CN109116036A - 一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心elisa方法 - Google Patents

一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心elisa方法 Download PDF

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Abstract

一种定量检测草鱼白介素‑10的双抗体夹心ELISA方法，包括如下步骤：S1、检测抗原标准品的制备与纯化；S2、捕获抗体的制备与纯化；S3、检测抗体的制备与纯化；S4、草鱼白介素‑10的双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立。本发明的有益效果是：1、本发明以鼠抗gcIL‑10抗体为捕获抗体，以兔抗gcIL‑10酶标抗体为检测抗体，以原核表达并纯化的rgcIL‑10为标准品，首次建立了一种定量检测gcIL‑10的双抗体夹心ELISA方法。2、本发明所建立方法的特异性强，以草鱼其他细胞因子以及小鼠IL‑10等为抗原进行双抗体夹心ELISA检测均无交叉反应，仅能检测到天然或重组表达的gcIL‑10。

Description

一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法。
背景技术
白介素-10(IL-10)是一种由淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞等多种细胞分泌的细胞因子。哺乳动物IL-10作为一种多效能细胞因子，不仅能够抑制T细胞、单核细胞和巨噬细胞等的活化与多种细胞因子的产生，也能促进B细胞和天然杀伤性细胞的分化和增殖，促进单核细胞和巨噬细胞募集以及肥大细胞集落。另外，IL-10还能与其它细胞因子协同维持免疫系统的稳定。与哺乳动物相比，硬骨鱼类IL-10的研究起步较晚，近年来河豚、鲤鱼、虹鳟、斑马鱼、鲢鱼和草鱼的IL-10基因相继得到克隆鉴定。草鱼IL-10cDNA全长序列包括60bp的5’端非编码区、402bp的3’端非编码区和540bp的编码区，编码由179个氨基酸组成的草鱼IL-10蛋白(gcIL-10)。尽管IL-10的氨基酸序列在草鱼与哺乳动物之间的相似性仅为44～50％，但gcIL-10序列中也存在两个保守的哺乳动物IL-10家族基序。目前已证实gcIL-10也具有刺激免疫细胞活性和抑制炎症反应等免疫调节功能。因此，免疫或感染草鱼的血清、细胞培养物上清液和肠黏液等生物样品中的IL-10水平是评价疫苗免疫效果和鱼体抗感染免疫应答水平的重要指标之一。
细胞因子的检测方法主要包括经典的生物活性检测法、ELISA检测法和荧光定量PCR检测法。其中，ELISA检测法因其具有快速、方便、特异、灵敏度和稳定等优点，成为最常用的细胞因子检测方法。目前，国内外均已有检测人和小鼠IL-10的商品化ELISA检测试剂盒，但尚未见有草鱼等鱼用IL-10ELISA检测试剂盒。由于gcIL-10与哺乳动物IL-10的同源性较低，哺乳动物的商品化ELISA检测试剂盒并不适用于检测gcIL-10。因此，迫切需要建立一种可定性和定量检测草鱼生物样品中IL-10的双抗体夹心ELISA方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，该方法可以特异、灵敏、稳定、便捷、定量的检测草鱼血清、细胞培养物上清液和肠黏液等生物样品中的白介素-10。
本发明提供了如下的技术方案：
一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，包括如下步骤：
S1、检测抗原标准品的制备与纯化
S2、捕获抗体的制备与纯化；
S3、检测抗体的制备与纯化；
S4、草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立
S41、包被，用包被液将S2中制备的捕获抗体稀释至10μg/mL，按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，弃去孔内包被液，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S42、封闭，在经过S41处理后的96孔酶标板上，每孔加200μL封闭液，37℃封闭1.5h，弃去孔内封闭液，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S43、加样，分别将待检样品、S1中制备的不同质量浓度的检测抗原标准品以及至少30份阴性样品，按照100μL/孔加入至经过S42处理后的96孔酶标板内，混匀，37℃孵育2h，弃去孔内液体，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S44、加检测抗体，在经过S43处理后的96孔酶标板上，按100μL/孔加入S3中制备的检测抗体，所述检测抗体稀释至0.53μg/mL，37℃孵育1h，弃去孔内液体，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S45、显色、终止与测定，在经过S44处理后的96孔酶标板上，按100μL/孔加入TMB底物液，37℃避光显色5min，每孔加50μL 2M硫酸终止反应后，使用酶标仪测定各孔反应液OD450nm值，包括待检样品OD450nm值、检测抗原标准品OD450nm值以及阴性样品OD450nm值，计算阴性样品OD450nm的平均值及其标准差SD；
S46、定性判定：若待检样品则为阴性结果，说明待检样品中不含草鱼白介素-10；若待检样品则为阳性结果，说明待检样品中含有草鱼白介素-10；若则为可疑结果，需重新检测；
S47、定量检测，若经过S46定性判定后，待检样品中含有草鱼白介素-10，通过以下方法检测草鱼白介素-10的含量，以S43中检测抗原标准品质量浓度的对数为横坐标，以S45中对应的检测抗原标准品OD450nm值为纵坐标绘制标准曲线，将待检样品OD450nm值代入绘制的标准曲线中，获得待检样品中草鱼白介素-10质量浓度的对数，进而得到待检样品中草鱼白介素-10的含量。
