CN117126277B - 一种单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117126277B
CN117126277B CN202311396906.5A CN202311396906A CN117126277B CN 117126277 B CN117126277 B CN 117126277B CN 202311396906 A CN202311396906 A CN 202311396906A CN 117126277 B CN117126277 B CN 117126277B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
antibodies
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311396906.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117126277A (zh
Inventor
秦静怡
李欣
濮科锋
李炯
顾雅韵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Original Assignee
Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS filed Critical Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority to CN202311396906.5A priority Critical patent/CN117126277B/zh
Publication of CN117126277A publication Critical patent/CN117126277A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117126277B publication Critical patent/CN117126277B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • G01N2333/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用。具体来说，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合GM‑CSF蛋白。本发明的抗体能够以高亲和力特异性结合GM‑CSF蛋白。

Description

一种单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是抗GM-CSF抗体及其应用。
背景技术
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），也被称为集落刺激因子2（CSF2），是一种单体糖蛋白，由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌，起着细胞因子的作用。
由于GM-CSF在免疫系统中的多种激活功能，其可视为抗炎疗法的靶点。诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、克罗恩(Crohn's)病、牛皮癣、哮喘病、特应性皮炎或休克等慢性及急性炎症性疾病可充分受益于GM-CSF活性的阻断及随后GM-CSF反应细胞有害活性的降低。鉴于抗GM-CSF抗体疗法的巨大潜力，当前急需具有高亲和力的可有效阻断GM-CSF/GM-CSF受体相互作用的人类抗GM-CSF抗体。
发明内容
本发明共获得了5种抗体，其CDR区序列如下：
表1 重链CDR序列
表2 轻链CDR序列
这5种抗体的重链和轻链序列如下：
表3 重链序列
表4 轻链序列
考虑到某些杂交瘤克隆株不稳定的情况，本发明通过PCR获得抗体可变区序列来保存所需的杂交瘤可变区序列，并通过其他高表达抗体的细胞来进行抗体生产。
本发明获得抗体轻重链可变区序列具体操作如下：用Trizol裂解候选的杂交瘤克隆株并提取总RNA，以此为模板合成第一链cDNA后，以第一链cDNA为模板进行后续PCR扩增，获得杂交瘤细胞所对应的抗体轻重链可变区的核酸，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收TA克隆后，进行Sanger测序获得抗体可变区序列。
具体来说，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其特异性结合GM-CSF蛋白，其特征在于，所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或SEQID NO:12所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11或SEQID NO:14所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:27所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:25所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成；和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28所示的序列，与所述序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗体包括选自如下组的序列：
（a）如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:15所示的LCDR1，如SEQ ID NO:16所示的LCDR2，如SEQ ID NO:17所示的LCDR3；
（b）如SEQ ID NO:4所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:6所示的HCDR3，如SEQ ID NO:18所示的LCDR1，如SEQ ID NO:19所示的LCDR2，如SEQ ID NO:20所示的LCDR3；
（c）如SEQ ID NO:7所示的HCDR1，如SEQ ID NO:5所示的HCDR2，如SEQ ID NO:8所示的HCDR3，如SEQ ID NO:21所示的LCDR1，如SEQ ID NO:22所示的LCDR2，如SEQ ID NO:23所示的LCDR3；
（d）如SEQ ID NO:9所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:11所示的HCDR3，如SEQ ID NO:24所示的LCDR1，如SEQ ID NO:25所示的LCDR2，如SEQ ID NO:26所示的LCDR3；和
（e）如SEQ ID NO:12所示的HCDR1，如SEQ ID NO:13所示的HCDR2，如SEQ ID NO:14所示的HCDR3，如SEQ ID NO:27所示的LCDR1，如SEQ ID NO:19所示的LCDR2，如SEQ ID NO:28所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体选自如下项：
