CN117143235B - 一种单克隆抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体及应用。具体来说，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合IL‑10蛋白。本发明的抗体能够以高亲和力特异性结合IL‑10蛋白。

Description

一种单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种单克隆抗体及其应用，更具体涉及抗IL-10抗体及其应用。
背景技术
白细胞介素10（IL-10）是一个同源二聚体，其每个亚单位由178个氨基酸组成，也被称为人类细胞因子合成抑制因子（CSIF），是一种抗炎细胞因子，特别是免疫细胞的免疫调节剂。IL-10主要由单核细胞、B细胞、角质形成细胞、巨噬细胞等产生，而淋巴细胞，尤其Th2细胞、肥大细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，部分激活的T细胞和B细胞也会产生IL-10。IL-10抑制包括T细胞、单核细胞和巨噬细胞在内的许多细胞的活化和效应功能。特别是，IL-10可以抑制Thl细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞等细胞合成细胞因子，包括IL-1、IFN-γ和TNF。
由于IL-10作为一种免疫抑制细胞因子被广泛接受，IL-10被认为通过降低肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应来促进肿瘤免疫逃逸。而且IL-10可以抑制炎症细胞因子的合成，起到抗炎症的作用。多种病原体，特别是细胞内病原体，诱导IL-10的产生，从而减缓或完全阻止免疫反应对病原体的有效清除。然而，在这些细胞中，IL-10的中和表明，这些细胞中存在积极的效应反应。因此，我们认为IL-10被病原体有效地征用以促进其感染状态。IL-10也与体内自身免疫有关。自身免疫是由针对正常组织的自身抗体、自身反应性T细胞或它们的某种组合产生的。自身免疫性疾病的一个例子是系统性红斑狼疮(SLE)，这是一种慢性风湿性疾病，全身结缔组织发炎。有研究表明阻断IL-10可以增强对于已经肝转移的人结直肠癌的抗肿瘤免疫功能。在敲除IL-10后可诱发自身免疫病-肠道炎症。所以IL-10是人类相关疾病研究和药物开发中一个重要的靶点。
发明内容
本发明共获得了3种抗体，其CDR区序列如下：
表1 重链CDR序列
表2 轻链CDR序列
这3种抗体的重链和轻链序列如下：
表3 重链序列
表4 轻链序列
考虑到某些杂交瘤克隆株不稳定的情况，本发明通过PCR获得抗体可变区序列来保存所需的杂交瘤可变区序列，并通过其他高表达抗体的细胞来进行抗体生产。
本发明获得抗体轻重链可变区序列具体操作如下：用Trizol裂解候选的杂交瘤克隆株并提取总RNA，以此为模板合成第一链cDNA后，以第一链cDNA为模板进行后续PCR扩增，获得杂交瘤细胞所对应的抗体轻重链可变区的核酸，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收TA克隆后，进行Sanger测序获得抗体可变区序列。
具体来说，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合IL-10蛋白，其特征在于，所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗体包括选自如下组的序列：
（a）如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:9所示的LCDR1，如SEQ ID NO:10所示的LCDR2，如SEQ ID NO:11所示的LCDR3；
（b）如SEQ ID NO:4所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:6所示的HCDR3，如SEQ ID NO:9所示的LCDR1，如SEQ ID NO:10所示的LCDR2，如SEQ ID NO:12所示的LCDR3；和
（c）如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:8所示的HCDR3，如SEQ ID NO:13所示的LCDR1，如SEQ ID NO:14所示的LCDR2，如SEQ ID NO:15所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体选自如下项：
（a）抗体，其包含如SEQ ID NO：16所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：19所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（b）抗体，其包含与如SEQ ID NO：16所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：19所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成；
（c）抗体，其包含如SEQ ID NO：17所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：20所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（d）抗体，其包含与如SEQ ID NO：17所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：20所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成；
（e）抗体，其包含如SEQ ID NO：18所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：21所示的轻链氨基酸序列或由其组成；和
（f）抗体，其包含与如SEQ ID NO：18所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：21所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自以下各项组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区（CDR）片段、单链抗体、双价抗体、结构域抗体。
