CN109504661B - 一种抗原特异性的t淋巴细胞杂交瘤及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗原特异性的t淋巴细胞杂交瘤及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗原特异性的T淋巴细胞杂交瘤及其制备方法和应用。所述T淋巴细胞杂交瘤由抗原特异性OVA323‑339CD4+T淋巴细胞与T胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4融合而成,其保藏号为CCTCC NO:C201786。本发明制得的T杂交瘤细胞具有相对均匀性、稳定性及即时可用性等优于原发性T细胞的优点,其作为可靠、可重复、方便和高度特异性的T细胞试剂,可应用于抗原呈递过程中阻断免疫抑制分子作用的抗体的筛选,及在体外抗原递呈细胞(APC)的研究中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,特别涉及一种抗原特异性的T淋巴细胞杂交瘤及其制备方法和应用。
背景技术
人和动物的免疫系统分为先天性免疫和获得性免疫,获得性免疫基于B淋巴细胞(简称B细胞)和T淋巴细胞(简称T细胞)的高度特异性抗原受体以及克隆选择。B淋巴细胞通过分泌抗体引起体液免疫应答,而T淋巴细胞介导引起所识别细胞被破坏的细胞免疫应答。T细胞在细胞免疫应答中发挥核心作用,在T细胞表面上表达的T细胞受体(TCR)介导特定抗原的识别和结合。TCR能够与结合于主要组织相容性复合体(MHC)分子并且在靶细胞表面上呈递的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联,导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。
Kohler和Milstein在1975年设计了用免疫小鼠能产生抗体的B细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合,产生能无限增殖且分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。但T细胞不同于B细胞,其构建杂交瘤时需筛选特异性抗原,制备过程复杂,重复性差,制得的杂交瘤性质及效果差异大。目前体外扩增抗原特异性的T细胞的方法主要有两种方法,其一是依靠外源性细胞因子,如白介素2(IL-2)联合CD3抗体用于刺激T细胞分裂。若想获得大量的抗原特异性T细胞,在培养过程中往往需要多次活化和扩增,耗时、重复性差,且有难于标准化。另外一种是制备T淋巴细胞杂交瘤,T细胞杂交瘤是研究抗原呈递细胞(APC)功能的非常有用的工具,其制备的相关技术可以参照(Canaday DH,Methods Mol Biol,2013,960:297–307)。原代T细胞可以应用于对于T细胞固有的调节机制的研究,但是在用于抗原呈递的研究方面,T细胞杂交瘤具有优于原代T细胞克隆的优点,包括其在抗原呈递实验中的相对均匀性、随时间的稳定性以及大量的即时可用性。制备T淋巴细胞杂交瘤,能够获得无限增殖的稳定的易于标准化的抗原特异性T细胞,其对于体外的抗原呈递和识别以及下游信号传导的研究具有重要的意义。但目前很难获得可靠、可重复且可以大规模繁殖的T淋巴细胞杂交瘤,尤其是ovalbumin(OVA)抗原特异的T淋巴细胞杂交瘤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,针对抗原特异性的原代T细胞在体外培养比较困难,且不易增殖,导致在体外培养研究中存在不稳定问题,提供一种可靠、可重复、方便和OVA323-339抗原特异性的T杂交瘤细胞及其制备方法,以及该杂交瘤细胞在阻断一些免疫抑制分子的抗体筛选中的应用。
本发明通过下述技术方案解决了上述问题:
本发明的技术方案之一,提供一种T淋巴细胞杂交瘤,其是抗原特异性的OVA323- 339CD4+T淋巴细胞与T胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4融合而成的、保藏号为CCTCC NO:C201786的杂交瘤。