（a）抗体，其包含如SEQ ID NO：29所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：34所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（b）抗体，其包含与如SEQ ID NO：29所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：34所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成；
（c）抗体，其包含如SEQ ID NO：30所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：35所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（d）抗体，其包含与如SEQ ID NO：30所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：35所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成；
（e）抗体，其包含如SEQ ID NO：31所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：36所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（f）抗体，其包含与如SEQ ID NO：31所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：36所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成；
（g）抗体，其包含如SEQ ID NO：32所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：37所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（h）抗体，其包含与如SEQ ID NO：32所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：37所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成；
（i）抗体，其包含如SEQ ID NO：33所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列或由其组成；
（j）抗体，其包含与如SEQ ID NO：33所示的重链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列和与如SEQ ID NO：38所示的轻链氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个（优选1个、2个或3个）保守氨基酸突变（优选置换、插入或缺失）的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自以下各项组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区（CDR）片段、单链抗体、双价抗体、结构域抗体。
另一方面，本发明提供多核苷酸，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供表达载体，其包含如上所述的多核苷酸。
另一方面，本发明提供宿主细胞，其包含如上所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
另一方面，本发明提供药物组合物，其含有如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及药用载体。
另一方面，本发明提供融合蛋白，其含有如上所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供检测样品中GM-CSF含量的方法，其特征在于，所述方法包括将样品与如上所述的抗体或其抗原结合片段结合的步骤。
另一方面，本发明提供如上所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测样品中GM-CSF含量的试剂盒中的用途。
附图说明
图1示出了免疫小鼠后，血清效价的评价结果。用蛋白ELISA的方式检测小鼠血清中抗GM-CSF抗体与GM-CSF蛋白的结合能力，展示了不同血清稀释倍数下抗体的结合能力。
图2示出了本发明的抗体对G1-G2组合对GM-CSF蛋白的检测结果。
图3示出了本发明的抗体对G1-G3组合对GM-CSF蛋白的检测结果。
图4示出了本发明的抗体对G1-G4组合对GM-CSF蛋白的检测结果。
图5示出了本发明的抗体对G2-G5组合对GM-CSF蛋白的检测结果。
图6示出了本发明的抗体对G4-G5组合对GM-CSF蛋白的检测结果。
图7A、图7B、图7C、图7D、图7E示出了本发明的抗体对特异性检测结果。其中图7A示出了抗体对G1-G2组合的检测结果；图7B示出了抗体对G1-G3组合的检测结果；图7C示出了抗体对G1-G4组合的检测结果；图7D示出了抗体对G2-G5组合的检测结果；图7E示出了抗体对G4-G5组合的检测结果。
图8A、图8B、图8C、图8D、图8E示出了本发明的抗体对血清掺入实验的检测结果。其中图8A示出了抗体对G1-G2组合的检测结果；图8B示出了抗体对G1-G3组合的检测结果；图8C示出了抗体对G1-G4组合的检测结果；图8D示出了抗体对G2-G5组合的检测结果；图8E示出了抗体对G4-G5组合的检测结果。
图9示出了本发明的抗体对ELISA 检测结果。
图10示出了本发明的抗体对化学发光检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1 抗体的筛选
GM-CSF免疫小鼠筛选得到特异性的靶点的抗体
杂交瘤抗体筛选技术为筛选具有靶点特异性且高亲和力的单克隆抗体提供了平台。该技术主要将能分泌抗体但不能无限增殖的浆B细胞与能在体外增殖且长期培养的骨髓瘤细胞相融合，筛选得到既能分泌特异性抗体又能长期培养无限增殖的杂交瘤细胞。并通过该杂交瘤细胞的扩大培养实现单克隆抗体的生产制备，还可以通过液氮冷冻保存杂交瘤细胞为后期抗体生产提供便利。
1. 免疫小鼠以及血清学效价测定
靶点免疫-免疫小鼠以及血清学效价测定
为了获得更高的小鼠免疫效价，使用6-8周的C57/BL6小鼠，免疫前4天，眼眶取血，3000g，5min，离心，获得约20ul左右的血清，于-20℃冻存，作为阴性对照。使用弗氏佐剂（Sigma）作为免疫佐剂，抗原为GM-CSF蛋白（MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE，SEQ ID NO:39）。采用多点皮下注射的方式，在初次免疫以后，每两周进行一次加强免疫，每次100ug，共进行三次免疫后，用蛋白ELISA检测小鼠血清中抗体效价。该免疫方式操作简单且检测血清中抗体效价，小鼠均得到了较好的效价。