优选的，所述S1中检测抗原标准品为草鱼白介素10重组蛋白，其制备与纯化方法如下：
以草鱼头肾组织cDNA为模板，使用白介素-10特异性引物，
上游引物-5'CCGGAATTCATGATTTTCTCTAGAGTCATCTT3'，如SEQ ID NO:1所示，下划线为EcoRⅠ酶切位点，
下游引物-5'CCGCTCGAGTTAGTGCTTTTCTCTCTTT3'，如SEQ ID NO:2所示，下划线为XhoⅠ酶切位点，
PCR扩增白介素-10基因并将其与pMD18-T连接构建pMD18-T-gcIL-10克隆载体，经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切的pMD18-T-gcIL-10和原核表达载体pET32a进行连接、转化，得到重组菌pET32a-IL-10/BL21；
将重组菌用1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷于37℃诱导培养6 h，离心收集包涵体沉淀，以包涵体形式表达的草鱼白介素-10重组蛋白，经8 mol/L尿素变性和透析复性后，使用Ni-Charged Resin亲合层析柱纯化，获得纯化的草鱼白介素-10重组蛋白。
优选的，所述S2中的捕获抗体为鼠抗草鱼白介素-10多克隆抗体，其制备与纯化方法如下：
选用5-6周龄的雄性BALB/C小鼠，先用司本-80乳化白油佐剂，所述司本-80与白油佐剂的质量比为1:24，再将草鱼白介素10重组蛋白与乳化后佐剂按体积比1:3混合均匀、制成免疫原，通过背部和颈部皮下多点注射免疫小鼠，免疫剂量200μg/只，14天后进行第二次免疫，二免后14天再进行第三次免疫，第二次与第三次免疫的途径与剂量和第一次免疫相同，免疫后第30天摘眼球采血、分离免疫血清，使用商品化的Protein G亲和层析柱纯化免疫血清，得到纯化的鼠抗草鱼白介素-10多克隆抗体。
优选的，所述S2中的检测抗体为兔抗草鱼白介素-10酶标抗体，其制备与纯化的方法如下，
选用体重为2.5-3Kg的新西兰大白兔，先用司本-80乳化白油佐剂，所述司本-80与白油佐剂的质量比为1:24，再将草鱼白介素10重组蛋白与乳化后佐剂按体积比1:3混合均匀、制成免疫原，通过背部和颈部皮下多点注射免疫小鼠，免疫剂量1mg/只，14天后进行第二次免疫，二免后14天再进行第三次免疫，第二次与第三次免疫的途径与剂量和第一次相同，第30天心脏采血、分离免疫血清，使用饱和硫酸铵分级沉淀结合Protein G亲和层析法纯化免疫血清,得到纯化的兔抗草鱼白介素-10抗体。
采用碘酸钠法对纯化的兔抗草鱼白介素-10抗体进行辣根过氧化物酶标记，取5mg辣根过氧化物酶溶于0.5mL双馏水中，加入0.5mL的0.06mol/L过碘酸钠水溶液，室温避光搅拌30min，加入0.5mL的0.16mol/L乙二醇水溶液，室温搅拌30min，终止氧化反应；向上述反应体系中加入5mg纯化的兔抗草鱼白介素-10抗体，混匀后装入透析袋，置于0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜，取出透析袋中液体，加入0.2mL的5mg/mL硼氢化钠溶液、混匀，4℃放置2h，然后加入50％饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min后，离心收集沉淀，用0.02mol/L、pH7.4的PBS重悬沉淀并装入透析袋，于4℃透析过夜，除去游离的酶、酶-酶聚合体以及盐离子，即可获得纯化的兔抗草鱼白介素-10酶标抗体。
优选的，所述S41中的包被液为50mmol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述S42中的封闭液为含有质量浓度为5％的脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，所述S4中的洗涤液均为含有1‰Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液。
优选的，所述S43中的待检样品为免疫或感染前后草鱼的血清、细胞上清液和肠黏液，其前处理方法如下：
血清样品：使用1mL无菌注射器从草鱼尾静脉采血，20-30℃放置至血液凝固，3000r/min离心10min，收集血清作为待检样品；
细胞上清液样品：体外培养的草鱼细胞经疫苗抗原或病原体刺激24-48h后，收集细胞培养液，6000r/min，4℃离心5min，取上清液作为待检样品；
肠黏液样品：无菌采取免疫或感染后草鱼肠管，置于无菌平皿中用无菌磷酸盐缓冲液冲洗三次，去除肠道外脂肪与肠系膜后，纵向剖开肠管并清除粪便，用洁净玻片刮取肠黏液，用5倍体积无菌磷酸盐缓冲液匀浆，10000r/min，4℃离心15min，取上清液作为待检样品。
本发明的有益效果是：
1)本发明以鼠抗gcIL-10抗体为捕获抗体，以兔抗gcIL-10酶标抗体为检测抗体，以原核表达并纯化的rgcIL-10为标准品，首次建立了一种定量检测gcIL-10的双抗体夹心ELISA方法。
2)本发明所建立方法的特异性强，以草鱼其他细胞因子以及小鼠IL-10等为抗原进行双抗体夹心ELISA检测均无交叉反应，仅能检测到天然或重组表达的gcIL-10。
3)本发明所建立方法的重复性好，板内重复试验变异系数为1.329％～3.226％，板间重复试验变异系数为2.505％～8.730％，两者均小于10。
4)本发明所建立方法的有效检测范围为31.25～500ng/mL，对gcIL-10检测下限为23.54ng/mL，灵敏度较高。
5)本发明所建立方法是在蛋白水平检测gcIL-10，准确性高、操作简便快速，能在3-4h完成检测且对仪器要求不高，解决了采用荧光定量PCR检测方法带来的操作繁琐，耗时费力，易受操作条件影响等问题。
