CN105601734A - 一种从人外周血记忆性b淋巴细胞制备抗体的方法 - Google Patents

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潘庆军
刘华锋
吴平
谢彤
廖焕金
蔡珺
张莉芳
彭艳霞
陈秋华
杨陈
安宁
陈锦霞
王淑君
吴洪銮
李尚妹
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Abstract

本发明提供了一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法，本发明提供的方法具有方便快捷、低成本的优势，采用该方法能在体外制备大量抗体，所制备抗体在预防感染和治疗免疫缺陷病中非常重要。

Description

一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法
技术领域
本发明涉及一种抗体的制备方法，具体涉及一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法。
背景技术
抗原特异性的单克隆或多克隆免疫球蛋白制剂在预防感染和治疗免疫缺陷病中非常重要(NatRevImmunol,2010,10(5):301-316)。目前，临床上应用的免疫球蛋白制剂基本都分离自志愿者血浆(BioDrugs,2010,24(4):211-223)。其来源受限，不同批次或来源的质量不同，且存在潜在的感染因素(AdvClinExpMed,2015,24(1):153-159)。此外，也可通过基因工程技术制备，目前治疗性抗体有人鼠嵌合体、人源化抗体和全人抗体等，存在抗原性以及制备成本高、周期长等不足之处(MAbs,2015,7(1):9-14)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将外周血记忆性B淋巴细胞悬于含体积浓度为10％～20％牛血清的细胞培养液中，在37℃、5％(V/V)的二氧化碳条件下培养；
(2)在步骤(1)培养后的细胞培养液中加入活化剂，继续培养3-10天，使外周血记忆性B淋巴细胞分化为浆细胞；
(3)将步骤(2)制备的浆细胞和在37℃、5％(V/V)的二氧化碳条件下复苏的人骨髓瘤细胞株融合，制备成杂交瘤细胞株，筛选可分泌抗原特异性的抗体的杂交瘤细胞株，通过筛选的杂交瘤细胞株分泌抗原特异性的抗体。
在前期研究中，本申请发明人发现活化剂组合(R848+IL-2+IL-4)，可显著活化记忆性B细胞，使之高效的转换为浆细胞，进而分泌大量的抗原特异性的抗体。再用人骨髓瘤细胞株与浆细胞融合制备成杂交瘤细胞株，可持续分泌大量抗体，再用特异的抗原进行筛选，从而获得大量的抗原特异性的多克隆或单克隆抗体。
优选地，所述步骤(1)中细胞培养液为DMEM、RPMI1640和DMEM/F12培养基中的一种。
优选地，所述步骤(2)中活化剂包括以下浓度的组分：0.1～30μg/mlR848、1～200ng/mlIL-2和10～200ng/mlIL-4。
优选地，所述步骤(3)中人骨髓瘤细胞株是对HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)敏感、对喹巴因和聚乙二醇耐受且不分泌抗体的人骨髓瘤细胞株。
优选地，所述步骤(3)中融合所用的融合剂是浓度为30％-70％(W/V)的聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量为1000-4000。
优选地，所述步骤(3)中抗原是接种免疫的抗原、天然感染的病原体或自身抗原。
优选地，所述步骤(3)中复苏所用的培养基是含10％～20％(V/V)牛血清的细胞培养液。
优选地，所述细胞培养液是DMEM、RPMI1640和DMEM/F12培养基中的一种。
优选地，所述步骤(3)中人骨髓瘤细胞株与浆细胞的数量比为1∶10。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法，本发明提供的方法方便快捷、低成本，采用该方法能在体外制备大量抗体的，所制备抗体在预防感染和治疗免疫缺陷病中非常重要。
附图说明
图1为本发明实施例1中复苏的人骨髓瘤细胞株生长图片；
图2为本发明实施例1中得到的杂交瘤细胞生长图片；
图3为本发明实施例1中ELISA检测杂交瘤分泌抗轮状病毒抗体的结果(实施例1中的表1是以OD.450吸光值表示图3的数字结果)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：制备抗轮状病毒抗体
(1)用商品化试剂盒(HumanMemoryBCellIsolationKit,MiltenyiBiotec)，从接种轮状病毒的志愿者外周血分离记忆性B淋巴细胞，于含10％牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃二氧化碳培养箱中培养；
(2)向步骤(1)的培养液中加入活化剂，继续培养5天，使记忆性B淋巴细胞分化为浆细胞；所述活化剂组成为：10μg/mlR848、20ng/mlIL-2和10ng/mlIL-4；
(3)复苏培养人骨髓瘤细胞株，于含10％牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5％(V/V)二氧化碳的培养箱中培养，如图1所示；
(4)将步骤(2)制备的浆细胞和步骤(3)复苏的人骨髓瘤细胞株融合，制备成杂交瘤细胞株，筛选可分泌抗轮状病毒抗体的杂交瘤细胞株，从而制备大量抗轮状病毒抗体。
步骤(4)的具体步骤如下：
①取生长状态良好的步骤(3)复苏的人骨髓瘤细胞株，800rpm离心8分钟，弃上清，计数；
②取生长状态良好的步骤(2)制备的浆细胞，800rpm离心8分钟，弃上清，计数；
③将①中人骨髓瘤细胞株与②中浆细胞按数量比为1∶10的比例混合，在50ml塑料离心管内用无血清的DMEM细胞培养液液洗1次，800rpm离心8分钟，弃上清，用滴管吸净残留液体；
④轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；
⑤60秒内加入预热的1ml50％(W/V)PEG(分子量：4000)，沿着瓶壁逐渐滴加，边加边转动离心管；静置作用100秒；