本发明所述OVA即ovalbumin,鸡卵清白蛋白,由386个氨基酸组成,分子量约45kD。其具有较强的免疫原性,目前在疫苗及生物药的生产中,OVA作为蛋白添加剂用于提高生物药或疫苗等的稳定性,或在抗体制备过程中作为载体蛋白用于半抗原的偶联。
本发明所述杂交瘤,即通过融合正常淋巴细胞和肿瘤(淋巴瘤)细胞形成的体细胞杂合体。杂交瘤细胞能够如母体肿瘤细胞一样在培养物中无限增殖,其分为B细胞杂交瘤和T细胞杂交瘤。B细胞杂交瘤是单克隆抗体最有用的来源;T细胞杂交瘤提供抗原。如无特殊说明,杂交瘤在本发明中指的是T细胞杂交瘤。
本发明的技术方案之一,提供一种T淋巴细胞杂交瘤的制备方法,其包括以下步骤:
(1)从OVA抗原特异性转基因的小鼠中获得包含OVA323-339单一抗原反应性的T淋巴细胞样品;
(2)结合T淋巴细胞表达蛋白的特性,运用免疫磁珠技术,从步骤(1)获得的样品中分离并鉴定得CD4+的T淋巴细胞。
(3)在存在聚乙二醇条件下,将步骤(2)所得的抗原特异性的OVA323-339CD4+T淋巴细胞与T胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4温育,在培养基中培养,获得杂交瘤细胞。
较佳地,所述制备方法还包括下列步骤:
(4)加入脾细胞和特异性抗原OVA323-339,与所述的杂交瘤克隆一起温育;
(5)24小时后测定杂交瘤克隆的培养上清中细胞因子的浓度,选择抗原特异性的T淋巴细胞杂交瘤。
更佳地,所述制备方法中,所述脾细胞为C57BL/6小鼠的脾细胞,所述的细胞因子选自IL-2、IFN或TNF;进一步更佳地,所述细胞因子为小鼠IL-2。
在本发明中,抗原特异性淋巴样细胞与T胸腺瘤细胞系融合的方法除聚乙二醇外,常规的还可使用失活仙台病毒或者在电融合条件下,将抗原特异性淋巴样细胞与T胸腺瘤细胞系温育。本发明中的培养基可包含次黄嘌呤、氨基蝶啶、胸苷等成分。
本发明的技术方案之一,提供一种抗原呈递过程中阻断免疫抑制分子作用的抗体的筛选方法,其包括以下步骤:
(1)构建含目标抗原的慢病毒表达载体,用其感染如权利要求1所述的T淋巴细胞杂交瘤,获得过表达目标抗原的稳定细胞株;
(2)在步骤(1)中获得的细胞株中加入待测抗体并孵育;
(3)将脾细胞和抗原肽OVA323-339混合孵育,使脾细胞中的APC细胞与抗原肽接触,提呈抗原肽;
(4)将步骤(3)中脾细胞和抗原肽混合物加入步骤(2)中孵育;
(5)检定上清中细胞因子的浓度,筛选具有阻断免疫抑制因子作用的抗体。
较佳地,所述步骤(2)中的T淋巴细胞杂交瘤浓度为1×105-1×107细胞/ml。更佳地,其浓度为2×106-4×106细胞/ml。
较佳地,所述脾细胞为C57BL/6小鼠的脾细胞,所述细胞因子选自IL-2、IFN或TNF。更佳地,所述细胞因子为小鼠IL-2。
进一步更佳地,所述目标抗原为人淋巴细胞激活基因分子(hLAG-3),所述待测抗体为抗hLAG-3的抗体。
本发明的技术方案之一,所述的T淋巴细胞杂交瘤在体外抗原递呈细胞(APC)的研究中的应用。
较佳地,所述的研究为在抗原递呈过程中抑制剂的动力学研究,例如抗原呈递过程中阻断免疫抑制分子作用的抗体或免疫抑制分子抗体的联合用药的筛选。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明的T杂交瘤细胞具有可靠、方便、可稳定传代和高度特异性。T杂交瘤细胞在特异性抗原和相应的抗原提呈细胞刺激下可分泌高水平的小鼠白介素IL-2。本发明可用于筛选抗人淋巴细胞激活基因的抗体筛选以及在阻断某些免疫抑制分子的抗体筛选,具有很好的工业应用背景。
生物材料保藏信息
本发明的T淋巴细胞杂交瘤细胞株8B2,于2017年6月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址为中国.武汉市.武汉大学(邮编430072),保藏编号为CCTCCNO:C201786。
附图说明
图1为用ELISA筛选高表达mIL2的T淋巴细胞杂交瘤的初步结果。
图2为用ELISA筛选高表达mIL2的T淋巴细胞杂交瘤的复检结果。
图3为用流式检测分析筛选过表达人淋巴细胞激活基因(human LAG-3,即hLAG-3)的T杂交瘤细胞株克隆的结果。