6)本发明所建立方法为检测和评价免疫或感染草鱼体内的免疫应答水平提供了检测工具，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为重组表达质粒pET32a-gcIL-10的PCR鉴定与双酶切鉴定。其中，A图中M为DNA分子量标准DL2000,泳道1为重组质粒的PCR产物，泳道2为菌液PCR产物，泳道3为阴性对照；B图中M1为DNA分子量标准DL2000，泳道4为重组表达质粒pET32a-gcIL-10,泳道5为重组表达质粒pET32a-gcIL-10的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切产物。
图2为重组表达质粒pET32a-gcIL-10表达产物的SDS-PAGE分析。M为蛋白Marker，泳道1为pET32a-IL-10/BL21的未诱导产物,泳道2为pET32a-IL-10/BL21的诱导产物，泳道3为pET32a-IL-10/BL21诱导表达的上清液，泳道4为pET32a-IL-10/BL21诱导表达的包涵体沉淀，泳道5为rgcIL-10纯化蛋白。
图3为rgcIL-10蛋白的Western-blot分析。M为预染蛋白质标准分子量，泳道1为His标签蛋白，泳道2为rgcIL-10纯化蛋白。
图4为鼠抗rgcIL-10抗体纯化前后的SDS-PAGE分析。M为蛋白Maker，泳道1为纯化前鼠抗rgcIL-10抗体，泳道2为纯化后鼠抗rgcIL-10抗体。
图5为兔抗rgcIL-10酶标抗体的SDS-PAGE分析。M为蛋白Maker,泳道1为纯化前兔抗rgcIL-10抗体，泳道2为粗提的兔抗rgcIL-10抗体，泳道3为纯化后的兔抗rgcIL-10酶标抗体。
图6为检测抗原标准品浓度的对数与OD450值之间的相关曲线。其中，A图中检测抗原标准品(rgcIL-10纯化蛋白)浓度的对数与OD450值之间形成了近似“S”型曲线；B图中检测抗原标准品浓度在31.25-500ng/mL(对数值为1.495-2.699)范围内与OD450nm值之间形成了线性标准曲线，线性回归方程为y＝0.6654x-0.7478，R2＝0.9949。
图7为疫苗抗原刺激后草鱼肠巨噬细胞培养物上清液中gcIL-10转录表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做具体说明。
下面通过实施例对本发明做进一步说明,但不限制本发明。
本发明中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。
本发明中所使用溶液的配制如下：
1、pH7.4,O.O1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)
称取氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，十二水磷酸二氢钠2.9g，磷酸氢二钾0.2g溶解于800mL蒸馏水、混匀，加蒸馏水定容至1000mL，浓盐酸调节pH值至7.4，121℃高压15min,4℃保存。
2、1mol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)
称取2.383gIPTG溶解于8mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至10mL,使用0.22μm无菌微孔滤器过滤，-20℃分装保存。
3、5×蛋白上样缓冲液
称取十二烷基硫酸钠(SDS)0.5g，溴酚蓝25mg,溶解于3mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至5mL,再加入1mol/L Tris-HCl(pH6.8)1.25mL和丙三醇甘油2.5mL、混合均匀，4℃保存，使用前加入250μL 2-巯基乙醇。
4、5×SDS-PAGE电泳缓冲液
称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.04g,甘氨酸37.6g,十二烷基硫酸钠(SDS)2g，溶解于300mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至400mL，室温保存。
5、细胞裂解缓冲液
在10mL pH7.4,O.O1mol/L PBS中加入200μL溶菌酶，400μL苯甲基磺酰氟，50μLTween-20和1mL丙三醇、混匀，-20℃冰箱保存。
6、8mol/L尿素溶液
称取48g尿素溶解于50mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至100mL，室温保存。
7、饱和硫酸铵溶液
称取250g硫酸铵溶解于500mL蒸馏水中剧烈搅拌后，室温放置至其平衡，上层澄清液即为饱和硫酸钠溶液。
8、0.06mol/L过碘酸钠水溶液
称取128mg过碘酸钠溶解于8mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至10mL，需现配现用。
9、0.16mol/L乙二醇水溶液
量取0.09mL乙二醇加于10mL蒸馏水中、混合均匀即可，需现配现用。
10、5mg/mL的硼氢化钠溶液
称取50mg硼氢化钠溶解于8mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至10mL,需现配现用。
11、3，3－二氨基联苯胺(DAB)底物液(需现配现用，避光保存)
A液：称取柠檬酸9.6g溶解于500mL蒸馏水中、混匀，
B液：称取十二水磷酸二氢钠35.85g溶解于500mL蒸馏水中、混匀，
取48.6mL A液与51.4mL B液混合均匀后，加入3，3－二氨基联苯胺(DAB)40mg，待充分溶解后再加入30％(V/V)双氧水50μL，混匀即可。
12、包被缓冲液:pH9.6,50mmol/L碳酸盐缓冲液
称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g溶解800mL蒸馏水中、混匀，加蒸馏水定容至1000mL,调节pH值至9.6，121℃高压15min,4℃保存。
13、洗涤液(含Tween-20的PBS，PBST)
取0.01mol/L pH7.4PBS 1000mL，加入0.5mL Tween-20混匀，121℃高压15min,4℃保存。
