CN104628847A - 一种人IgG4型抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人IgG4型抗体及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明人IgG4型抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)采集患同种疾病患者的外周血，制备血浆或血清或者浆细胞培养的上清液；(2)制备以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱；(3)通过亲和层析柱，纯化人IgG4型抗体。通过本发明人IgG4型抗体的制备方法，可获得具有个体或者同种疾病特征人IgG4型抗体；并且由于采用亲和层析柱进行分离，分离效果好，特异性高，纯化后制得的IgG4型抗体纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体及其制备方法与应用，具体涉及一种人IgG4型抗体及其制备方法与应用。
背景技术
机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤所引起的疾病称之为自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)等，其致病机制主要是由于各种原因诱发的自身抗原暴露和释放，进而被免疫系统的抗原提呈细胞(如树突状细胞、巨噬细胞等)识别，提呈给T细胞，并使之活化，而活化后的T细胞和B细胞相互作用，并促进B细胞的增值、活化及分泌自身抗体。自身抗体和自身抗原结合，沉积在组织中(如肾脏、皮肤等)，进而诱发补体活化等级联反应，造成组织损伤，这是自身免疫性疾病的核心发病机制。目前，生物制剂在自身免疫性疾病中的应用相当广泛，主要靶标是B和T淋巴细胞(Drug Development Research.2011,72(7):585-597；Nat Clin Pract Neurol.2008,4(10):557-567)以及致炎性信号分子(如IL-6，TNF-α等)发挥作用，而靶向自身抗原的生物制剂极少。其主要原因是自身抗原种类较多，且不同的自身免疫性疾病，其自身抗原的种类也不同，这就为靶向自身抗原的治疗策略增加了难度。
机体被外源性抗原致敏后，当再次受到相同抗原刺激时表现出敏感性的增高或反应性的增强是过敏性疾病(Allergic diseases)的发病特点。决定此类疾病临床和病理表现的两个关键因素为：免疫应答的类型和激发超敏反应抗原的性质及定位。超敏反应可分为4型，将Ig介导的超敏反应分为I型、II型和III型，而将淋巴细胞介导的超敏反应称为IV型。过敏反应的发生须具备三个条件：第一过敏原的存在；第二致敏机体；第三上述两者密切接触，三者缺一不可。目前，过敏性疾病中应用的生物制剂主要针对IgE，如奥马佐单抗(Omalizumab)，靶向过敏原的生物制剂却极少。其主要原因是过敏原种类较多，且不同的地区，不同时间，其过敏原的种类也可能不同，这就为靶向过敏原的治疗策略增加了难度。
人类抗体根据其结构的不同，分为五种，即IgG、lgA、lgM、IgD和lgE。其中IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清抗体的80％，其40～50％分布于血清中，其余分布在组织中，而且IgG的半衰期最长，可达20～23天。根据IgG分子中的γ链抗原性的差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG4在正常人体内含量极低(4％～6％)(Eur J Immunol,1996,26(7):1511-1518)，且其铰链区的氨基酸组成和结构与其他IgG亚型明显不同，该区位于Fab和两条重链C末端(CH2和CH3)之间，这决定了IgG4分子对C1q和Fcγ受体的结合力较低，且不能激活补体的经典激活途径(Exp Med.1991,173(4):1025-1028)。但IgG4对靶抗原的亲和力和其他亚型没有差异，进而具有封闭抗原表位进而抑制其它亚型的抗体(如IgG1、IgG2、IgG3和IgE等)免疫复合物的形成；由于不能激活补体的经典激活途径，从而可避免免疫复合物激活补体造成的组织损伤，也能抑制过敏原-IgE型抗体免疫复合物活化嗜碱性粒细胞和肥大细胞造成的组织损伤。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷而提供一种具有个体或同种疾病特征的人IgG4型抗体及其制备方法与应用，本发明的人IgG4型抗体可抑制能与血清补体结合的免疫复合物的形成。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人IgG4型抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备血浆或血清或者浆细胞培养的上清液：采集同种疾病患者的外周血，离心，制得血浆或血清；或者在同种疾病患者的外周血中加入抗凝剂后，离心分离，获得外周血单个核细胞，再采用免疫磁珠分离制得B细胞，最后在体外诱导B细胞为浆细胞，并获得浆细胞培养的上清液；