图4为用抗原特异性的T淋巴细胞杂交瘤筛选阻断人淋巴细胞激活基因抗体的结果,其中LAG-3 Tab1和LAG-3 Tab2都是抗hLAG-3的有生物功能的阳性抗体,其中LAG-3Tab1为人源抗体,阴性对照为hIgG4;LAG-3Tab2为鼠源抗体,阴性对照为mIgG1。
图5为用抗原特异性的T淋巴瘤细胞检测抗hLAG-3和抗mPD-1抗体联合用药的效果。
图6为T淋巴细胞杂交瘤的制备方法和应用的示意图,其中左面A图为制备方法示意图,右面B图为T淋巴细胞杂交瘤的应用示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例中的材料来源为:
OVA转基因小鼠:购自美国The Jackson Laboratory。
C57BL/6小鼠:购自上海斯莱克动物中心。
胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4:购自美国ATCC细胞库。
小鼠CD4磁珠分选:购自加拿大Stemcell公司。
小鼠IL-2检测试剂盒:购自美国R&D system公司。
小鼠CD4分离试剂盒:Stem Cell公司。
OVA323-339抗原肽:购自上海吉尔生化有限公司。
抗human LAG-3抗体:购自美国R&D system公司。
抗mouse PD-1(mPD-1)抗体和阴性对照ratIgG购自美国bioxcell公司。
细胞培养板,培养瓶:购自美国Corning公司。
CO2培养箱:购自美国Thermo fisher公司。
DMEM基础培养基:购自美国Corning公司。
OVA白蛋白:购自美国sigma公司。
PEG:购自Sigma公司。
抗LAG-3的两个阳性抗体Tab1和Tab2根据专利中的序列,委托上海睿智化学研究有限公司合成。其中Tab1来自专利号为WO2015042246A1的专利中SEQ ID NO.3(VH序列)和SEQ ID NO.5(VL序列)的抗体,Tab2来自专利号WO2015138920A1的专利文献中SEQ ID NO.6(VH序列)和SEQ ID NO.16(VL序列)的抗体,使用本领域常规技术,将这两个抗体基因序列克隆到pCP表达载体上,仓鼠卵巢细胞瞬时表达抗体,经纯化得到两个阳性抗体Tab1和Tab2。
实施例1
抗原特异性淋巴样细胞的获得
首先,可以用OVA白蛋白对OVA转基因小鼠进行腹腔免疫,剂量25μg,使OVA323-339特异的T细胞增殖。7天后处死小鼠,收集脾和淋巴结细胞。加入NH4OH至终浓度1%裂解细胞悬液中的红细胞,用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次;获得包含单一抗原反应性T细胞的淋巴细胞样品;然后在淋巴细胞样品中,结合T细胞表达蛋白的特性,使用小鼠CD4分离试剂盒,根据其说明书,利用免疫磁珠技术和联合抗体,阴性筛选CD4+T细胞,分离出抗原特异性的CD4+T淋巴细胞。
实施例2
抗原特异性的T淋巴细胞的杂交瘤细胞的制备
将实施例1获得的抗原特异性CD4+T细胞与小鼠胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4按5:1的比率混合,采用聚乙二醇(PEG)细胞融合方法进行细胞融合。将两种细胞混合后,离心,弃去培养基,在1分钟内将1毫升50%PEG加入到细胞沉淀中,边加边振摇离心管,使PEG与细胞混匀,静置1分钟后,向离心管加入不完全培养基,终止PEG作用,离心弃上清,融合后的细胞稀释到含20%胎牛血清、1×HAT含次黄嘌呤、氨基蝶啶和胸苷的DMEM选择性培养基中,按每孔1×105个细胞加入到96孔细胞培养板中,每孔200μl。将培养板放入5%CO2、37℃培养箱中继续培养。10-14天后制得T淋巴细胞的杂交瘤细胞,其制备流程参见图6A。
实施例3
T淋巴细胞的杂交瘤细胞的筛选
