CN104357403A - 一种抗人巨细胞病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗人巨细胞病毒单克隆抗体及其应用，属于生物制品领域。本发明采用人胚肺成纤维细胞培养人巨细胞病毒，对收获的人巨细胞病毒纯化后，免疫小鼠，取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选得到一株稳定分泌人巨细胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9558，其分泌的单克隆抗体效价高，特异性好，可用于人巨细胞病毒的检测，也可用于制备检测人巨细胞病毒的试剂盒或诊断试剂，检测结果准确率高，在人巨细胞病毒诊断领域具有较好应用前景。

Description

一种抗人巨细胞病毒单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗抗人巨细胞病毒的单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株和应用，以及制备该单克隆抗体的方法。

背景技术

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒β亚科，DNA为线状双链分子，长度约为220～240kb。该病毒可长期或间歇地从患者或隐性感染者的唾液、精液、尿液、乳液和子宫分泌物中排出。HCMV严重危害人类生殖健康，常通过性交传播，引起泌尿生殖系统、中枢神经系统、肝脏、肺、血液循环系统等病变，并可能与恶性肿瘤的发生有关。人感染HCMV相当普遍，不同国家，不同经济状况感染率不同。北美和欧洲成年人群中血清抗体阳性率为50％～80％，亚洲与非洲的人群中血清抗体阳性率接近100％。孕妇感染可导致胎儿肝脾肿大，血小板减少性紫癜及溶血性贫血，少数是先天性畸形，如小头、智力低下、神经肌肉运动障碍、耳聋、脉络膜视网膜炎等，因此是围产医学和优生学中的重大研究课题。

目前HCMV的诊断检测方法很多，病原学方法是最准确的确诊手段，但是此方法灵敏度较低，易漏检。分子生物学诊断方法对实验室条件和操作人员技术要求较高，不适于广泛应用。酶联免疫吸附法(ELISA)具有简单、快速、结果明确、操作简单和无需特殊设备等优点，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个方向。因此，为了提高检测HCMV的敏感性和特异性，建立一种快速、简易和特异性好的诊断方法是十分必要的，而高亲和力单克隆抗体是其前提。

在已报道的抗HCMV单克隆抗体制备的方法中，根据时间的先后，可以分为两个阶段。2000年以前制备抗HCMV单克隆抗体的方法主要通过免疫全病毒来制备，这个阶段在抗原纯化方面做的比较简单，通常是在收获病毒后去除细胞碎片，之后就进行免疫，更有甚者直接用细胞病毒液免疫小鼠，该阶段的主要缺点是免疫小鼠的抗原纯度不高。2000年以后，制备抗HCMV单克隆抗体方向发生了改变，研究者主要从HCMV的某一个蛋白为研究点，研究针对HCMV某个蛋白的单克隆抗体，与全病毒颗粒相比，单个蛋白的免疫原性要低。

发明内容

本发明的目的在于提供能够稳定分泌高效抗人巨细胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的在于提供一种生物活性高、特异性高的抗人巨细胞病毒单克隆抗体，用于检测人巨细胞病毒。

为了达到上述目的，本发明首先提供一株抗人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9558。该杂交瘤细胞株已于2014年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.9558。

本发明提供了由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

上述单克隆抗体在制备检测人巨细胞病毒试剂盒中的应用属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，含有保藏编号为CGMCC No.9558的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

本发明还提供了一种用于检测人巨细胞病毒抗体的试剂盒，含有上述单克隆抗体。

含有保藏编号为CGMCC No.9558的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体的诊断试剂属于本发明的保护范围。

保藏编号为CGMCC No.9558的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗人巨细胞病毒药物中的应用属于本发明的保护范围。

由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备预防或治疗人巨细胞病毒药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种制备抗人巨细胞病毒单克隆抗体的方法，是采用人胚肺成纤维细胞培养人巨细胞病毒，收获的病毒纯化后免疫小鼠。