另一方面，本发明提供多核苷酸，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供表达载体，其包含如上所述的多核苷酸。
另一方面，本发明提供宿主细胞，其包含如上所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
另一方面，本发明提供药物组合物，其含有如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及药用载体。
另一方面，本发明提供融合蛋白，其含有如上所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供检测样品中IL-10含量的方法，其特征在于，所述方法包括将样品与如上所述的抗体或其抗原结合片段结合的步骤。
另一方面，本发明提供如上所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测样品中IL-10含量的试剂盒中的用途。
附图说明
图1示出了蛋白免疫小鼠血清效价。用蛋白ELISA的方式检测小鼠血清中IL-10抗体与IL-10蛋白的结合能力。展示了不同血清稀释倍数下抗体的结合能力。
图2A、图2B示出了本发明的抗体对组合，对IL-10蛋白的检测灵敏度结果。其中图2A示出了T1-T2组合的检测结果；图2B示出了T1-T3组合的检测结果。
图3A、图3B示出了本发明的抗体对组合，对IL-10蛋白的检测特异性结果。其中图3A示出了T1-T2组合的检测结果；图3B示出了T1-T3组合的检测结果。
图4A、图4B示出了本发明的抗体对血清掺入实验结果。其中图4A示出了T1-T2组合的检测结果；图4B示出了T1-T3组合的检测结果。
图5示出了本发明的抗体对T1-T2组合的ELISA检测结果。
图6示出了本发明的抗体对T1-T2组合的化学发光检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1 抗体的筛选
IL-10免疫小鼠筛选得到特异性的靶点的抗体
杂交瘤抗体筛选技术为筛选具有靶点特异性且高亲和力的单克隆抗体提供了平台。该技术主要将能分泌抗体但不能无限增殖的浆B细胞与能在体外增殖且长期培养的骨髓瘤细胞相融合，筛选得到既能分泌特异性抗体又能长期培养无限增殖的杂交瘤细胞。并通过该杂交瘤细胞的扩大培养实现单克隆抗体的生产制备，还可以通过液氮冷冻保存杂交瘤细胞为后期抗体生产提供便利。
1. 免疫小鼠以及血清学效价测定
靶点免疫-免疫小鼠以及血清学效价测定
为了获得更高的小鼠免疫效价，使用6-8周的C57/BL6小鼠，免疫前4天，眼眶取血，3000g，5min，离心，获得约20ul左右的血清，于-20℃冻存，作为阴性对照。使用弗氏佐剂（Sigma）作为免疫佐剂，抗原为IL-10蛋白（MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN，SEQ ID NO:22）。采用多点皮下注射的方式，在初次免疫以后，每两周进行一次加强免疫，每次100ug，共进行三次免疫后，用蛋白ELISA检测小鼠血清中抗体效价。该免疫方式操作简单且检测血清中抗体效价，小鼠均得到了较好的效价。
蛋白ELISA检测步骤：用IL-10蛋白（1ug/ml）包被96孔酶标板，37℃恒温孵育2小时。然后弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液（Solarbio）冲洗三次，加入含有2%BSA（Solarbio）的PBS（Solarbio）溶液4℃封闭过夜。第二天将封闭板用PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入不同稀释倍数的小鼠血清样本，37℃孵育1小时，且经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入用2% BSA-PBST以1：10000倍稀释的HPR标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)（Sigma），37℃孵育1小时。经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入TMB底物溶液（Beyotime）显色，室温避光反应15分钟后，以2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读取吸光度，结果如图1所示。
细胞融合
在最后一针加强免疫后3天，挑选出小鼠血清中抗体效价最高的一只小鼠，取出脾脏并在RPMI-1640基础培养基中研磨后获得富含淋巴细胞的悬液。为了能够得到可供筛选的杂交瘤细胞，我们使用了高效的电转的方式将小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，融合数量比10:1。融合7天后，取上清通过蛋白ELISA的方法，检测融合后的细胞是否产生抗体。
蛋白ELISA检测步骤：用IL-10蛋白（1ug/ml）包被96孔酶标板，37℃恒温孵育2小时。然后弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液冲洗三次，加入含有2%BSA的PBS溶液4℃封闭过夜。第二天将封闭板用PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入不同稀释倍数的小鼠血清样本，37℃孵育1小时，且经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入用2% BSA-PBST以1：10000倍稀释的HPR标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)，37℃孵育1小时。经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入TMB底物溶液显色，室温避光反应15分钟后，以2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读取吸光度。选取OD值高的孔，进行亚克隆。
在该项目验证中，我们通过上述方法在53块筛选板中，筛选出多株可以结合IL-10蛋白的抗体表达克隆株，有若干个具备稳定表达针对IL-10蛋白高亲和力抗体的能力。阴性值0.15。
表5 亚克隆杂交瘤的Elisa值
实施例2 抗体的表征
1. 抗体的亲和力测定
使用biocore T200对抗体进行亲和力测定，3个抗体亲和力活性如下：
表6 抗体亲和力