将实施例2获得的单克隆扩增到24孔板扩大培养,2-3天后对单克隆进行筛选。用体外抗原提呈实验检测单克隆细胞的生物学活性,用同品系普通C57BL/6小鼠的脾细胞混合特异性抗原OVA323-339的混合物加入到单克隆细胞的培养基中,孵育单克隆细胞过夜(具体方法参见David H等,Methods Mol Biol,2013,960:297–307)。24小时后,利用ELISA检测细胞培养液上清中的小鼠白介素2(mouse IL2,mIL2)的含量。分泌mIL-2的阳性克隆扩增到6孔板扩大培养,2-3天后用体外抗原提呈实验对6孔板中的杂交瘤细胞进行复检。复检时,用不同浓度的OVA323-339刺激,挑选出对抗原最敏感的克隆。根据6孔板样品的二次筛选结果,挑选细胞生长状态良好、传代(至少十几代)稳定,且分泌mIL-2量>4000pg/ml的最优单克隆进行扩大培养、液氮冻存。部分实验结果见图1和2。从图1结果中,在相同的抗原和脾细胞混合的刺激下,不同的单克隆细胞分泌mIL-2量不同,挑选出生长良好且分泌mIL-2量>4000pg/ml的单克隆复检,复检结果见图2。
经上述重复进行筛选及亚克隆,最后筛选出1株能稳定传代的杂交瘤细胞株,命名为T淋巴细胞杂交瘤细胞株8B2,该细胞株已于2017年06月14日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉市.武汉大学(邮编430072),保藏编号为CCTCC NO:C201786。
实施例4
T淋巴细胞杂交瘤在阻断一些免疫抑制分子的抗体筛选中的应用
A.过表达免疫抑制因子稳定细胞株的构建
将人淋巴细胞激活基因分子(human LAG-3,即hLAG-3)的全长基因序列(Genbank登录号:NM_002286.5)克隆到pIRES表达载体上,并包装成慢病毒(上海吉玛)。对T淋巴细胞杂交瘤细胞株8B2CCTCC NO:C201786进行慢病毒感染,感染病毒前一天接种细胞至6孔细胞培养板(1×105个细胞/ml,2ml/每孔),转染当天显微镜下观察细胞状态,确认细胞状态良好,弃去部分培养基,加入含有4μg/ml感染增强剂polybrene的完全培养基,然后再加入100μl高密度的病毒。感染24小时后,观察细胞状态,换取新鲜培养基,48小时后,在培养基中加入嘌呤霉素抗生素,进行选择性培养。
1周后,用有限稀释法在96孔培养板中培养亚克隆,将细胞消化,离心,制成细胞悬液,准确计量细胞密度,将细胞有限稀释至1×103个/毫升,再用含有嘌呤霉素抗生素的完全培养基稀释至10个细胞/毫升,然后将其接种到96孔细胞培养板,每孔0.1毫升。待克隆长大后,将单克隆孔细胞扩增到6孔板中或培养瓶中。对扩增后的克隆用抗h LAG-3受体对应的特异性抗体经流式细胞分析法检测受体表达水平。选择长势较好、表达水平较高、单克隆的细胞系T淋巴细胞杂交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)继续扩大培养并液氮冻存。构建流程见图6B图,部分实验结果见图3。在结果中,挑选出h LAG-3表达水平最高的单克隆3E4为最优克隆,扩大培养。
B.阻断免疫抑制分子抗体的筛选
将上述的T淋巴细胞杂交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)在T-175细胞培养瓶中培养至75-90%汇合度,弃去培养基,用PBS洗涤1-2次;计数后将细胞用培养液稀释至2×106细胞/ml,按照每孔50μl加到96孔细胞培养板中,然后再加入抗hLAG-3的待测抗体LAG-3 Tab1和LAG-3 Tab2,以及阴性对照hIgG4和mIgG1(上海睿智化学研究有限公司合成),每孔100μl,抗体梯度浓度0-10μg/ml(5倍梯度浓度),置于37℃、5%CO2培养箱孵育30分钟;同时收集同品系普通C57BL/6小鼠的脾细胞,处死C57BL/6普通小鼠,收集脾细胞,加入NH4OH至终浓度1%裂解细胞悬液中的红细胞,用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次,计数后将细胞用培养液稀释至4×106细胞/ml,然后再加入抗原肽OVA323-339,让脾细胞中的APC细胞与抗原肽接触,提呈抗原肽,混匀后置于37℃,5%CO2培养箱孵育30分钟。最后将脾细胞和抗原肽混合物加入已种植T杂交瘤细胞8B2_hLAG-3(3E4)和抗体的细胞培养板中,每孔50μl。将细胞培养板放在37℃、5%CO2培养箱培养过夜,40小时后,用小鼠IL-2ELISA试剂盒(R&D systems)检定上清中小鼠IL-2的浓度,部分结果见图4。