(2)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为7.8～8.0的缓冲溶液A封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用pH值为2.5～3.0的缓冲溶液B、pH值为7.2～7.6的PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；
(3)纯化人IgG4型抗体：将步骤(1)制得的血浆或血清，或者浆细胞培养的上清液加入步骤(2)制得的亲和层析柱中，以pH值为7.2～7.6的PBS洗柱，再用pH值为2.5～3.0的缓冲溶液C洗脱人IgG4型抗体，收集洗脱液，并向其中加入pH值为8.8～9.0的缓冲溶液D将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
本发明采集同种疾病患者(包括同一个体或者患同种疾病的群体)的外周血来制备血浆或血清，或者浆细胞培养的上清液，并通过亲和层析柱进行分离，获得了具有个体或者同种疾病特征人IgG4型抗体。其中，本发明在体外诱导B细胞为浆细胞，可分泌具有个体或者同种疾病特征的抗体谱，能在体外获取大量的人IgG4型抗体；本发明以血浆或血清制备人IgG4型抗体，制备方法简单，可满足对少量人IgG4型抗体的需求。
本发明采用亲和层析柱进行分离，分离效果好，特异性高，纯化后制得的IgG4型抗体纯度高。
作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，抗凝剂为EDTA-K2或肝素；在同种疾病患者的外周血中加入抗凝剂后，优选用淋巴细胞分离液进行离心分离，获得外周血单个核细胞；采用免疫磁珠分离制得B细胞时，优选免疫磁珠负选法。
作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，体外诱导B细胞为浆细胞，并获得浆细胞培养的上清液的方法包括下述步骤：将DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)完全培养液置于温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中，并将制得的B细胞转化为浆细胞后于DMEM完全培养液中培养3周，培养过程中每2～4天更换一次培养液，收集每次更换的培养液上清，即得浆细胞培养的上清液；其中，所述DMEM完全培养液中含有质量百分比为5～10％的胎牛血清，并加入了细胞因子和浓度为2～20μg/mL的美洲商陆丝裂原(PWM)；所述细胞因子由下述浓度的组分组成：20-100ng/mL白细胞介素-2(IL-2)、20-200ng/mL白细胞介素-10(IL-10)、100-500ng/mL CD40L、50-200ng/mL白细胞介素-4(IL-4)、50-200ng/mL白细胞介素-13(IL-13)和10-100ng/mL白细胞介素-5(IL-5)。
作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的优选实施方式，所述DMEM完全培养液中还加入下述浓度的抗体：10～100ng/ml anti-IFN-γ、10～100ng/mlanti-IL-12、10-100ng/ml anti-IL-17和10-100ng/ml anti-TGF-β。
作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的优选实施方式，所述将制得的B细胞转化为浆细胞的方法为：采用永生化技术手段处理制得的B细胞，将B细胞转化为永生化的浆细胞。作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的更优选实施方式，所述永生化技术手段为通过EB病毒、SV40病毒转染或者通过构建含端粒酶催化亚基的表达载体转染。制备永生化的浆细胞，可获得大量的IgG4型抗体。
作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，NaHCO3溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，pH值为8.2～8.4。