本发明方法中，使用的人胚肺成纤维细胞是已经商品化应用的保藏编号为CGMCC.4875的人胚肺成纤维细胞。

上述方法中，用含8％～10％的新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后弃掉原培养液，换成含1％～3％新生牛血清MEM培养，再接种人巨细胞病毒，接种MOI为0.01～0.1，5～7天收获人巨细胞病毒。

含8％～10％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后

优选地，接种MOI为0.05，6天收获人巨细胞病毒。

在纯化前还需对收获的人巨细胞病毒进行灭活。

在本发明的一个实施例中，灭活方法是用0.17mg/ml的甲醛在35～40℃环境中灭活48h。

上述方法中，对收获的人巨细胞病毒纯化方法为：将收获的人巨细胞病毒液离心去除细胞碎片；1μm滤器过滤，去除较大的杂质。

上述离心条件为，5000～8000r/min离心30～60min；再通过蔗糖密度梯度离心进行用30％和55％的蔗糖30000r/min离心12～16h，对离心获得的HCMV用0.01mol/L PBS离心洗涤脱糖。

进一步地，本发明提供了一种用于制备人巨细胞病毒单克隆抗体的免疫抗原的方法，具体方法为：用含8％～10％的新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后接种人巨细胞病毒，接种MOI为0.01～0.1，5～7天收获人巨细胞病毒液；灭活病毒液后对其进行纯化，将收获的人巨细胞病毒液离心，去除细胞碎片；1μm滤器过滤，去除较大的杂质，离心条件为，5000～8000r/min离心30～60min；再通过蔗糖梯度离心进行用30％和55％的蔗糖30000r/min离心12～16h，对离心获得的HCMV用0.01mol/L PBS离心洗涤脱糖。

本发明的实施例中，将纯化后的人巨细胞病毒免疫抗原共免疫小鼠4次。免疫后检测抗体效价，若抗体效价不低于1：10000，采用纯化后的人巨细胞病毒腹腔冲击小鼠，采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合技术筛选分泌抗人巨细胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明筛选得到一株稳定分泌人巨细胞病毒单克隆合适的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9559，其分泌的单克隆抗体效价高，可达10⁵，特异性好，可用于人巨细胞病毒的检测，也可用于制备检测人巨细胞病毒的试剂盒或诊断试剂，检测结果准确率高，在人巨细胞病毒诊断领域具有较好应用前景。

附图说明

图1为接种人巨细胞病毒96h的人胚肺成纤维细胞(×100倍)。

图2为SDS-PAGE鉴定实施例3的已纯化的单抗。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例中使用的人胚肺成纤维细胞保藏编号为4875。BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1 免疫原制备与动物免疫

1、用人胚肺成纤维细胞培养人巨细胞病毒(见图1)，并对收获的人巨细胞病毒进行浓缩纯化。

人巨细胞病毒培养：用含8％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后接种人巨细胞病毒，接种MOI为0.3，并换用含1％新生牛血清MEM培养人巨细胞病毒，6天后收获人巨细胞病毒。收获的人巨细胞病毒经37℃甲醛灭活48h，所述甲醛为0.17mg/ml甲醛溶液。

人巨细胞病毒纯化：将收获的人巨细胞病毒液离心5000r/min离心30min，去除细胞碎片；1μm滤器过滤，去除较大的杂质；再通过蔗糖梯度离心进行用30％和55％的蔗糖30000r/min离心12h，对离心获得的HCMV用0.01mol/L PBS离心洗涤脱糖。Lowry法测得蛋白浓度为200μg/ml。

2、纯化好的人巨细胞病毒(200μg/ml)与弗氏完全佐剂各取1mL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只。

加强免疫；首次免疫后的第14天、28天用200μg/mL的人巨细胞病毒和弗氏不完全佐剂各取1mL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0.2mL/只。首次免疫后35天睛框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价。抗体效价为1:32768，不低于1：10000。