⑥加预热37℃的不含血清的RPMI1640，终止PEG的作用，每隔1分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。终体积为45ml。800rpm离心8分钟；
⑦弃上清，先用6ml含10％(V/V)牛血清、已加入1：100浓度的HAT(100×)的RPMI1640细胞培养液轻轻混悬，不能用力吹打，防止使融合在一起的细胞散开；
⑧补加完全培养液至总体积为50ml；
⑨将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，50μl/孔，于37℃、5％(V/V)二氧化碳的培养箱中培养。
⑩在细胞融合约10天后，观察细胞生长情况，如图2所示。对有较多细胞生长的孔，取上清，用轮状病毒抗体EILISA检测试剂盒(酶联免疫吸附法)筛选阳性孔，如图3和表1所示，表1是以OD.450吸光值表示图3的数字结果，进行传代，或进一步单克隆后，建成克隆株。
表1ELISA检测杂交瘤分泌抗轮状病毒抗体的结果(OD.450)(对应附图3)
实施例2：制备抗核抗体
(1)用商品化试剂盒(HumanMemoryBCellIsolationKit,MiltenyiBiotec)，从系统性红斑狼疮患者外周血分离记忆性B淋巴细胞，于含15％牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5％(V/V)二氧化碳的培养箱中培养；
(2)向步骤(1)的培养液中加入活化剂，继续培养5天，使之分化为浆细胞；所述活化剂组成为：5μg/mlR848、10ng/mlIL-2和20ng/mlIL-4；
(3)复苏培养人骨髓瘤细胞株，于含10％牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％(V/V)二氧化碳的培养箱中培养；
(4)将步骤(2)制备的浆细胞和步骤(3)复苏的人骨髓瘤细胞株融合，制备成杂交瘤细胞株，筛选可分泌抗核抗体的融合骨髓瘤细胞株，从而制备大量抗核抗体。
步骤如下：
①取生长状态良好的步骤(3)人骨髓瘤细胞株，800rpm离心5分钟，弃上清，计数；
②取生长状态良好的步骤(2)制备的浆细胞，800rpm离心5分钟，弃上清，计数；
③将①中人骨髓瘤细胞株与②中浆细胞按数量比为1∶5的比例混合，在50ml塑料离心管内用无血清的DMEM细胞培养液液洗1次，800rpm离心5分钟，弃上清，用滴管吸净残留液体；
④轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；
⑤50秒内加入预热的1ml50％PEG(W/V)(分子量：3350)，沿着瓶壁逐渐滴加，边加边转动离心管；静置作用60秒；
⑥加预热37度的不含血清的DMEM，终止PEG的作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。终体积为45ml。900rpm离心5分钟；
⑦弃上清，先用6ml含20％(V/V)牛血清、已加入1：100浓度的HAT(100×)的DMEM细胞培养液轻轻混悬，不能用力吹打，防止使融合在一起的细胞散开；
⑧补加完全培养液至总体积为50ml；
⑨将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，50μl/孔，于37℃、5％(V/V)二氧化碳的培养箱中培养。
⑩在细胞融合约10天后，观察细胞生长情况。对有较多细胞生长的孔，取上清，用抗核抗体谱IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)试剂盒(欧蒙医学实验诊断股份公司)筛选阳性孔，进行传代，或进一步单克隆后，建成克隆株。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种从人外周血记忆性B淋巴细胞制备抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将外周血记忆性B淋巴细胞悬于含体积浓度为10％～20％牛血清的细胞培养液中，在37℃、5％(V/V)的二氧化碳条件下培养；
(2)在步骤(1)培养后的细胞培养液中加入活化剂，继续培养3～10天，使外周血记忆性B淋巴细胞分化为浆细胞；其中所述活化剂包括R848、IL-2和IL-4；
(3)将步骤(2)制备的浆细胞和在37℃、5％(V/V)的二氧化碳条件下复苏的人骨髓瘤细胞株融合，制备成杂交瘤细胞株，筛选可分泌抗原特异性的抗体的杂交瘤细胞株，通过筛选的杂交瘤细胞株分泌抗原特异性的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞培养液为DMEM、RPMI1640和DMEM/F12培养基中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中活化剂包括以下浓度的组分：0.1～30μg/mlR848、1～200ng/mlIL-2和10～200ng/mlIL-4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中人骨髓瘤细胞株是对HAT敏感、对喹巴因和聚乙二醇耐受且不分泌抗体的人骨髓瘤细胞株。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中融合所用的融合剂是浓度为30％～70％(W/V)的聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量为1000～4000。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中抗原是接种免疫的抗原、天然感染的病原体或自身抗原。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中复苏所用的培养基是含10％～20％(V/V)牛血清的细胞培养液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液是DMEM、RPMI1640和DMEM/F12培养基中的一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中人骨髓瘤细胞株与浆细胞的数量比为1∶10。
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