作为本发明所述人IgG4型抗体的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)和所述步骤(3)中，PBS的浓度均为0.01～0.05mol/L，且PBS中含有0.5mol/LNaCl；所述步骤(2)中，缓冲溶液A为0.05-0.2mol/L Tris-HCl，缓冲溶液B为0.05-0.15mol/L Gly-HCl；所述步骤(3)中，缓冲溶液C为0.05-0.15mol/LGly-HCl，缓冲溶液C的洗脱体积为5～10个柱床体积，缓冲溶液D为0.5-1mol/LTris-HCl，PBS洗柱的体积为5～10个柱床体积。
同时，本发明还提供了由上述方法制备得到的人IgG4型抗体及所述人IgG4型抗体在抑制能与血清补体结合的免疫复合物的形成中的应用。
本发明的有益效果为：本发明采集患同种疾病的人(包括同一个体或者患同种疾病的群体)的外周血来制备血浆或血清或者浆细胞培养的上清液，并通过亲和层析柱进行分离，获得了具有个体或者同种疾病特征人IgG4型抗体。由于采用亲和层析柱进行分离，分离效果好，特异性高，纯化后制得的IgG4型抗体纯度高。
本发明制备的人IgG4型抗体对靶抗原的亲和力和其他亚型的抗体(如IgG1、IgG2、IgG3、IgE)没有差异，但不能激活补体经典途径；该人IgG4型抗体不仅能封闭抗原，进而抑制其它亚型免疫复合物(如IgG1、IgG2、IgG3和IgE型抗体与自身抗原或过敏原形成的免疫复合物)的形成，还可避免激活补体，或抑制嗜碱性粒细胞和肥大细胞的活化造成的组织损伤，在自身免疫性疾病和过敏性疾病的治疗中起到保护作用。
本发明对临床上现行的治疗方法也有一定的借鉴意义，包括：①临床上现用免疫吸附治疗疾病(如自身免疫性疾病系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等)时，对免疫球蛋白的吸附去除应具有选择性，应避免将具有封闭自身抗原，进而起到保护作用的IgG4型抗体吸附去除；②给(同一个体或同种类型疾病)患者(如自身免疫性疾病系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等)注射免疫球蛋白时，通过本发明所获得的IgG4型抗体，有望起到封闭自身抗原，阻断致病性免疫复合物(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgM和IgE等)的形成，起到保护性的治疗作用；③本发明可制备IgG4型抗体，具有易获取、不具有免疫原性等优点，是一种可防治免疫复合物所致疾病(包括自身免疫性疾病和过敏性疾病等)的生物制剂。
附图说明
图1为本发明实施例6所述上层血浆中免疫复合物含量测定的结果图；
图2为本发明实施例7所述上层血浆中免疫复合物含量测定的结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明人IgG4型抗体的制备方法的一种实施例，本实施例所述人IgG4型抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备血浆：采集系统性红斑狼疮(SLE)患者的外周血，加入抗凝剂后离心，制得血浆；
(2)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为8.0、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；其中，Gly-HCl的pH值为2.5、浓度为0.15mol/L，PBS的pH值为7.4、浓度为0.03mol/L，且PBS中含有0.5mol/LNaCl；
(3)纯化人IgG4型抗体：将步骤(1)制得的血浆加入步骤(2)制得的亲和层析柱中，先用pH值为7.4的PBS洗柱，PBS的浓度为0.03mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl，PBS的洗脱体积为8个柱床体积；再用pH值为2.5、浓度为0.15mol/L的Gly-HCl洗脱人IgG4型抗体，洗脱体积为8个柱床体积；收集洗脱液，并向其中加入pH值为9.0、浓度为0.5mol/L的Tris-HCl将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
实施例2
本发明人IgG4型抗体的制备方法的一种实施例，本实施例所述人IgG4型抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备血清：采集鸡卵清白蛋白过敏患者的外周血，37℃静置30分钟，离心，制得血清；
