN104031880 A CN 104031880A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- memory
- induction
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法,本发明是利用含CpG2006、IL-2、IL-10、B95-8细胞培养上清及胎牛血清的RPMI-1640培养基，诱导从血液中分离的记忆性B细胞分化成为浆细胞，从而分泌出RSV特异性抗体的方法，这些抗体包括过去感染过RSV，但随着时间衰减而血清学监测不到的抗体。本发明相较于其他B细胞诱导技术，本发明需要细胞数量少，诱导效率高，针对性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法。
背景技术
记忆B细胞是在初次免疫反应后，产生IgM抗体的B细胞转为产生IgG的一种B细胞。记忆B细胞是机体重要的免疫细胞，在体液免疫中扮演着十分重要的角色,对浆细胞的产生、抗体的生成以及持久的免疫保护起关键的作用。
记忆性B细胞在接种牛痘疫苗后能持续50年，而体液中抗体通常会在抗原清除后衰减。大多数的乙肝疫苗接种者在接种后的几年内都会失去保护性抗体，但乙肝病毒特异性的记忆性B细胞可以持续存在，在乙肝病毒或疫苗再次暴露的情况下，能够提供快速保护性抗体反应。
因此，记忆性B细胞的分析可以用来鉴定特定已知抗原的过去抗体反应，从而对针对特定病原体或抗原的抗体特异性和保护免疫相关联的血清学研究形成补充。此外，记忆性B细胞的分析不仅可以鉴定出新的治疗用抗体，还开发出了一种无需使用杂交瘤细胞融合、噬菌体展示或EBV转化就可制备特异性结合已知抗原的完全人单克隆抗体的新方法。
发明内容
本发明的目的是针对血清学分析抗体表达谱的不足， 提供一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法。
本发明是利用含CpG2006、IL-2、IL-10、 B95-8细胞培养上清及胎牛血清的 RPMI-1640培养基，诱导从血液中分离的记忆性B细胞分化成为浆细胞，从而分泌出RSV特异性抗体的方法，这些抗体包括过去感染过RSV，但随着时间衰减而血清学监测不到的抗体。
本发明所述制备方法包括下列步骤：
1. 饲养细胞的制备与保存：采集人的新鲜抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出人的外周血淋巴细胞，经过60Co辐照后使人外周血淋巴细胞丧失增殖能力，从而作为人记忆性B细胞培养的饲养层细胞；
2. 诱导液的配置：按加入成分占终产物的质量体积比或体积百分比加入如下成分：2.5μg/mL的CpG2006，10ng/mL的IL-2，10ng/mL的IL-10, 体积百分比25%的B95-8细胞培养上清，体积百分比10%的胎牛血清，将以上成分加入到RPMI-1640培养基中，混匀；
3. 记忆性B细胞的诱导：将新鲜肝素钠抗凝全血样本用人淋巴细胞分离液分离，获得人外周血单个核细胞，再用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒分离获得记忆性B细胞，计数后，按照200细胞/孔的密度接种到96孔U型底培养板，每孔加入200mL的培养液和50000个饲养细胞，在37℃,5%CO2条件下培养两周，让记忆性B细胞活化成为浆细胞；
4. 浆细胞阳性孔的筛选：收集步骤（3）中的细胞培养上清，使用呼吸道合胞病毒抗原G蛋白和F蛋白包被的酶标板，采用酶联免疫吸附测定方法检测B细胞上清特异性，看是否分泌所需蛋白。
本发明的有益效果：相较于血浆抗体的分析，本发明采用体外诱导记忆性B细胞分化为浆细胞，从而分泌出RSV特异性抗体，这些抗体包括过去感染过RSV，但随着时间衰减而血清学监测不到的抗体。
附图说明
图1为人外周血单个核细胞(PBMCs)数目；
图2为B淋巴细胞数目；
图3为记忆性B淋巴细胞数目；
图4是7号阳性孔筛选结果。
具体实施方式
1、饲养细胞的制备与保存：采集人的新鲜抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出人的外周血淋巴细胞，经过60Co辐照后的人的外周血淋巴细胞丧失增殖能力，可以作为人记忆性B细胞培养的饲养层细胞。细胞计数后，于液氮罐冻存。
2、体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的细胞培养液的制备：按加入成分占终产物的质量体积比或体积百分比加入如下成分：2.5μg/mL的CpG2006，10ng/mL的IL-2，10ng/mL的IL-10,25%的B95-8细胞培养上清，10%的胎牛血清，将以上成分加入到RPMI-1640培养基中，混匀。
3、PBMCs的分离及记忆性B细胞的分选、活化培养：将新鲜肝素钠抗凝全血样本用人淋巴细胞分离液分离，获得人外周血单个核细胞（periphery blood mononuclear cell，PBMC），进行细胞计数，如图1人外周血单个核细胞(PBMCs)数目；再用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒先分离出B细胞，进行细胞计数，如图2是 B淋巴细胞数目；再从B细胞中分离获得记忆性B细胞，再进行细胞计数，如图3是记忆性B淋巴细胞数目。按照200细胞/孔的密度接种到96孔U型底培养板，每孔加入200mL的培养液和50000个饲养细胞，在37℃,5%CO2条件下培养两周，让记忆性B细胞活化成为浆细胞。
实施例2：浆细胞阳性孔的筛选
使用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测细胞上清。首先将针对Rsv的不同抗原混合检测，具体操作如下：
1、包板：用100ng/孔的GL和100ng/孔的FL包被酶标板，4℃过夜。洗板机洗板5遍。洗液为含0.05% Tween的PBS。
2、封闭：用5%脱脂奶200μL /孔，37℃封闭2h，洗板5遍。
3、加入一抗：加入适当稀释的Rsv标准抗体和活化培养的记忆性B细胞的细胞上清，同时用水和1640培养基作为阴性对照，50μL /孔，37℃放置1h。洗板5遍。
4、加入二抗：加入1:1000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG，50μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍。
5、显色：加入TMB显色液100μL/孔，室温避光显色20min，
6、终止检测：加入2Mol/L硫酸50μL/孔终止显色反应，检测OD450nm，参考波长为630nm。
其中样本7号的检测结果如图4所示。
Claims (1)