蛋白ELISA检测步骤: 用GM-CSF蛋白（1ug/ml）包被96孔酶标板，37℃恒温孵育2小时。然后弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液（索莱宝）冲洗三次，加入含有2%BSA（索莱宝）的PBS（索莱宝）溶液4℃封闭过夜。第二天将封闭板用PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入不同稀释倍数的小鼠血清样本，37℃孵育1小时，且经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入用2% BSA-PBST以1：10000倍稀释的HPR标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)（Sigma），37℃孵育1小时。经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入TMB底物溶液（碧云天）显色，室温避光反应15分钟后，以2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读取吸光度，结果如图1所示。
细胞融合
在最后一针加强免疫后3天，挑选出小鼠血清中抗体效价最高的一只小鼠，取出脾脏并在RPMI-1640基础培养基中研磨后获得富含淋巴细胞的悬液。为了能够得到可供筛选的杂交瘤细胞，我们使用了高效的电转的方式将小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，融合数量比10:1。融合7天后，取上清通过蛋白ELISA的方法，检测融合后的细胞是否产生抗体。
蛋白ELISA检测步骤：用GM-CSF蛋白（1ug/ml）包被96孔酶标板，37℃恒温孵育2小时。然后弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液冲洗三次，加入含有2%BSA的PBS溶液4℃封闭过夜。第二天将封闭板用PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入不同稀释倍数的小鼠血清样本，37℃孵育1小时，且经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入用2% BSA-PBST以1：10000倍稀释的HPR标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)，37℃孵育1小时。经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，加入TMB底物溶液显色，室温避光反应15分钟后，以2M的盐酸溶液终止反应并在450nm处读取吸光度。选取OD值高的孔，进行亚克隆。
在该项目验证中，我们通过上述方法在48块筛选板中，筛选出多株可以结合GM-CSF蛋白的抗体表达克隆株，有若干个具备稳定表达针对GM-CSF蛋白高亲和力抗体的能力。阴性值0.16。
表5 亚克隆杂交瘤的ELISA值
实施例2 抗体的表征
1. 抗体的亲和力测定
使用biocore T200对抗体进行亲和力测定，5个抗体亲和力活性如下：
表6 抗体亲和力
2. 对GM-CSF因子进行检测
磁珠包被捕获抗体
1. 捕获抗体溶液配制
取100ug捕获抗体用偶联缓冲液溶解，将捕获抗体配成浓度为≥3.0 mg/mL的溶液。将配制好的捕获抗体溶液于4ºC保存备用。
2. 磁珠清洗
- 使用涡旋振荡器充分混匀磁珠后，使其混合均匀取500 μL 20%的磁珠悬浮液于1.5 mL EP 管中。
- 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
- 加1 mL 2~8ºC的洗涤缓冲液（1mM 盐酸）于离心管中，涡旋 15 s，使磁珠混合均匀。
- 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
3. 蛋白质固定
-加200 μL的捕获抗体溶液于EP管中，涡旋30 s，使其混合均匀。
-将EP管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，室温混合2~4 h。
-采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
4. 磁珠封闭
-加1 mL封闭缓冲液（100 mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0）于 EP 管中，涡旋30s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。重复四次。
-加1 mL封闭缓冲液于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2h。
-将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
-加1 mL超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。
-加1 mL PBS缓冲液于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。
-加入PBS缓冲液EP 管中，充分混合，4ºC保存备用。
抗体生物素标记
1.将本发明获得的五种抗体，分别取1mg于超滤管中，并加入500ul的标记缓冲液（Frdbbio），使抗体的终浓度为 2mg/mL，12,000g 离心 10min。
2. 加入13.3µL生物素溶液和适量标记缓冲液至上述超滤管中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光孵育30min。
3. 12,000g 离心10min。
4. 加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，12,000g 离心10min，重复3次。
5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），-20℃保存备用。
流式荧光检测
将包被好的磁珠，与待测GM-CSF蛋白孵育，蛋白浓度为10ng/ul。本发明获得的五种抗体，分别进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。对照组是未加生物素标记的抗体。
表7 流式荧光检测结果
抗体荧光强度和对照荧光强度之间存在显著性差异，说明本发明筛选出的抗体可以用于蛋白的检测。
3. 抗体对灵敏度检测
本发明5个抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。现以G1为捕获抗体，G2为检测抗体为例：
将磁珠用G1抗体进行包被，与待测GM-CSF蛋白孵育，蛋白浓度分别为20000pg/ml，4000pg/ml，800pg/ml，160pg/ml，32pg/ml，6.4pg/ml，1.28pg/ml，0.256pg/ml。对本发明获得的G2抗体，进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。空白组蛋白浓度为0。
本发明抗体对G1-G2组合，对GM-CSF蛋白的检测灵敏度可达到1.28pg/ml，结果如图2所示。
本发明抗体对G1-G3组合，对GM-CSF蛋白的检测灵敏度可达到6.4pg/ml，结果如图3所示。