2. 对IL-10因子进行检测
磁珠包被捕获抗体（实验步骤参照Solarbio的磁珠偶连说明书）
1. 捕获抗体溶液配制
取100ug捕获抗体用偶联缓冲液溶解，将捕获抗体配成浓度为≥3.0 mg/mL的溶液。将配制好的捕获抗体溶液于4ºC保存备用。
2. 磁珠清洗
- 使用涡旋振荡器充分混匀磁珠后，使其混合均匀取500 μL 20%的磁珠悬浮液于1.5 mL EP管中。
- 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
- 加1 mL 2~8ºC的洗涤缓冲液（1mM盐酸）于离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。
- 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
3. 蛋白质固定
-加200 μL的捕获抗体溶液于EP管中，涡旋30 s，使其混合均匀。
-将EP管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，室温混合2~4 h。
-采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
4. 磁珠封闭
-加1 mL封闭缓冲液（100 mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0）于EP管中，涡旋30s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。重复四次。
-加1 mL封闭缓冲液于EP管中，涡旋 30 s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2h。
-将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
-加1 mL超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。
-加1 mL PBS缓冲液于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。
-加入PBS缓冲液EP管中，充分混合，4ºC保存备用。
抗体生物素标记（实验步骤参照Frdbbio生物素标记说明书）
1.将本发明获得的三种抗体，分别取1mg于超滤管中，并加入500ul的标记缓冲液（Frdbbio），使抗体的终浓度为2mg/mL，12,000g离心 10min。
2. 加入13.3µL生物素溶液和适量标记缓冲液至上述超滤管中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光孵育30min。
3. 12,000g 离心 10min。
4. 加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，12,000g 离心10min，重复3次。
5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），-20℃保存备用。
双抗夹心检测
将包被好的磁珠，与待测IL-10蛋白孵育，蛋白浓度为10ng/ul。本发明获得的三种抗体，分别进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。对照组是未加生物素标记的抗体。
表7双抗夹心检测结果
抗体荧光强度和对照荧光强度之间存在显著性差异，说明本发明筛选出的抗体可以用于蛋白的检测。
3. 抗体对灵敏度检测
本发明3种抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。现以T1为捕获抗体，T2为检测抗体为例：
将磁珠用T1抗体进行包被，与待测IL-10蛋白孵育，蛋白浓度分别为20000pg/ml，4000pg/ml，800pg/ml，160pg/ml，32pg/ml,6.4pg/ml，1.28pg/ml，0.256pg/ml。对本发明获得的T2抗体，进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。空白组蛋白浓度为0。
本发明抗体对T1-T2、T1-T3组合，对IL-10蛋白的检测灵敏度可达到6.4pg/ml，结果如图2A、图2B所示。抗体对灵敏度检测，可用但不限于以上组合，T2-T3组合也可以进行配对检测，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
4. 抗体对特异性检测
本发明3种抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。为检测抗体对在各种其余因子存在的情况下，对IL-10的特异性的捕获能力，现用11种因子混合，以T1为捕获抗体，T2为检测抗体为例进行检测：
将磁珠用T1抗体进行包被，与其余包被过11种蛋白（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）抗体的磁珠（Raisecare）混合后，与11种蛋白（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）孵育，蛋白浓度均为10ng/ul。对本发明获得的T2抗体，进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。
将IL-10蛋白混入其他11种蛋白（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）中，共同孵育。T1-T2、T1-T3两种配对组合，均能从混合蛋白中检出IL-10蛋白。且与其他蛋白信号有显著性差异，结果如图3A、图3B所示。
抗体对灵敏度检测，可用但不限于以上组合。其他例如T2-T3也可以检测出IL-10蛋白，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
5. 血清掺入实验
本发明3个抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。现以T1为捕获抗体，T2为检测抗体为例：
待测蛋白IL-10，分别用PBS和阴性血清FBS(Gibco)稀释，稀释后的蛋白浓度分别为20000pg/ml，4000pg/ml，800pg/ml，160pg/ml，32pg/ml，6.4pg/ml，1.28pg/ml，0.256pg/ml。磁珠用T1抗体进行包被，包被后的磁珠，分别与抗体T2、T3进行孵育。设为PBS组和血清组。对本发明获得的T2抗体，进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。