(2)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为7.8、浓度为0.2mol/L的Tris-HCl封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；其中，Gly-HCl的pH值为3.0、浓度为0.05mol/L，PBS的pH值为7.2、浓度为0.05mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl；
(3)纯化人IgG4型抗体：将步骤(1)制得的血清加入步骤(2)制得的亲和层析柱中，先用pH值为7.2的PBS洗柱，PBS的浓度为0.01mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl，PBS的洗脱体积为10个柱床体积；再用pH值为3.0、浓度为0.05mol/L的Gly-HCl洗脱人IgG4型抗体，洗脱体积为10个柱床体积；收集洗脱液，并向其中加入pH值为8.8、浓度为1mol/L的Tris-HCl将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
实施例3
本发明人IgG4型抗体的制备方法的一种实施例，本实施例所述人IgG4型抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备人B细胞：采集系统性红斑狼疮(SLE)患者的外周血，加入EDTA-K2抗凝，并用淋巴细胞分离液进行离心分离，获得外周血单个核细胞；再采用商品化的B细胞正选(阳选)或负选(阴选)试剂盒(Miltenyi Biotec,STEMCELL Technologies公司可提供)分离纯化B细胞；
(2)体外诱导B细胞为浆细胞并培养浆细胞：将DMEM完全培养液置于温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中，通过EB病毒或SV40病毒转染将步骤(1)所得的B细胞转化为永生化的浆细胞，并将制得的浆细胞于所述DMEM完全培养液中培养3周，培养过程中每2～4天更换一次培养液，收集每次更换的培养液上清，即得浆细胞培养的上清液；其中，所述DMEM完全培养液中含有质量百分比为10％的胎牛血清，并加入了细胞因子和浓度为2μg/mL的美洲商陆丝裂原；所述细胞因子由下述浓度的组分组成：100ng/mL白细胞介素-2、20ng/mL白细胞介素-10、100ng/mL CD40L、200ng/mL白细胞介素-4、200ng/mL白细胞介素-13和100ng/mL白细胞介素-5；
(3)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为7.9、浓度为0.12mol/L的Tris-HCl封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；其中，Gly-HCl的pH值为2.8、浓度为0.10mol/L，PBS的pH值为7.6、浓度为0.0mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl；
(4)纯化人IgG4型抗体：将步骤(2)制得的浆细胞培养的上清液加入步骤(3)制得的亲和层析柱中，先用pH值为7.6的PBS洗柱，PBS的浓度为0.05mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl，PBS的洗脱体积为5个柱床体积；再用pH值为2.8、浓度为0.10mol/L的Gly-HCl洗脱人IgG4型抗体，洗脱体积为5个柱床体积；收集洗脱液，并向其中加入pH值为8.9、浓度为0.8mol/L的Tris-HCl将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
在本实施例的步骤(2)中，体外诱导B细胞为浆细胞时，培养液中还可加入下述浓度的抗体：10ng/ml anti-IFN-γ、100ng/ml anti-IL-12、50ng/ml anti-IL-17和50ng/ml anti-TGF-β。
实施例4
本发明人IgG4型抗体的制备方法的一种实施例，本实施例所述人IgG4型抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备人B细胞：采集鸡卵清白蛋白过敏患者的外周血，加入肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液进行离心分离，获得外周血单个核细胞；采用商品化的B细胞正选(阳选)或负选(阴选)试剂盒(Miltenyi Biotec,STEMCELL Technologies公司可提供)分离纯化B细胞；
(2)体外诱导B细胞为浆细胞并培养浆细胞：通过EB病毒或SV40病毒转染将所得的B细胞转化为永生化的浆细胞，并将制得的浆细胞于DMEM完全培养液中，在37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中培养3周，培养过程中每2～4天更换一次培养液，收集每次更换的培养液上清，得到浆细胞培养的上清液；其中，所述DMEM完全培养液中含有质量百分比为5％的胎牛血清，并加入了细胞因子和浓度为12μg/mL的美洲商陆丝裂原；所述细胞因子由下述浓度的组分组成：20ng/mL白细胞介素-2、200ng/mL白细胞介素-10、500ng/mL CD40L、120ng/mL白细胞介素-4、50ng/mL白细胞介素-13和10ng/mL白细胞介素-5；
(3)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为8.0、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；其中，Gly-HCl的pH值为2.5、浓度为0.15mol/L，PBS的pH值为7.4、浓度为0.03mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl；
(4)纯化人IgG4型抗体：将步骤(2)制得的浆细胞培养的上清液加入步骤(3)制得的亲和层析柱中，先用pH值为7.4的PBS洗柱，PBS的浓度为0.03mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl，PBS的洗脱体积为8个柱床体积；再用pH值为2.5、浓度为0.15mol/L的Gly-HCl洗脱人IgG4型抗体，洗脱体积为8个柱床体积；收集洗脱液，并向其中加入pH值为9.0、浓度为0.5mol/L的Tris-HCl将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
在本实施例的步骤(2)中，体外诱导B细胞为浆细胞时，培养液中还可加入下述浓度的抗体：100ng/ml anti-IFN-γ、50ng/ml anti-IL-12、10ng/ml anti-IL-17和100ng/ml anti-TGF-β。
实施例5
本发明人IgG4型抗体的制备方法的一种实施例，本实施例所述人IgG4型抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)制备人B细胞：采集鸡卵清白蛋白过敏患者的外周血，加入肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液进行离心分离，获得外周血单个核细胞；采用商品化的B细胞正选(阳选)或负选(阴选)试剂盒(Miltenyi Biotec,STEMCELL Technologies公司提供)分离纯化B细胞；
(2)体外诱导B细胞为浆细胞并培养浆细胞：通过构建含端粒酶催化亚基的表达载体转染所得的B细胞，使之转化为永生化的浆细胞，并将制得的浆细胞于DMEM完全培养液中，在37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中培养3周，培养过程中每2～4天更换一次培养液，收集每次更换的培养液上清，得到浆细胞培养的上清液。其中，所述DMEM完全培养液中含有质量百分比为8％的胎牛血清、并加入了细胞因子和浓度为20μg/mL的美洲商陆丝裂原；所述细胞因子由下述浓度的组分组成：60ng/mL白细胞介素-2、100ng/mL白细胞介素-10、300ng/mL CD40L、50ng/mL白细胞介素-4、120ng/mL白细胞介素-13和50ng/mL白细胞介素-5；
(3)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为7.8、浓度为0.2mol/L的Tris-HCl封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用Gly-HCl和PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；其中，Gly-HCl的pH值为3.0、浓度为0.05mol/L，PBS的pH值为7.2、浓度为0.05mol/L，且PBS中含有0.5mol/LNaCl；
(4)纯化人IgG4型抗体：将步骤(2)制得的浆细胞培养的上清液加入步骤(3)制得的亲和层析柱中，先用pH值为7.2的PBS洗柱，PBS的浓度为0.01mol/L，且PBS中含有0.5mol/L NaCl，PBS的洗脱体积为10个柱床体积；再用pH值为3.0、浓度为0.05mol/L的Gly-HCl洗脱人IgG4型抗体，洗脱体积为10个柱床体积；收集洗脱液，并向其中加入pH值为8.8、浓度为1mol/L的Tris-HCl将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