1.一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法，其特征是：
（1） 饲养细胞的制备与保存：采集人的新鲜抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出人的外周血淋巴细胞，经过60Co辐照后使人外周血淋巴细胞丧失增殖能力，从而作为人记忆性B细胞培养的饲养层细胞；
（2） 诱导液的配置：按加入成分占终产物的质量体积比或体积百分比加入如下成分：2.5μg/mL的CpG2006，10ng/mL的IL-2，10ng/mL的IL-10, 体积百分比25%的B95-8细胞培养上清，体积百分比10%的胎牛血清，将以上成分加入到RPMI-1640培养基中，混匀；
（3） 记忆性B细胞的诱导：将新鲜肝素钠抗凝全血样本用人淋巴细胞分离液分离，获得人外周血单个核细胞，再用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒分离获得记忆性B细胞，计数后，按照200细胞/孔的密度接种到96孔U型底培养板，每孔加入200mL的培养液和50000个饲养细胞，在37℃,5%CO2条件下培养两周，让记忆性B细胞活化成为浆细胞；
（4.）浆细胞阳性孔的筛选：收集步骤（3）中的细胞培养上清，使用呼吸道合胞病毒抗原G蛋白和F蛋白包被的酶标板，采用酶联免疫吸附测定方法检测B细胞上清特异性，看是否分泌所需蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410284437.2A CN104031880A (zh) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | 一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410284437.2A CN104031880A (zh) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | 一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104031880A true CN104031880A (zh) | 2014-09-10 |
Family
ID=51462878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410284437.2A Pending CN104031880A (zh) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | 一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104031880A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560873A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-04-29 | 南昌大学 | 纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性b细胞的方法 |
| CN104560874A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-04-29 | 南昌大学 | Elisa法捕获针对呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法 |
| CN105601734A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-05-25 | 广东医学院附属医院 | 一种从人外周血记忆性b淋巴细胞制备抗体的方法 |
| CN106222137A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-14 | 南昌大学 | 一种体外活化人记忆性b细胞成浆细胞的培养方法 |
| CN110396498A (zh) * | 2018-04-25 | 2019-11-01 | 重庆市畜牧科学院 | 体外活化记忆性b细胞成浆细胞的方法 |
| WO2020094121A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | Tsinghua University | Novel method for producing antibodies |
| CN111647566A (zh) * | 2019-07-10 | 2020-09-11 | 广州医科大学附属第一医院 | 一种高滴度eb病毒的制备方法、eb病毒永生化记忆性b细胞的方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101603030A (zh) * | 2009-07-14 | 2009-12-16 | 吕凌 | 一种体外扩增调节性t细胞的方法 |
| WO2010056898A2 (en) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | University Of Maryland, Baltimore | Rapid expression cloning of human monoclonal antibodies from memory b cells |
-
2014
- 2014-06-24 CN CN201410284437.2A patent/CN104031880A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010056898A2 (en) * | 2008-11-12 | 2010-05-20 | University Of Maryland, Baltimore | Rapid expression cloning of human monoclonal antibodies from memory b cells |
| CN101603030A (zh) * | 2009-07-14 | 2009-12-16 | 吕凌 | 一种体外扩增调节性t细胞的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 廖爱华 等: "人类B细胞转化为抗体分泌浆细胞的体外研究", 《中华微生物学和免疫学杂志》 * |