结果中,在0.8-10μg/ml浓度范围中的两种抗hLAG-3的抗体LAG-3 Tab1和LAG-3 Tab2均可以增强T淋巴细胞杂交瘤分泌mIL-2,而阴性对照中hIgG4和mIgG1,其mIL-2的分泌均低于20pg/ml,说明LAG-3 Tab1和LAG-3 Tab2抗体可以阻断LAG-3对抗原提呈和识别以及下游的信号传导过程中的抑制作用。同时也说明了T淋巴细胞杂交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)可以应用于阻断免疫抑制分子抗体的筛选。
C.阻断免疫抑制分子抗体的联合用药的检测
将T淋巴细胞杂交瘤(8B2)_hLAG-3(3E4)计数后用培养液稀释至2×106细胞/ml,按照每孔50μl加到96孔细胞培养板中,然后再加入抗hLAG-3的待测抗体和抗m PD-1的待测抗体m PD-1的组合,具体组合如下1)hLAG-3 Tab和m PD-1Tab;2)hLAG-3 Tab和ratIgG;3)hIgG4和m PD-1Tab;4)hIgG4和ratIgG。其中m PD-1Tab和ratIgG的浓度为10μg/ml,h LAG-3Tab和hIgG4抗体梯度浓度0-50μg/ml(5倍梯度浓度)。每孔100μl,置于37℃、5%CO2培养箱孵育30分钟;同时收集脾细胞,计数后用培养液稀释至4×106细胞/ml,再加入抗原肽OVA323-339,混匀后置于37℃,5%CO2培养箱孵育30分钟。最后将脾细胞和抗原肽混合物加入已种植T杂交瘤细胞8B2_hLAG-3(3E4)和抗体的细胞培养板中,每孔50μl。将细胞培养板放在37℃,5%CO2培养箱培养过夜,40小时后,用小鼠IL-2ELISA试剂盒(R&D systems)检定上清中小鼠IL-2的浓度。部分结果见图5。从结果中可见,抗hLAG-3的抗体LAG-3和m PD-1抗体联合作用对于T淋巴细胞杂交瘤的激活作用要强于单独用抗hLAG-3的抗体。
Claims (10)
1.一种T淋巴细胞杂交瘤,其特征在于,其是抗原特异性的OVA 323-339 CD4+ T淋巴细胞与T胸腺瘤细胞系BW5147.G.1.4融合而成的、保藏号为CCTCC NO:C201786的T淋巴细胞杂交瘤。
2.一种抗原呈递过程中阻断免疫抑制分子作用的抗体的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)构建含目标抗原的慢病毒表达载体,用其感染权利要求1所述的T淋巴细胞杂交瘤,获得过表达目标抗原的稳定细胞株;
(2)在步骤(1)中获得的细胞株中加入待测抗体并孵育;
(3)将脾细胞和抗原肽OVA323-339混合孵育,使脾细胞中的APC细胞与抗原肽接触,提呈抗原肽;
(4)将步骤(3)中脾细胞和抗原肽混合物加入步骤(2)中孵育;
(5)检定上清中细胞因子的浓度,筛选具有阻断免疫抑制因子作用的抗体。
3.如权利要求2所述的筛选方法,其特征在于,所述步骤(2)中的T淋巴细胞杂交瘤浓度为1×105-1×107细胞/ml。
4. 如权利要求3所述的筛选方法,其特征在于,所述步骤(2)中的T淋巴细胞杂交瘤浓度为2×106 -4×106细胞/ml。
5.如权利要求3所述的筛选方法,其特征在于,所述脾细胞为C57BL/6小鼠的脾细胞,所述的细胞因子选自IL-2、IFN或TNF。
6. 如权利要求3所述的筛选方法,其特征在于,所述细胞因子为小鼠 IL-2。
7.如权利要求2-6任一项所述的筛选方法,其特征在于,所述目标抗原为人淋巴细胞激活基因分子,待测抗体为抗hLAG-3的抗体。
8.权利要求1所述的T淋巴细胞杂交瘤在体外抗原递呈细胞的研究中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的研究为在抗原递呈过程中抑制剂的动力学研究。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述的研究为抗原呈递过程中阻断免疫抑制分子作用的抗体或免疫抑制分子抗体的联合用药的筛选。
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