14、封闭液
含5％脱脂奶粉的PBS溶液：称取5g脱脂奶粉，溶解于80mL pH7.4,O.O1mol/L PBS中、混匀，加蒸馏水定容至100mL即可。
含5％牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液：称取5g牛血清蛋白(BSA)，溶解于80mL pH7.4,O.O1mol/L PBS中、混匀，加蒸馏水定容至100mL即可。
含5％明胶的PBS溶液：称取5g明胶，溶解于80mL pH7.4,O.O1mol/L PBS中、混匀，加蒸馏水定容至100mL即可。
15、终止液(2mol/L H2SO4溶液)
取44.575mL蒸馏水放于100mL烧杯中，沿烧杯内壁缓慢加入5.425mL浓硫酸，边加边搅拌，待混合液冷却后室温保存。
16、四甲基联苯胺(TMB)显色液
A液：称取醋酸钠13.6g和柠檬酸1.6g溶解于100mL蒸馏水中，再加入30％双氧水0.3mL、混匀,最后加蒸馏水定容至500mL，避光室温保存。
B液：称取乙二胺四乙酸二钠0.2g和柠檬酸0.95g溶解于100mL蒸馏水中，再加入50mL丙三醇和含0.15g TMB的3mL二甲基亚砜中、混匀，加蒸馏水定容至500mL，避光室温保存。使用时根据需要量取等量A、B液混合使用即可。
实施例一草鱼白介素-10(gcIL-10)重组蛋白的制备与纯化
1.gcIL-10重组克隆质粒的构建与鉴定
将浓度为2mg/mL的脂多糖(LPS)按4mg/kg的剂量腹腔注射健康草鱼，注射后12h采集头肾组织、提取其总RNA，反转录为cDNA。根据NCBI中收录的gcIL-10基因序列设计一对特异性引物(上游引物为5'-CCGGAATTCATGATTTTCTCTAGAGTCATCTT-3'，如SEQ ID NO:1所示，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物为5'-CCGCTCGAGTTAGTGCTTTTCTCTCTTT-3'，如SEQ IDNO:2所示，下划线为XhoⅠ酶切位点)，以上述cDNA为模板，利用PCR扩增gcIL-10基因，将PCR纯化产物与pMD18-T连接后转入E.coli DH5α感受态细胞，经冰浴、42℃水浴热冲击后加入400μL LB培养液，37℃，160rpm培养45min,再涂布于含1‰氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养板中，37℃培养至出现菌落，挑取菌落进行PCR鉴定和测序鉴定。1.0％琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增出一条大小约为558bp的DNA条带,与目的gcIL-10的大小一致；测序结果也显示本实施例所克隆的基因gcIL-10基因无任何突变或缺失，与NCBI中收录的gcIL-10基因序列的同源性为100％。结果表明pMD18-T-gcIL-10克隆载体构建成功。
2.重组表达质粒pET32a-gcIL-10的构建与鉴定
将pMD18-T-gcIL-10和原核表达载体pET32a分别用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。50μL的双酶切体系为：重组质粒pMD18-IL-10和pET32a各25μL，XhoⅠ和EcoRⅠ各1.0μL，10×buffer 5.0μL，去离子水18.0μL。酶切产物回收纯化后置于16℃金属浴用T4DNA ligase连接12h。之后，将连接产物转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞。将转化后的E.coli BL21(DE3)接种含Amp的LB培养液，37℃，220rpm培养4h，抽提质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果如图1所示，从疑似重组质粒pET32a-gcIL-10扩增到一条大小约为558bp的DNA条带，与预期gcIL-10大小一致；疑似重组质粒pET32a-gcIL-10经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后获得了两条大小为6539bp和558bp的DNA条带，分别与pET32a与gcIL-10基因的大小一致。结果表明重组表达质粒pET32a-gcIL-10构建成功。
3.gcIL-10重组蛋白的制备与纯化
3.1gcIL-10重组蛋白的诱导表达与SDS-PAGE分析
取重组菌pET32a-IL-10/BL21接种3mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基，37℃振荡培养(150r/min)过夜。次日，上述重组菌菌液以1:100体积比转接到3mL含100μg/mL Amp的LB培养基，继续培养，直至菌液的OD600值为0.4时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导培养6h，收集菌液，10000r/min离心5min，弃去上清液，加100μL PBS重悬菌体沉淀。向20μL重悬后的菌体沉淀中加入2μL 5×蛋白上样缓冲液，离心后取上清液进行SDS-PAGE(12％分离胶，5％浓缩胶)，结果如图2所示，在分子量约为39.03kDa处出现一条浓染的蛋白条带，与预期重组gcIL-10蛋白(rgcIL-10)大小相符，而诱导表达后的pET32a/BL21(DE3)未出现该蛋白条带，说明rgcIL-10诱导表达成功。进一步将表达后菌体超声破碎(220W工作4s，间隔10s)后进行SDS-PAGE分析，发现rgcIL-10主要以包涵体形式表达。
3.2gcIL-10重组蛋白的变性与复性