本发明抗体对G1-G4组合，对GM-CSF蛋白的检测灵敏度可达到6.4pg/ml，结果如图4所示。
本发明抗体对G2-G5组合，对GM-CSF蛋白的检测灵敏度可达到6.4pg/ml，结果如图5所示。
本发明抗体对G4-G5组合，对GM-CSF蛋白的检测灵敏度可达到6.4pg/ml，结果如图6所示。
抗体对灵敏度检测，可用但不限于以上组合。其他例如：G1-G5,G2-G3,G2-G4,G3-G4,G3-G5等均可，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
4. 抗体对特异性检测
本发明5个抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。为检测抗体对，在各种其余因子存在的情况下，对GM-CSF的特异性的捕获能力进行检测。本发明用12种因子混合。现以G1为捕获抗体，G2为检测抗体为例进行检测：
将磁珠用G1抗体进行包被，与其余包被过12种蛋白（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）抗体的磁珠（Raisecare）混合后，与12种蛋白（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）孵育，蛋白浓度均为10ng/ul。对本发明获得的G2抗体，进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。
将GM-CSF蛋白混入其他12种蛋白（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）中，共同孵育。G1-G2， G1-G3，G1-G4，G2-G5，G4-G5五种配对组合，均能从混合蛋白中检出GM-CSF蛋白。且与其他蛋白信号有显著性差异。
抗体对特异性检测，可用但不限于组合G1-G2， G1-G3，G1-G4，G2-G5，G4-G5，实验结果如图7A、图7B、图7C、图7D和图7E所示。其他例如：G1-G5，G2-G3，G2-G4，G3-G4，G3-G5等均可，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
5. 血清掺入实验
本发明5个抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。现以G1为捕获抗体，G2为检测抗体为例：
待测蛋白GM-CSF，分别用PBS和阴性血清FBS(Gibco)稀释，稀释后的蛋白浓度分别为20000pg/ml，4000pg/ml，800pg/ml，160pg/ml，32pg/ml，6.4pg/ml，1.28pg/ml，0.256pg/ml。磁珠用G1抗体进行包被，包被后的磁珠，分别与G2、G3、G4、G5抗体进行孵育。设为PBS组和血清组。对本发明获得的G2、G3、G4、G5抗体，分别进行生物素标记，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后加入藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（Invitrogen），与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度。
抗体对血清掺入实验，可用但不限于以上组合G1-G2，G1-G3，G1-G4，G2-G5，G4-G5，实验结果如图8A、图8B、图8C、图8D和图8E所示。其他例如：G1-G5，G2-G3，G2-G4，G3-G4，G3-G5等均可，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
由图8A、图8B、图8C、图8D和图8E的结果可知，不仅在PBS中，在其他介质例如FBS（胎牛血清）中，抗体对也能很好的检测出特异性蛋白，且有较好的重合性。
6. ELISA检测应用
以G1-G2抗体对为例：
用G1抗体（1ug/ml）包被96孔酶标板，37℃恒温孵育2小时。然后弃去孔内液体，用PBST洗涤缓冲液（索莱宝）冲洗三次，加入含有2%BSA（索莱宝）的PBS（索莱宝）溶液4℃封闭过夜。 次日，用 200 µL PBS 洗涤微量滴定板两次。加入稀释后的GM-CSF蛋白，各孔加样量都为50μl，浓度分别为24μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L，37℃孵育1.5小时。且经过PBST洗涤缓冲液冲洗后，每孔添加100 μL经过稀释的检测抗体，室温下孵育 2 小时。用 PBS 洗涤三次。 添加 100 μL 生物素标记过的G2，室温下孵育 1 h，用 PBS 洗涤微量滴定板三次。加入1ug/ml SA-HRP（赛默飞世尔科技）室温下孵育 1 h。悬空垂直加入化学发光 HRP底物（赛默飞世尔科技），每孔90μL，37℃孵育30min，取出酶标板。悬空垂直加入终止液（赛默飞世尔科技），每孔50μL。酶标板读数OD450。利用系列稀释液数据绘制标准曲线，其中 X轴（对数标度）为浓度，Y 轴（线性标度）为吸光度，实验结果如图9所示。
抗体对ELISA 检测，可用但不限于组合G1-G2。其他例如：G1-G3、G1-G4、G1-G5、G2-G3、G2-G4、G2-G5、G3-G4、G3-G5、G4-G5等均可，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
由图9的结果可知，本发明给出的抗体对，在双抗夹心ELISA中，也有很好的应用。
7. 化学发光检测应用
本发明5个抗体，可以互为捕获和检测抗体，进行配对。现以G1为捕获抗体，G2为检测抗体为例：
将磁珠用G1抗体进行包被，与待测GM-CSF蛋白孵育，蛋白浓度分别为7650pg/ml，2393pg/ml，499pg/ml，100pg/ml，50pg/ml。本发明获得的G2抗体与吖啶酯混合，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物。最后添加过氧化氢碱性溶液，用化学发光仪检测。
抗体对化学发光检测，可用但不限于组合G1-G2，实验结果如图10所示。其他例如：G1-G3，G1-G4，G1-G5，G2-G3，G2-G4，G2-G5，G3-G4，G3-G5，G4-G5等均可，且捕获抗体和检测抗体可以互换使用。
由图10的结果可知，本发明获得的抗体对，在化学发光检测中，也有很好的应用。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合GM-CSF蛋白，其特征在于，所述抗体包括如下序列：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:15所示的LCDR1，如SEQ ID NO:16所示的LCDR2，如SEQ ID NO:17所示的LCDR3。
2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：29所示的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO：34所示的轻链氨基酸序列或由其组成。
3.多核苷酸，其编码根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