在本实施例的步骤(2)中，体外诱导B细胞为浆细胞时，培养液中还可加入下述浓度的抗体：50ng/ml anti-IFN-γ、10ng/ml anti-IL-12、100ng/ml anti-IL-17和10ng/ml anti-TGF-β。
实施例6：来源于自身免疫性疾病SLE患者的IgG4型抗体的应用
我们通过采集自身免疫性疾病—系统性红斑狼疮(Systemic LupusErythematosus,SLE)中患者的外周血，并加入本发明实施例3所述方法制备的抗体，考察了本发明所述方法制备的IgG4型在的应用，具体考察方法包括以下步骤：
①用EDTA-K2或肝素抗凝真空采血管采集5mLSLE患者的外周血；
②取4组步骤①所得的外周血，每组外周血中均加入0.1～5μg核蛋白(用Thermo Scientific NEPER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒提取人单个核细胞获得)；同时，向3组外周血中分别加入0.1μg、1μg、5μg本发明实施例3所述方法制备的IgG4型抗体，第4组外周血中不加IgG4型抗体；将四组外周血于37℃摇床上反应15-45分钟，再以200～400×g的速度离心10-30分钟，取上层血浆；
③用商品化的C4d固相法ELISA试剂盒(Immune Complex Assay by C4dBinding)测定步骤②制得的上层血浆中免疫复合物的含量(检测方法的基本原理：将待检上层血浆加入到包被有血清补体C4d的微量反应板(即ELISA板孔)中，待检上层血浆中免疫复合物和血清补体C4d结合，再与酶标记抗人IgG反应，以标准品为参考，通过底物颜色的深浅判断免疫复合物的存在并用酶标仪测定其含量。
上述步骤②制得的上层血浆中免疫复合物的含量测定结果如图1所示，图中，正常对照组表示外周血中未加入IgG4型抗体；加入IgG4组的低、中和高分别表示外周血中加入0.1μg、1μg、5μg IgG4型抗体；加入IgG4组的低、中和高三组分别与正常对照组相比，P<0.05。结果表明：加入本发明实施例3所述方法制备的IgG4型抗体后，上层血浆中免疫复合物含量显著低于正常组。由此可知，来源于自身免疫性疾病SLE患者B细胞的IgG4型抗体可显著抑制能结合血清补体C4d的IgG型免疫复合物的形成。
实施例7：来源于鸡卵清白蛋白过敏患者的IgG4型抗体的应用
我们通过采集鸡卵清白蛋白过敏患者的外周血，并加入本发明实施例4或实施例5所述方法制备的抗体，考察了本发明所述方法制备的IgG4型的应用，具体考察方法包括以下步骤：
①用EDTA-K2或肝素抗凝真空采血管采集5mL确诊为对鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)过敏的患者的外周血；
②取4组步骤①所得的外周血，每组外周血中均加入0.1～5μg OVA抗原；同时，向3组外周血中分别加入0.1μg、1μg、5μg本发明实施例4或实施例5所述方法制备的IgG4型抗体，第4组外周血中不加IgG4型抗体；将四组外周血于37℃摇床上反应15-45分钟；然后，将每组外周血分成2份，其中一份为500μL，用嗜碱性粒细胞活化检测试剂盒(流式细胞术法)(BASOTESTTM,Glycotope Biotechnology GmbH,德国)，参考厂家说明书检测嗜碱性粒细胞的活化情况(Clinical and Molecular Allergy 2005,3:9)，以200～400×g的速度离心另一份体积为4.5mL的外周血，离心时间为10-30分钟，取上层血浆；
③用商品化的C4d固相法ELISA试剂盒(Immune Complex Assay by C4dBinding)测定步骤②制得的上层血浆中免疫复合物的含量，检测方法及其原理同实施例6中的步骤③，不同之处在于：二抗为酶标记的抗人IgE，以确保所检测免疫复合物为IgE型抗体免疫复合物。
上述步骤②中，用嗜碱性粒细胞活化检测试剂盒(流式细胞术法)(BASOTESTTM,Glycotope Biotechnology GmbH,德国)检测嗜碱性粒细胞的活化情况的结果如表1所示(表1中以活化比例表示嗜碱性粒细胞的活化情况，活化比例的计算方式为：CD63阳性为活化的嗜碱性粒细胞，其占总嗜碱性粒细胞的比例，即为活化比例，用百分比％表示)。
表1
表1的结果表明：来源于鸡卵清白蛋白过敏患者B细胞的IgG4型抗体可显著抑制OVA过敏原和IgE型抗体形成的免疫复合物对嗜碱性粒细胞的活化。
上述步骤②制得的血浆中免疫复合物的含量测定结果如图2所示，图中，正常对照组表示外周血中未加入IgG4型抗体；加入IgG4组的低、中和高分别表示外周血中加入0.1μg、1μg、5μg IgG4型；加入IgG4组的低、中和高三组分别与正常组相比，P<0.05。结果表明：来源于OV A过敏患者B细胞的IgG4型抗体可显著抑制能结合C4d的IgE型免疫复合物的形成。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备血浆或血清或者浆细胞培养的上清液：采集同种疾病患者的外周血，离心，制得血浆或血清；或者在同种疾病患者的外周血中加入抗凝剂后，离心分离，获得外周血单个核细胞，再采用免疫磁珠分离制得B细胞，最后在体外诱导B细胞为浆细胞，并获得浆细胞培养的上清液；
(2)制备亲和层析柱：以溴化氢活化琼脂糖凝胶，溶胀并抽干活化后的琼脂糖凝胶，向其中加入含有抗人IgG4抗体的NaHCO3溶液，琼脂糖凝胶与抗人IgG4抗体发生偶联反应；再以pH值为7.8～8.0的缓冲溶液A封闭处理偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶，装柱；最后，依次用pH值为2.5～3.0的缓冲溶液B、pH值为7.2～7.6的PBS洗柱，得到以偶联了抗人IgG4抗体的琼脂糖凝胶为固定相的亲和层析柱，保存备用；
(3)纯化人IgG4型抗体：将步骤(1)制得的血浆或血清或者浆细胞培养的上清液加入步骤(2)制得的亲和层析柱中，以pH值为7.2～7.6的PBS洗柱，再用pH值为2.5～3.0的缓冲溶液C洗脱人IgG4型抗体，收集洗脱液，并向其中加入pH值为8.8～9.0的缓冲溶液D将洗脱液中和至pH值为7.2～7.4，浓缩中和后所得的溶液进行并进行定量。
2.如权利要求1所述的人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，体外诱导B细胞为浆细胞，并获得浆细胞培养的上清液的方法包括下述步骤：将DMEM完全培养液置于温度为37℃、含有5％二氧化碳的培养箱中，并将制得的B细胞转化为浆细胞后于DMEM完全培养液中培养3周，培养过程中每2～4天更换一次培养液，收集每次更换的培养液上清，即得浆细胞培养的上清液；其中，所述DMEM完全培养液中含有质量百分比为5～10％的胎牛血清，并加入了细胞因子和浓度为2～20μg/mL的美洲商陆丝裂原；所述细胞因子由下述浓度的组分组成：20-100ng/mL白细胞介素-2、20-200ng/mL白细胞介素-10、100-500ng/mL CD40L、50-200ng/mL白细胞介素-4、50-200ng/mL白细胞介素-13和10-100ng/mL白细胞介素-5。
3.如权利要求2所述的人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：所述DMEM完全培养液中还加入下述浓度的抗体：10～100ng/ml anti-IFN-γ、10～100ng/ml anti-IL-12、10-100ng/ml anti-IL-17和10-100ng/ml anti-TGF-β。
4.如权利要求2或3所述的人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：所述将制得的B细胞转化为浆细胞的方法为：采用永生化技术手段处理制得的B细胞，将B细胞转化为永生化的浆细胞。
5.如权利要求4所述的人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：所述永生化技术手段为通过EB病毒、SV40病毒转染或者通过构建含端粒酶催化亚基的表达载体转染。
6.如权利要求1所述的人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，NaHCO3溶液的浓度为0.05～0.1mol/L，pH值为8.2～8.4。
7.如权利要求1所述的人IgG4型抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和所述步骤(3)中，PBS的浓度均为0.01～0.05mol/L，且PBS中含有0.5mol/LNaCl；所述步骤(2)中，缓冲溶液A为0.05-0.2mol/L Tris-HCl，缓冲溶液B为0.05-0.15mol/L Gly-HCl；所述步骤(3)中，缓冲溶液C为0.05-0.15mol/LGly-HCl，缓冲溶液C的洗脱体积为5～10个柱床体积，缓冲溶液D为0.5-1mol/LTris-HCl，PBS洗柱的体积为5～10个柱床体积。
8.一种采用如权利要求1～7任一项所述方法制备得到的人IgG4型抗体。
9.如权利要求8所述人IgG4型抗体在抑制与血清补体结合的免疫复合物的形成中的应用。
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