取重组菌pET32a-gcIL-10/BL21接种150mL含100μg/mL Amp的LB培养基，在上述条件下进行大量诱导表达。离心收集菌体沉淀并用细胞裂解缓冲液进行重悬。重悬液于-80℃反复冻融三次，再进行超声破碎(220W工作4s，间隔10s)至菌液澄清透明，4℃离心(8 000r/min，10min)收集包涵体沉淀。向包涵体沉淀中加入8mol/L尿素溶液3mL，放置4℃过夜，使其变性。然后，将蛋白变性液转移至透析袋(截留分子量为8000)，4℃条件下于0.01mol/LpH7.4PBS透析3天，以复性蛋白。其中，前2天每隔2h换液一次，第3天每隔8h换液一次(透析液提前置于4℃，防止温差过大影响复性)。
3.3复性后的rgcIL-10蛋白的纯化
复性后的蛋白液使用商品化Ni-Charged Resin亲和层析柱纯化。具体操作按产品说明书进行。经商品化BCA蛋白浓度测定试剂盒测得rgcIL-10纯化蛋白浓度为0.9mg/mL。同时，rgcIL-10纯化蛋白经SDS-PAGE电泳后，利用凝胶成像系统中图像分析软件分析出其纯度约为97％。
3.4Western-blot分析rgcIL-10蛋白的抗原性
将诱导表达的His标签蛋白和rgcIL-10进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后电转至PVDF膜上，然后取出PDVF膜，放入5％脱脂奶粉中4℃封闭过夜。次日，用PBST清洗3次，每次1mim，加入1:5000的商品化鼠抗His标签蛋白抗体，置于水平摇床上振荡1h。振荡结束后，用PBST清洗3次，加入1:5000的商品化的辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠IgG，水平摇床上振荡1h，用DAB底物液显色。结果如图3所示，在39.03kDa处有明显的反应条带，说明rgcIL-10具有良好的抗原性。
上述结果表明本发明制备的rgcIL-10蛋白可作为免疫原和检测抗原。实施例二捕获抗体与检测抗体的制备与纯化
1.捕获抗体(鼠抗gcIL-10多克隆抗体)的制备与纯化
选用5-6周龄的雄性BALB/C小鼠(共30只)制备针对gcIL-10的多克隆抗体。用PBS将rgcIL-10纯化蛋白配成浓度为0.5mg/mL的蛋白液，并与司本白油佐剂按1:3(体积比)混合、乳化成免疫原。制备好的免疫原通过背部和颈部皮下多点注射，免疫剂量200μg/只，14天后进行第二次免疫，二免后14天再进行第三次免疫，第二次与第三次免疫的途径与剂量与第一次免疫相同。免疫后第30天摘眼球采血、分离免疫血清，并使用商品化的Protein G亲和层析柱纯化免疫血清(按说明书进行操作)。用商品化的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得纯化后的抗体浓度为1.2mg/mL；SDS-PAGE电泳后使用凝胶成像系统的图像分析软件测得抗体纯度约为98％(图4)；采用间接ELISA测得纯化抗体的效价为1:8388608。
结果表明本发明制备的鼠抗gcIL-10纯化抗体可用作双抗体夹心ELISA方法建立中的捕获抗体。
2.检测抗体(兔抗gcIL-10酶标抗体)的制备与纯化
2.1兔抗gcIL-10多克隆抗体的制备与纯化
选用体重为2.5Kg的新西兰大白兔制备兔抗gcIL-10多克隆抗体。用PBS将rgcIL-10纯化蛋白配成浓度为0.5mg/mL的蛋白液，并与司本白油佐剂按1:3(体积比)混合、乳化成免疫原。制备好的免疫原通过背部和颈部皮下多点注射，免疫剂量1mg/只，14天后进行第二次免疫，二免后14天再进行第三次免疫，第二次与第三次免疫的途径与剂量与第一次免疫相同。免疫后第30天心脏采血、分离免疫血清，并使用饱和硫酸铵分级沉淀结合Protein G亲和层析法纯化免疫血清。
2.2兔抗gcIL-10酶标抗体的制备与纯化
采用碘酸钠法用HRP标记纯化后的兔抗gcIL10抗体。取5mg HRP溶于0.5mL双馏水中，加入0.06mol/L过碘酸钠水溶液0.5mL，25℃避光搅拌30min，再加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL，25℃搅拌30min，终止氧化反应。向上述反应体系中加入5mg纯化后的兔抗gcIL-10抗体，混匀后装入透析袋(截留分子量8000)，置1000mL 0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜，使酶与抗体结合。次日，取出透析袋中液体，加入浓度为5mg/mL的硼氢化钠溶液0.2mL、混匀，4℃放置2h，然后缓慢加入50％饱和硫酸铵溶液沉淀结合物，置4℃30min后，离心收集沉淀。用少许0.02mol/L pH7.4PBS重悬沉淀并装入透析袋，于4℃透析过夜，除去游离的酶、酶-酶聚合体以及盐离子，即可获得纯化的兔抗gcIL-10酶标抗体。用商品化的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得纯化后的酶标抗体浓度为1.7mg/mL，SDS-PAGE电泳后使用凝胶成像系统的图像分析软件测得酶标抗体纯度约为97％(图5)，间接ELISA方法测得酶标抗体效价为1:6553600。
结果表明本发明制备的兔抗gcIL-10酶标抗体可用作双抗体夹心ELISA方法建立中的检测抗体。
实施例三gcIL-10的双抗体夹心ELISA检测方法的建立
1.捕获抗体最佳包被浓度和检测抗原最佳工作浓度的确定
采用方阵滴定法对捕获抗体(纯化的鼠抗gcIL-10多克隆抗体)的最佳包被浓度和检测抗原的最佳工作浓度进行优化。将纯化的捕获抗体用包被缓冲液稀释为20、10、5、2.5和1.25μg/mL五个浓度，每一横行包被一个稀释度，100μL/孔，4℃包被过夜。次日，弃去包被缓冲液液、PBST洗涤3次，每孔加200μL含5％脱脂奶粉的PBS，37℃封闭2h、PBST洗涤3次。将检测抗原标准品(rgcIL-10纯化蛋白)用稀释液稀释成100、80、60、40、35、20和10ng/mL 7个浓度，加入包被有捕获抗体的酶标板，每一纵行做一个稀释度，100μL/孔，37℃作用2h。洗板后，每孔加入1:500稀释的HRP标记的兔抗gcIL10IgG，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板后，每孔加TMB显色液100μL，37℃避光显色，终止反应后在酶标仪上测定OD450值，选择OD450值在1.0左右且抗原和抗体浓度均为最低的组合为其最佳工作浓度。结果由表1所示，捕获抗体的最佳包被浓度为10μg/mL，检测抗原的最佳工作浓度为35ng/mL。
表1捕获抗体最佳包被浓度和检测抗原最佳工作浓度的确定
2.检测抗体的最佳稀释度确定
将检测抗体(纯化的兔抗gcIL-10酶标抗体)用pH7.4,O.O1mol/L PBS进行1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400稀释，以最佳包被浓度的捕获抗体(10μg/mL鼠抗gcIL-10纯化抗体)包被酶标板，最佳工作浓度(35ng/mL)的rgcIL-10纯化蛋白为检测抗原标准品进行双抗体夹心ELISA检测，设置3个复孔，同时设立阴性对照(35ng/mL rgcIL-6纯化蛋白)，测定各孔OD450值，取其平均值，计算P/N值。结果由表2-2可见，当检测抗体的稀释度为1:3200时，P/N值最大(4.082)，从而确定检测抗体的最佳稀释度为1:3200。
表2检测抗体最佳稀释度的确定
3.最佳封闭液及封闭条件的确定
以浓度为10μg/mL的捕获抗体(纯化的鼠抗gcIL-10抗体)包被酶标板，分别选用5％脱脂奶粉、5％BSA和5％明胶作为封闭液，在37℃1.5h、37℃2h和4℃12h不同条件下进行封闭。然后，以浓度35ng/mL的rgcIL-10纯化蛋白为检测抗原标准品，1:3200稀释的兔抗gcIL-10酶标抗体为检测抗体进行双抗体夹心ELISA检测，设置3个复孔，测定各孔OD450值，计算其平均值，选择平均OD450值接近1.0时对应的封闭液及其作用条件为最佳封闭液和封闭条件。结果如表3所示，5％脱脂奶粉为最佳封闭液，其最佳封闭条件为37℃封闭1.5h。
表3最佳封闭液及封闭条件的确定
根据以上结果，确定双抗体夹心ELISA检测方法的最佳条件为：捕获抗体(纯化的鼠抗rgcIL-10多克隆抗体)的包被浓度为10μg/mL，检测抗原标准品(rgcIL-10纯化蛋白)工作浓度为35ng/mL,检测抗体(兔抗gcIL-10酶标抗体)的稀释度为1:3200，最佳封闭液及封闭条件为使用5％脱脂奶粉37℃封闭1.5h。
4.gcIL-10双抗体夹心ELISA方法的阴阳性临界值确定
随机采集30份或者30份以上的健康草鱼血清作为阴性血清，在上述筛选的最佳反应条件下进行双抗体夹心ELISA检测，每份样品重复3孔，测定各孔OD450值，计算平均OD450值及标准差SD。根据统计学原理，以 作为阴性判定标准，作为阳性判定标准，介于两者之间则判为可疑。结果计算得到30份阴性血清OD450的平均值为0.147，标准差(SD)为0.009，为0.174，因此，反应液OD450nm大于0.174，判定为阳性，即待检样品中含有gcIL-10；OD450介于0.165～0.174之间，判定为可疑，需重新检测；OD450小于0.165，判定为阴性，即待检样品中不含有gcIL-10。
5.gcIL-10双抗体夹心ELISA方法标准曲线的建立
将检测抗原标准品(rgcIL-10纯化蛋白)用PBS倍比稀释成1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906和1.953ng/mL，在确定的最佳反应条件下进行双抗体夹心ELISA。以检测抗原标准品浓度的对数为横坐标，OD450值为纵坐标绘制曲线，并求得标准曲线的线性回归方程和相关系数。以检测抗原标准品浓度的对数为横坐标，OD450值为纵坐标绘制的近似“S”型曲线如图6A所示，发现检测抗原标准品浓度在31.25-500ng/mL(对数值为1.495-2.699)范围内，其浓度与OD450值线性关系良好。根据这5个点拟合出标准曲线(图6B)并推导出标准曲线的线性回归方程为y＝0.6654x-0.7478，相关系数R2为0.9949，x为检测抗原标准品浓度的对数。
结果表明本发明建立的双抗体夹心ELISA方法的有效检测范围在31.25～500ng/mL之间，在该检测范围内将待检样品的OD450代入线性回归方程，即可算出待检样品中gcIL-10的实际含量。
6.双抗体夹心ELISA检测方法的性能评价
6.1特异性检测
用建立的双抗体夹心ELISA方法分别检测0.1μg/mL的重组草鱼白介素-10(rgcIL-10)、重组草鱼白介素-6(rgcIL-6)、重组草鱼肿瘤坏死因子α(rgcTNF-α)、重组草鱼白介素-1(rgcIL-1)、重组草鱼干扰素-γ(rgcIFN-γ)和小鼠白介素-10(mIL-10)样品，每种样品均设置3个复孔，并设空白对照，测定各孔OD450值，根据平均OD450值和已确定的临界值判定结果。结果如表4所示，除了rgcIL10外，其余样品的平均OD450值均小于0.165呈阴性。
结果表明本发明所建立的gcIL-10双抗体夹心ELISA检测方法的特异性强。
表4双抗体夹心ELISA方法的特异性试验结果
6.2灵敏度检测
将上述试验获得的临界值代入标准曲线的线性回归方程(y＝0.6654x-0.7478)，计算得到gcIL-10的检测下限为23.54ng/mL。
结果表明本发明所建立的gcIL-10双抗体夹心ELISA方法的灵敏度较好。
6.3重复性检测
(1)板内重复性试验用建立的双抗体夹心ELISA方法在同一块酶标板内检测3份不同浓度(在线性范围内)的rgcIL-10样品，每份样品重复3孔，计算每份样品OD450值的平均值和标准差(SD)，求得变异系数，以检测板内检测样品的重复性。结果如表5所示，板内重复试验变异系数为1.329％～3.226％，均小于5％，说明板内重复性好。
(2)板间重复性试验取3块酶标板，以同一批制备的捕获抗体包被，在相同条件下对3份不同浓度(在线性范围内)的rgcIL-10样品进行双抗体夹心ELISA，计算同一份样品在不同板间OD450值的变异系数(CV％)，以检测板间检测样品的重复性。结果如表6所示，板间重复试验变异系数为2.505％～8.730％，均小于10％，说明板间重复性好。
上述板内和板间重复性试验结果表明所建立的gcIL-10双抗体夹心ELISA检测方法的重复性好。
表5板内重复性试验结果
表6板间重复性试验结果
7.gcIL-10的双抗体夹心ELISA方法的检测程序