实施例2 细胞融合与建株

实施例1方法得到的免疫原的抗体效价均符合制备腹水的要求。本实施例采用实施例1方法制得的人巨细胞病毒对小鼠进行腹腔冲击，200μg/mL的人巨细胞病毒注射到BALB/c小鼠腹腔，0.1mL/只。

(1)骨髓瘤细胞的准备：细胞融合前两周复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天将细胞培养液去除，重新添加培养液。

(2)脾细胞制备：处死进行动物免疫的小鼠，按照常规方法制备小鼠脾细胞悬液。

(3)根据计数结果将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0分别加入适量无血清1640培养液，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞吹打均匀。

(4)将脾细胞与SP2/0细胞按2:1(可在2:1～5:1范围内选择)的比例混合于一支50ml离心管中，混匀。

(5)加无血清1640培养液至50ml，1500rpm离心5min，将上清尽量倒净，可用移液器将管口液体吸净。

(6)轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置于37℃水浴，准备融合。

(7)将37℃保温的1ml PEG1500，用滴管缓慢滴入离心管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。

(8)静置90s，立即在3min内缓慢加入15ml无血清的1640培养基(37℃)，尽可能不搅动细胞。

(9)1500rpm离心5min，弃去上清。

(10)加入含10％胎牛血清的1640培养液，轻轻混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，每孔100μl。

(11)将培养板放到37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(12)融合第2天，添加HAT培养液，每孔100μl。

(13)每2～3天换一次HAT培养液，连续两周观察杂交瘤是否出现，两周后换用HT培养基，观察融合细胞的生长状况。

(14)杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞覆盖孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。

(15)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系，命名为HCMV-F1。将杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号CGMCC NO.9558，分类命名为：人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏时间：2014年8月12日；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

实施例3 单抗细胞株腹水制备与抗体效价检测及单抗的纯化

按常规方法将冻存的实施例2获得的杂交瘤细胞进行复苏，培养到细胞覆盖瓶底的80％左右时摇下细胞，计数5×10⁶个/mL，腹腔免疫BALB/c小鼠，0.5mL/只，制备腹水。

人巨细胞病毒单抗腹水鉴定：采用间接ELISA法检测抗体的效价。人巨细胞病毒5μg/ml包被过夜后检测腹水的抗体效价，抗体效价为10⁵。具体结果见表1。

表1腹水中抗体效价检测结果

单抗纯化：将腹水经滤纸过滤初步去除杂质，用0.45μm的微孔滤器过滤腹水，进一步去除杂质。将腹水经Protein A层析柱进一步纯化，获得高纯度的单克隆抗体。将纯化的单克隆抗体经SDS-PAGE鉴定，结果见图2。

实施例4 人巨细胞病毒多克隆抗体的制备与纯化

用实施例1中得到的人巨细胞病毒抗原制备的方法获得的人巨细胞病毒做为抗原，免疫日本大耳白兔5只，免疫量按人巨细胞病毒200μg/只，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，颈背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔14天。通过心脏采血，37℃放置1h，4℃过夜，让血清自然析出。

将待提取的血清经4℃13000rpm离心30min，收集上清。取20mL上清与等体积的PBS溶液混合，一边搅拌一边缓慢滴加40mL饱和硫酸铵于4℃过夜，使蛋白充分沉淀。4℃，13000rpm离心10min，弃上清，用12mL PBS溶解沉淀，再缓慢滴加8mL饱和硫酸铵，同时搅拌，4℃反应1h。4℃，13000rpm离心10min，弃上清，用13mLPBS溶解沉淀，滴加7mL饱和硫酸铵，4℃反应1h。4℃，13000rpm离心10min，弃上清，离心后所得沉淀用少许PBS(pH7.4)溶解。溶解液用超滤管进行超离，脱盐，浓缩，加甘油-20℃保存备用。

实施例5 双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测人巨细胞病毒

(1)0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释实施例3制得的人巨细胞病毒单抗至包被浓度1μg/mL，加入酶标板100μL/孔，4℃过夜，甩干，用0.01mol/L PBST洗板3次。