| 梁媛 等: "体外诱导外周血B淋巴细胞分化浆细胞方法的建立和评价", 《国际免疫学杂志》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560873A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-04-29 | 南昌大学 | 纳米磁珠法筛选呼吸道合胞病毒记忆性b细胞的方法 |
| CN104560874A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-04-29 | 南昌大学 | Elisa法捕获针对呼吸道合胞病毒记忆性B细胞的方法 |
| CN105601734A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-05-25 | 广东医学院附属医院 | 一种从人外周血记忆性b淋巴细胞制备抗体的方法 |
| CN106222137A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-14 | 南昌大学 | 一种体外活化人记忆性b细胞成浆细胞的培养方法 |
| CN110396498A (zh) * | 2018-04-25 | 2019-11-01 | 重庆市畜牧科学院 | 体外活化记忆性b细胞成浆细胞的方法 |
| WO2020094121A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | Tsinghua University | Novel method for producing antibodies |
| CN111647566A (zh) * | 2019-07-10 | 2020-09-11 | 广州医科大学附属第一医院 | 一种高滴度eb病毒的制备方法、eb病毒永生化记忆性b细胞的方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104031880A (zh) | 一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法 | |
| CN103756967B (zh) | 抗hla-g的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用 | |
| JP6466397B2 (ja) | 抗原特異的ｂ細胞の同定及び単離ならびに所望の抗原に対する抗体作製のプロトコール | |
| RU2016103262A (ru) | Способы идентификации иммунных связующих веществ поверхностных антигенов клетки | |
| CN102297968B (zh) | 辅助诊断结核病的试剂盒 | |
| CN108795869A (zh) | 一种循环肿瘤细胞阳性富集方法 | |
| Moreno et al. | MAb‐based competitive ELISA for the detection of antibodies against influenza D virus | |
| CN110981944A (zh) | 非洲猪瘟病毒t细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的elispot检测方法 | |
| Dey et al. | Human circulating antibody-producing B cell as a predictive measure of mucosal immunity to poliovirus | |
| CN104928258A (zh) | 犬细小病毒杂交瘤细胞、及单克隆抗体和应用 | |
| CN106771181A (zh) | 一种禽流感h7n9血凝素ha抗原检测 elisa 试剂盒及检测方法 | |
| CN103941018B (zh) | 一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白omp18的b细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法 | |
| CN102464716A (zh) | 一种用于猪、人和蚊子中乙型脑炎病毒抗原检测的elisa试剂盒及应用 | |
| CN106046125B (zh) | Htnv gp上的ctl表位肽及其筛选方法和应用 | |
| CN106353501A (zh) | 一种结核t细胞检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN104569387B (zh) | 一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒 | |
| Onodera et al. | Immune-focusing properties of virus-like particles improve protective IgA responses | |
| CN104020294A (zh) | 用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途 | |
| CN105136782A (zh) | 一种免疫磁微粒化学发光法hcmv ie1抗原检测试剂盒 | |
| CN106610423A (zh) | 评价疫苗疗效的细胞免疫学检测试剂盒及其储存方法 | |
| CN109061166B (zh) | 一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒 | |
| CN102520175B (zh) | 一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒 | |
| Csernalabics et al. | Efficient formation and maintenance of humoral and CD4 T-cell immunity targeting the viral capsid in acute-resolving hepatitis E infection | |
| Steinsvik et al. | Human IgE production in hu-PBL-SCID mice injected with birch pollen and diesel exhaust particles | |
| CN103146714A (zh) | 一种结核分枝杆菌cfp10抗原蛋白串联重组表达方法及其在结核检测中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140910 |