(1)包被：用包被缓冲液将捕获抗体(鼠抗gcIL-10纯化抗体)稀释成10μg/mL，按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；
(2)洗板：次日，弃去包被液，按照200μL/孔加入PBST洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
(3)封闭：每孔加200μL含5％脱脂奶粉的PBS封闭液，37℃封闭1.5h；
(4)洗板：同步骤(2)；
(5)加样：分别将待检样品及不同浓度(500、250、125、62.5和31.25ng/mL)的检测抗原标准品(rgcIL-10)按照100μL/孔加入包被有捕获抗体的酶标板，混匀，37℃孵育2h；
(6)洗板：同步骤(2)；
(7)加检测抗体：按100μL/孔加入1:3200稀释的检测抗体(HRP标记的兔抗gcIL-10IgG)，37℃孵育1h；
(8)洗板：同步骤(2)；
(9)显色、终止与测定：按100μL/孔加入TMB底物液，37℃避光显色5min，每孔加50μL 2M硫酸终止反应后，使用酶标仪测定各孔反应液OD450nm值，使用酶标仪测定各孔反应液OD450nm值，包括待检样品OD450nm值、检测抗原标准品OD450nm值，计算检测抗原标准品OD450的平均值及其标准差SD；
(10)定性判定：若待检样品则为阴性结果，说明待检样品中不含草鱼白介素-10；若待检样品则为阳性结果，说明待检样品中含有草鱼白介素-10；若则为可疑结果，需重新检测；
(11)S47、定量检测，若经过定性判定后，待检样品中含有草鱼白介素-10，通过以下方法检测草鱼白介素-10的含量，以检测抗原标准品质量浓度的对数为横坐标，以对应的检测抗原标准品OD450nm值为纵坐标绘制标准曲线，将待检样品OD450nm值代入绘制的标准曲线中，获得待检样品中草鱼白介素-10质量浓度的对数，进而得到待检样品中草鱼白介素-10的含量。
8.gcIL-10的双抗体夹心ELISA检测方法的初步应用
用浓度为20ug/mL的拟态弧菌疫苗抗原Ovieps(外膜蛋白与溶血素蛋白的优势表位串联组合而成)的重组融合蛋白(His-Ovieps，本实验室制备)刺激6组草鱼肠巨噬细胞。其中，1-3组细胞分别于刺激后12、24和36h提取细胞RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板、β-actin为内参基因进行荧光定量PCR检测gcIL-10转录表达情况(检测gcIL-10基因的上、下游引物分别为5'-CGAGAACGTGCAACAGAACATC-3'和5'-TGGTGGCAAACTCAAAGGGA-3'，如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示；内参基因β-actin的上、下游引物分别为5'-CTGTGCCCATCTATGAAGGCTA-3'和5'-ATTTCTCTCTCGGCTGTGGTG-3'，如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示)；4-6组细胞于刺激后24、36和48h，收集细胞液，6000rpm离心2min后再取上清液，并采用本发明的gcIL-10双抗体夹心ELISA检测方法检测上清液中的gcIL-10蛋白含量。同时以未刺激的草鱼肠巨噬细胞作为对照，并且每组检样设置3个重复。gcIL-10转录水平表达的检测结果如图7所示，疫苗抗原刺激细胞后12、24和36h，gcIL-10基因在转录水平均上调表达，且上调水平随刺激时间延长而增加。由表7可见，疫苗抗原刺激24、36和48h后，细胞上清液中均检测到gcIL-10，含量分别为24.369、74.260和486.188ng/mL，gcIL-10水平也是随刺激时间延长而增加。gcIL-10的蛋白水平检测结果与转录水平检测结果是相符的，说明本发明建立的gcIL-10双抗体夹心ELISA检测方法可用于疫苗免疫或微生物感染后草鱼血清或细胞培养物上清液等生物样品中IL-10的定性和定量检测。
表7疫苗抗原刺激后草鱼肠巨噬细胞培养物上清液中gcIL-10含量检测
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、检测抗原标准品的制备与纯化；
S2、捕获抗体的制备与纯化；
S3、检测抗体的制备与纯化；
S4、草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立；
S41、包被，用包被液将S2中制备的捕获抗体稀释至10μg/mL，按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，弃去孔内包被液，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S42、封闭，在经过S41处理后的96孔酶标板上，每孔加200μL封闭液，37℃封闭1.5h，弃去孔内封闭液，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S43、加样，分别将待检样品、S1中制备的不同质量浓度的检测抗原标准品以及至少30份阴性样品，按照100μL/孔加入至经过S42处理后的96孔酶标板内，混匀，37℃孵育2h，弃去孔内液体，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S44、加检测抗体，在经过S43处理后的96孔酶标板上，按100μL/孔加入S3中制备的检测抗体，所述检测抗体稀释至0.53μg/mL，37℃孵育1h，弃去孔内液体，按照200μL/孔加入洗涤液，振荡洗涤5min，重复3次，拍干；
S45、显色、终止与测定，在经过S44处理后的96孔酶标板上，按100μL/孔加入TMB底物液，37℃避光显色5min，每孔加50μL 2M硫酸终止反应后，使用酶标仪测定各孔反应液OD450nm值，包括待检样品OD450nm值、检测抗原标准品OD450nm值以及阴性样品OD450nm值，计算阴性样品OD450nm的平均值及其标准差SD；