抗体对血清掺入实验，可用但不限于以上组合。其他例如T2-T3也可以，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
由图4A、图4B的结果可知，不仅在PBS中，在其他介质例如FBS（胎牛血清）中，抗体对也能很好的检测出特异性蛋白，且有较好的重合性。
6. ELISA检测
以T1-T2抗体对为例：
用T1抗体（1ug/ml）包被96孔酶标板，37℃恒温孵育2小时。然后弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液（Solarbio）冲洗三次，加入含有2%BSA（Solarbio）的PBS（Solarbio）溶液4℃封闭过夜。 次日，用 200 µL PBS 洗涤微量滴定板两次。加入稀释后的样本IL-10蛋白，各孔加样量都为50μl，浓度分别为24μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L，37℃孵育1.5小时。且经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，每孔添加100 μL经过稀释的检测抗体，室温下孵育 2小时。用PBS 洗涤三次。 添加 100 μL 生物素标记过的T2，室温下孵育1 h，用PBS洗涤微量滴定板三次。加入SA- HRP（Thermofisher），室温下孵育1 h。悬空垂直加入化学发光 HRP 底物（Thermofisher），每孔90μL，37℃孵育30min，取出酶标板。悬空垂直加入终止液（Thermofisher），每孔50μL。酶标板读数OD450。利用系列稀释液数据绘制标准曲线，其中 X轴（对数标度）为浓度，Y 轴（线性标度）为吸光度。
双抗夹心ELISA，可用但不限于以上组合。其他例如T1-T3，T2-T3也可以检测出对应待测物，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
由图5的结果可知，本发明给出的抗体对，在双抗夹心ELISA中，也有很好的应用。
7. 化学发光
本发明3种抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。现以T1为捕获抗体，T2为检测抗体为例：
将磁珠用T1抗体进行包被，与待测IL-10蛋白孵育，蛋白浓度分别为7650pg/ml，2393pg/ml，499pg/ml，100pg/ml，50pg/ml。本发明获得的T2抗体与吖啶酯混合，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入过氧化氢碱性溶液，用化学发光仪检测。
化学发光检测，可用但不限于T1-T2组合。其他例如T2-T3也可以检测出对应待测物，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
由图6的结果可知，本发明给出的抗体对，在化学发光检测中，也有很好的应用。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合IL-10蛋白，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：
（a）如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:9所示的LCDR1，如SEQ ID NO:10所示的LCDR2，如SEQ ID NO:11所示的LCDR3；
（b）如SEQ ID NO:4所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:6所示的HCDR3，如SEQ ID NO:9所示的LCDR1，如SEQ ID NO:10所示的LCDR2，如SEQ ID NO:12所示的LCDR3；和
（c）如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:8所示的HCDR3，如SEQ ID NO:13所示的LCDR1，如SEQ ID NO:14所示的LCDR2，如SEQ ID NO:15所示的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自如下项：
（a）抗体，其包含如SEQ ID NO：16所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：19所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（b）抗体，其包含如SEQ ID NO：17所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：20所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（c）抗体，其包含如SEQ ID NO：18所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：21所示的轻链氨基酸序列或由其组成。
3.多核苷酸，其编码根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
4.表达载体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。
5.宿主细胞，其包含权利要求4所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞。
6.药物组合物，其含有权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药用载体。
7.融合蛋白，其含有权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.检测样品中IL-10含量的非诊断方法，其特征在于，所述方法包括将样品与根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合的步骤。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测样品中IL-10含量的试剂盒中的用途。
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