(2)用10％小牛血清的PBS(0.01mol/L pH7.4)封闭，200μL/孔，37℃2h，甩干。

(3)加入人巨细胞病毒样品，5μg/mL、500ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、1ng/mL的待测样本各100μL/孔，并设置阴性对照，37℃孵育1h。

(4)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干；将实施例4制得的人巨细胞病毒多抗300倍稀释后加入酶标板(100μL/孔)，37℃1h。

(5)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干，加入20000倍稀释的商品化的HRP标记的羊抗兔二抗各100μL/孔，37℃1h。

(6)0.01mol/L PBST洗板5次，甩干，TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10min。

(7)加入2mol/L的硫酸50μL/孔终止反应，酶标仪630nm测吸光度。终点稀释法确定ELISA灵敏度：阴性样品为0.01mol/LPBST，检测灵敏度以样品值OD₆₃₀值为阴性值2倍的人巨细胞病毒样品浓度。

(8)该结果显示此ELISA方法的最低检测限为50ng/mL，对应的OD₆₃₀值为0.227。

实施例6 双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测人巨细胞病毒的特异性实验

(1)0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释实施例3制得的HCMV单抗至包被浓度1μg/mL，加入酶标板100μL/孔，4℃过夜，甩干，用PBST洗板3次。

(2)用10％小牛血清的PBS(0.01mol/L pH7.4)封闭，200μL/孔，37℃2h，甩干。

(3)加入HCMV、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒、EB病毒各100μL/孔，并设置阴性对照，37℃孵育1h。

(4)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干；将实施例4制得的HCMV多抗500倍稀释后加入酶标板(100μL/孔)，37℃1h。

(5)0.01mol/L PBST洗板3次，甩干，加入20000倍稀释的商品化的HRP标记的羊抗兔二抗各100μL/孔，37℃1h。

(6)0.01mol/L PBST洗板5次，甩干，TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10min。

(7)加入2mol/L的硫酸50μL/孔终止反应，于630nm测吸光度。终点法读值：阴性样品为PBST，检测灵敏度以样品值OD₆₃₀值为阴性值2倍的HCMV样品浓度。

(8)结果见表2，表2显示此ELISA方法特异性强，只能检测HCMV，与单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒、EB病毒无交叉。

表2本发明单抗的特异性实验

实施例7 本发明单克隆抗体亚类测定

用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测实例3得到的单抗，按照试剂盒的说明书操作，结果显示实例3得到的单抗属于IgG1。

实施例8 杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测

把冻存的杂交瘤细胞株HCMV-F1复苏，传至20代，分别在第1代、第5代、第10代、第15代和第20代细胞长到80％时取细胞上清，采用间接ELISA法检测细胞上清抗体的效价。HCMV 5μg/ml包被过夜后检测细胞上清的抗体效价，结果见表3。

表3本发明杂交瘤细胞系分泌单抗的稳定性检测结果

由表3可知，从实施例2获得的杂交瘤细胞株HCMV-F1传20代后分泌单克隆抗体的能力没有发生明显变化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.抗人巨细胞病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9558。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人巨细胞病毒试剂盒中的应用。

4.一种用于检测人巨细胞病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

5.一种用于检测人巨细胞病毒抗体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

6.含有权利要求2所述单克隆抗体的诊断试剂。

7.权利要求1所述杂交瘤细胞株或权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或治疗人巨细胞病毒药物中的应用。

8.一种制备抗人巨细胞病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，采用人胚肺成纤维细胞培养人巨细胞病毒，收获的病毒纯化后免疫小鼠。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用含8％～10％的新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后接种人巨细胞病毒，接种MOI为0.01～0.1，5～7天收获人巨细胞病毒。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，对收获的人巨细胞病毒纯化方法为：将收获的人巨细胞病毒液离心，去除细胞碎片；1μm滤器过滤，去除较大的杂质。