S46、定性判定：若待检样品则为阴性结果，说明待检样品中不含草鱼白介素-10；若待检样品则为阳性结果，待检样品中含有草鱼白介素-10；若则为可疑结果，需重新检测；
S47、定量检测，若经过S46定性判定后，待检样品中含有草鱼白介素-10，通过以下方法检测草鱼白介素-10的含量，以S43中检测抗原标准品质量浓度的对数为横坐标，以S45中对应的检测抗原标准品OD450nm值为纵坐标绘制标准曲线，将待检样品OD450nm值代入绘制的标准曲线中，获得待检样品中草鱼白介素-10质量浓度的对数，进而得到待检样品中草鱼白介素-10的含量。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述S1中检测抗原标准品为草鱼白介素10重组蛋白，其制备与纯化方法如下：
以草鱼头肾组织cDNA为模板，使用白介素-10特异性引物，
上游引物-5'CCGGAATTCATGATTTTCTCTAGAGTCATCTT3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点，
下游引物-5'CCGCTCGAGTTAGTGCTTTTCTCTCTTT3'，下划线为XhoⅠ酶切位点，
PCR扩增白介素-10基因，并将其与pMD18-T连接构建pMD18-T-gcIL-10克隆载体，经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切的pMD18-T-gcIL-10和原核表达载体pET32a进行连接、转化，得到重组菌pET32a-IL-10/BL21；
将重组菌用1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷于37℃诱导培养6h，离心收集包涵体沉淀，以包涵体形式表达的草鱼白介素-10重组蛋白，经8mol/L尿素变性和透析复性后，使用Ni-Charged Resin亲合层析柱纯化，获得纯化的草鱼白介素-10重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述S2中的捕获抗体为鼠抗草鱼白介素-10多克隆抗体，其制备与纯化方法如下：
选用5-6周龄的雄性BALB/C小鼠，先用司本-80乳化白油佐剂，所述司本-80与白油佐剂的质量比为1:24，再将草鱼白介素10重组蛋白与乳化后佐剂按体积比1:3混合均匀、制成免疫原，通过背部和颈部皮下多点注射免疫小鼠，免疫剂量200μg/只，14天后进行第二次免疫，二免后14天再进行第三次免疫，第二次与第三次免疫的途径与剂量和第一次免疫相同，免疫后第30天摘眼球采血、分离免疫血清，使用商品化的Protein G亲和层析柱纯化免疫血清，得到纯化的鼠抗草鱼白介素-10多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述S2中的检测抗体为兔抗草鱼白介素-10酶标抗体，其制备与纯化的方法如下：
选用体重为2.5-3Kg的新西兰大白兔，先用司本-80乳化白油佐剂，所述司本-80与白油佐剂的质量比为1:24，再将草鱼白介素10重组蛋白与乳化后佐剂按体积比1:3混合均匀、制成免疫原，通过背部和颈部皮下多点注射免疫小鼠，免疫剂量1mg/只，14天后进行第二次免疫，二免后14天再进行第三次免疫，第二次与第三次免疫的途径与剂量和第一次相同，第30天心脏采血、分离免疫血清，使用饱和硫酸铵分级沉淀结合Protein G亲和层析法纯化免疫血清,得到纯化的兔抗草鱼白介素-10抗体；
采用碘酸钠法对纯化的兔抗草鱼白介素-10抗体进行辣根过氧化物酶标记，取5mg辣根过氧化物酶溶于0.5mL双馏水中，加入0.5mL的0.06mol/L过碘酸钠水溶液，室温避光搅拌30min，加入0.5mL的0.16mol/L乙二醇水溶液，室温搅拌30min，终止氧化反应；向上述反应体系中加入5mg纯化的兔抗草鱼白介素-10抗体，混匀后装入透析袋，置于0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜，取出透析袋中液体，加入0.2mL的5mg/mL硼氢化钠溶液、混匀，4℃放置2h，然后加入50％饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min后，离心收集沉淀，用0.02mol/L、pH7.4的PBS重悬沉淀并装入透析袋，于4℃透析过夜，除去游离的酶、酶-酶聚合体以及盐离子，即可获得纯化的兔抗草鱼白介素-10酶标抗体。
5.根据权利要求1所述的一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述S41中的包被液为50mmol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述S42中的封闭液为含有质量浓度为5％的脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，所述S4中的洗涤液均为含有1‰Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测草鱼白介素-10的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，所述S43中的待检样品为免疫或感染前后草鱼的血清、细胞上清液和肠黏液，其前处理方法如下：
血清样品：使用1mL无菌注射器从草鱼尾静脉采血，20-30℃放置至血液凝固，3000r/min离心10min，收集血清作为待检样品；
细胞上清液样品：体外培养的草鱼细胞经疫苗抗原或病原体刺激24-48h后，收集细胞培养液，6000r/min，4℃离心5min，取上清液作为待检样品；
肠黏液样品：无菌采取免疫或感染后草鱼肠管，置于无菌平皿中用无菌磷酸盐缓冲液冲洗三次，去除肠道外脂肪与肠系膜后，纵向剖开肠管并清除粪便，用洁净玻片刮取肠黏液，用5倍体积无菌磷酸盐缓冲液匀浆，10000r/min，4℃离心15min，取上清液作为待检样品。
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