4.表达载体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。
5.宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的表达载体，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞。
6.药物组合物，其含有根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药用载体。
7.融合蛋白，其含有权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.检测样品中GM-CSF含量的方法，其特征在于，所述方法包括将样品与根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合的步骤。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备检测样品中GM-CSF含量的试剂盒中的用途。
CN202311396906.5A 2023-10-26 2023-10-26 一种单克隆抗体及其应用 Active CN117126277B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311396906.5A CN117126277B (zh) 2023-10-26 2023-10-26 一种单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311396906.5A CN117126277B (zh) 2023-10-26 2023-10-26 一种单克隆抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117126277A CN117126277A (zh) 2023-11-28
CN117126277B true CN117126277B (zh) 2024-01-23

Family

ID=88858600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311396906.5A Active CN117126277B (zh) 2023-10-26 2023-10-26 一种单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117126277B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101861336A (zh) * 2007-09-18 2010-10-13 安姆根有限公司 人gm-csf抗原结合蛋白质
CN101932603A (zh) * 2008-01-15 2010-12-29 卡罗拜奥斯制药公司 使用gm-csf拮抗剂治疗骨质流失病症的方法
CN107840885A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 天境生物科技(上海)有限公司 Gm‑csf抗体及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101861336A (zh) * 2007-09-18 2010-10-13 安姆根有限公司 人gm-csf抗原结合蛋白质
CN101932603A (zh) * 2008-01-15 2010-12-29 卡罗拜奥斯制药公司 使用gm-csf拮抗剂治疗骨质流失病症的方法
CN107840885A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 天境生物科技(上海)有限公司 Gm‑csf抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN117126277A (zh) 2023-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6466397B2 (ja) 抗原特異的ｂ細胞の同定及び単離ならびに所望の抗原に対する抗体作製のプロトコール
US10934524B2 (en) High throughput monoclonal antibody generation by B cell panning and proliferation
US9938343B2 (en) Diagnostic method for determining the presence and amount of human interleukin-3 in a sample using novel IL-3 antibodies
CN114349858B (zh) 抗人白介素-10高亲和力兔单克隆抗体及其应用
CN117126277B (zh) 一种单克隆抗体及其应用
CN104894652A (zh) 一种cTnI人源化单链抗体库的构建及应用
CN117362431A (zh) 抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用
CN117126278B (zh) 一种单克隆抗体及其应用
WO2020119666A1 (zh) 抗h7n9全人源单克隆抗体3f12及其制法与应用
CN117143235B (zh) 一种单克隆抗体及应用
CN113896793B (zh) 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用
CN116256518A (zh) 一种肿瘤诊断标志物及其诊断试剂盒和应用
CN116003606B (zh) 一种tigit纳米抗体及其制备方法与应用
CN114539403B (zh) 靶向人bcma蛋白的兔重组单克隆抗体及应用
WO2024145974A1 (zh) 一种tigit纳米抗体及其制备方法与应用
Chafouleas et al. [9] Production of polyclonal and monoclonal antibodies to calmodulin and utilization of these immunological probes
EP0328690B1 (en) Method for diagnosing chronic articular rheumatism
CN113912719B (zh) 检测小鼠白介素6的单克隆抗体及其制备方法和应用
EP0339097B1 (en) Method for diagnosis of liver cancer
CN102120769A (zh) 一种抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法
CN113321729B (zh) 一组il-12单克隆抗体及其医药用途
CN116023495B (zh) 一种抗cd40纳米抗体及其制备方法与应用
CN116286667A (zh) 抗人il-17a蛋白的单克隆抗体及其应用
CN107383195B (zh) 抗人dll4单克隆抗体6f12的制备方法
CN117003866A (zh) 一种抗calr突变蛋白抗体、制备方法及检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant