CN107266570A

CN107266570A - 一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒

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Publication number: CN107266570A
Application number: CN201710514088.2A
Authority: CN
Inventors: 郑世军; 高俊峰; 王永强; 李晓齐; 曹红
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2017-10-20

Abstract

本发明公开了一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒。本发明利用chIL‑10单克隆抗体建立了针对chIL‑10在蛋白水平上的双夹心ELISA检测方法。通过实验证明：本发明的抗chIL‑10单克隆抗体具有良好的特异性和亲和力，能够准确地反映出血清或细胞上清中chIL‑10的含量，且本发明的检测方法快捷、高效又准确，解决了现有技术中采用荧光定量PCR检测方法带来的操作繁琐，耗时耗力，易受操作及其他外部条件影响等问题，不仅有助于评价chIL‑10在机体内的动态变化水平，为疾病的预防和治理提供很好的参考，而且有助于了解禽类传染性疾病的发生、发展、转归情况及机体保护性免疫反应的动态。

Description

一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测禽白细胞介素10(IL-10)含量的方法及其专用试剂盒。

背景技术

1989年，Fiorentino等最先描述了白介素10是一种由2型辅助T细胞(Th2)分泌的、抑制Th1细胞中IL-2和IFN-γ合成的新的免疫介质。2004年，LisaRothwell等从感染艾美耳球虫的鸡盲肠扁桃体提取总RNA，经RT-PCR获得chIL-10的全长cDNA序列，其编码一条175个氨基酸的多肽，其中有21个氨基酸组成信号肽，成熟肽段长154个氨基酸。鸡IL-10与人IL-10和鼠IL-10的氨基酸序列同源性分别为45％和42％。鸡IL-10基因包含5个外显子和4个内含子。

树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等细胞可以分泌IL-10，此外，TH1、TH2、TH17、Treg以及B细胞亚群也被证实可以分泌IL-10。IL-10能够抑制CD4+T细胞的增殖和细胞因子包括Th1型IL-2、IFN-γ和Th2型IL-4、IL-5的合成。IL-10抑制单核/巨噬细胞释放炎症介质，并因此抑制了LPS和IFN-γ诱导其分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF和GM-CSF。此外，IL-10可以阻止B细胞凋亡，增强其增殖、分化和MHC II类分子的表达，而且在Ig类别转换中IL-4起着积极的作用。IL-10在调节免疫系统中发挥重要作用。

目前，已有在蛋白水平上检测人和小鼠IL-10的商品化试剂盒，但是由于chIL-10与人和小鼠IL-10的同源性仅分别为45％和42％，所以目前国内，无论是在学术研究还是临床疾病分析中主要还是以荧光定量PCR检测chIL-10的相对含量。但由于mRNA水平与蛋白水平并不呈绝对的线性关系，所以应用荧光定量PCR并不能反应出鸡IL-10蛋白的实际水平，故其并不能作为一个检测鸡IL-10蛋白量的实验技术而应用，同时荧光定量PCR技术操作繁琐，对专业技能要求较高且价格昂贵，不宜用于生产实际。

发明内容

本发明的第一个目的是提供抗chIL-10的单克隆抗体。

本发明提供的抗chIL-10的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.13836的杂交瘤细胞株1G11和保藏号为CGMCC No.13837的杂交瘤细胞株1D6分泌的。将保藏号为CGMCCNo.13836的杂交瘤细胞株1G11分泌的抗chIL-10的单克隆抗体命名为1G11抗体，将保藏号为CGMCC No.13837的杂交瘤细胞株1D6分泌的抗chIL-10的单克隆抗体命名为1D6抗体。

本发明的第二个目的是提供分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明提供的分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株为1G11和1D6。杂交瘤细胞株1G11的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.13836。

杂交瘤细胞株1D6的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.13837。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的酶联免疫试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的酶联免疫试剂盒包括上述1G11抗体和/或1D6抗体。

上述酶联免疫试剂盒还包括chIL-10标准品；所述chIL-10标准品是通过将核苷酸序列如序列表中序列1所示的chIL-10基因在原核细胞中进行表达获得的。

所述酶联免疫试剂盒中还包括如下中的至少一种：酶标板、包被缓冲液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP标记的链霉亲和素)、显色液和终止液。

本发明的第四个目的是提供上述抗chIL-10的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒的新用途。

本发明提供了上述抗chIL-10的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量中的应用。

上述抗chIL-10的单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法是以1G11抗体为包被抗体、生物素化的1D6抗体为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。

上述方法检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法具体包括如下步骤：

(1)将1G11抗体包被到酶标板上，洗涤；

(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；

(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-10标准品或待测样品，孵育，洗涤；

(4)向(3)得到的酶标板中加入生物素化的1D6抗体，孵育，洗涤；

(5)向(4)得到的酶标板中加入HRP标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；

(6)向(5)得到的酶标板中加入底物显色，显色后加入终止液终止反应；

(7)用酶标仪检测加入chIL-10标准品的各孔的吸光度值，以chIL-10标准品浓度为横坐标、以酶标仪的读数为纵坐标绘制标准曲线；

(8)用酶标仪检测加入待测样品的孔的吸光度值，将吸光度值代入所述标准曲线，即得待测样品中chIL-10的浓度。

上述方法中，

所述步骤(1)中，用碳酸盐缓冲液将1G11抗体稀释后包被到酶标板上；

所述步骤(2)中，用脱脂奶溶液封闭(1)得到的酶标板；

所述步骤(3)中，用BSA溶液将chIL-10标准品稀释后加入酶标板中；

所述步骤(4)中，用BSA溶液将生物素化的1D6抗体稀释至1μg/mL后加入酶标板中。所述生物素化的1D6抗体的制备方法参照抗体生物素标记试剂盒(购自ThermoScientific，Prod#21440)中说明书中的方法。

上述方法中，

所述步骤(1)中，所述抗体的浓度稀释为4μg/mL；所述包被的条件为4℃包被12h；所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.05M，pH为9.6；

所述步骤(2)中，所述脱脂奶溶液(溶剂为洗涤缓冲液)的质量分数为5％；所述封闭的条件为37℃封闭3h；

所述BSA溶液(溶剂为洗涤缓冲液)的质量分数为1％；

所述步骤(3)中，所述孵育时间为2h；

所述步骤(4)中，所述孵育时间为45min；

所述步骤(5)中，所述孵育时间为15min；

所述用酶标仪检测吸光度值时的波长为450nm；

所述底物为TMB；所述终止液为2M H₂SO₄。

本发明在酶联免疫的基础上结合生物素-链霉亲和素系统建立双抗体夹心ELISA，该方法利用标记了抗体的生物素和HRP标记的链霉亲和素之间的高亲和力及高特异性结合，使大量的酶分子聚集在抗原抗体复合物周围，产生多级放大作用，使每个抗体携带的酶分子显著增加，从而极大地提高灵敏度。

与荧光定量PCR相比，本发明所建立的双抗体夹心ELISA检测方法有以下优点：(1)样品处理简单，不需要取动物的组织进行RNA的提取及反转录，仅采取少量动物的血液，分离血清进行适当稀释后，即可进行检测；(2)简单、快速，操作方法简单，且整个检测过程仅需3-4个小时；(3)准确性高，直接在蛋白水平上针对ch IL-10进行检测，不易受操作或是其他外部条件影响；(4)成本低、对仪器要求不高。

本发明利用禽IL-10单克隆抗体建立了针对IL-10在蛋白水平上的双夹心ELISA检测方法，可以用于检测血清及细胞上清中IL-10含量。通过实验证明：本发明的禽IL-10单克隆抗体具有良好的特异性和亲和力，能够准确地反映出血清或细胞上清中禽IL-10的含量，且本发明的检测方法快捷、高效又准确，解决了现有技术中采用PCR检测方法带来的操作繁琐，耗时耗力，易受操作及其他外部条件影响等问题，不仅有助于评价IL-10在机体内的动态变化水平，为疾病的预防和治理提供很好的参考，而且有助于了解禽类传染性疾病的发生、发展、转归情况及机体保护性免疫反应的动态。

附图说明

图1为单克隆抗体的纯化。

图2为单抗抗原表位识别区分析。A：chIL-10截短示意图(△1和△2)；B,C,D：Western Blot分析1D6株和1G11株单抗对不同截短蛋白的识别情况；E：各株单抗抗原表位识别区域示意图。

图3为单克隆抗体特异性鉴定。A,B,C,D分别以His-tag单抗和纯化的1G11株单抗、1D6株单抗为一抗进行单抗特异性分析。

图4为标准曲线的建立。

图5为His-IL-10的复性和Western Blot鉴定。A：M:蛋白分子量标准；1：pET-30a空载体诱导前；2：pET-30a空载体诱导后；3：HIS-IL-10诱导前；4：HIS-IL-10诱导后；5：HIS-IL-10超声裂解上清液；6：HIS-IL-10超声裂解沉淀；7：复性后HIS-IL-10。B：1：pET-30a空载体诱导前；2：pET-30a空载体诱导后；3：HIS-IL-10诱导前；4：复性后His-IL-10。

图6为GST-IL-10的可溶性分析和Western blot验证。A：M:蛋白分子量标准；1：pGXE-6p-1空载体诱导后；2：GST-IL-10诱导前；3：GST-IL-10诱导后 4：GST-IL-10超声裂解上清液；5：GST-IL-10超声裂解沉淀。B：1：pGXE-6p-1空载体诱导后；2：GST-IL-10诱导前；3：GST-IL-10诱导后。

图7为IL-10mRNA水平检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的溶液的配方如下：

1、包被缓冲液为0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.0)，是将A液438.5mL和B液61.5mL混匀得到的溶液，其中A液和B液的配方如下：

2、洗涤缓冲液(PBST，pH7.4)的配方如下：

试剂	用量
		KH₂PO₄	0.2g
Na₂HPO₄·12H₂O	2.9g
		NaCl	8.0g
KCl	0.2g
		Tween-20	0.5mL
蒸馏水	1000mL

3、封闭液(5％的脱脂奶)的配方如下：

试剂	用量
		脱脂奶	5g
洗涤缓冲液	100mL

4、样品及抗体稀释液(1％的BSA)的配方如下：

试剂	用量
		牛血清白蛋白(BSA)	1g
洗涤缓冲液	100mL

5、终止液(2M H₂SO₄)的配置方法

试剂	用量
		浓硫酸	22mL
水	178mL

6、PBS(pH 7.4)

称取8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄溶解于800mL蒸馏水，浓盐酸调节pH值至7.4，定容至1L，121℃高压20min，4℃保存。

下述实施例中的原核表达的chIL-2在文献“付梦姣等，IL-2单克隆抗体的制备与鉴定，中国兽医杂志”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

下述实施例中的原核表达的chIL-4在文献“关晓宇等，抗鸡白介素4单克隆抗体的制备与鉴定，生物工程学报”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

下述实施例中的缓冲液的制备方法如下：

1、0.05M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.8)

A液：称取1.5g甘氨酸溶于100mL蒸馏水中，制成0.2M甘氨酸作为母液备用。B液：量取1.65mL浓盐酸，用蒸馏水定容至100mL，制成0.2M盐酸作为母液备用。取A液25mL，B液8.4mL，加蒸馏水定容至100mL。

2、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0-5.0)

A液：称取柠檬酸10.5g溶于500ml蒸馏水中，制成0.05M柠檬酸作为母液备用。B液：称取柠檬酸钠14.7g溶于500ml蒸馏水中，制成0.05M柠檬酸钠作为母液备用。将93ml A液和7ml B液混匀，得到0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)。

将65.5ml A液和34.5ml B液混匀，得到0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)。将41ml A液和59ml B液混匀，得到0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)。

3、0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.0-8.0)

A液：称取二水磷酸二氢钠3.9g溶于500ml蒸馏水中，制成0.05M磷酸二氢钠作为母液备用。B液:称取十二水磷酸氢二钠8.975g溶于500ml蒸馏水中，制成0.05M磷酸氢二钠作为母液备用。将87.7ml A液和12.3ml B液混匀，得到0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。将39mlA液和61ml B液混匀，得到0.05M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。将5.3ml A液和94.7ml B液混匀，得到0.05M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)。

4、0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)

称取1.59g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠，溶于1 000mL蒸馏水中。

5、0.05M碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH 10)

A液：称取0.21g碳酸氢钠溶于50ml蒸馏水中制成0.05M碳酸氢钠作为母液备用。B液:称取0.4g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水中制成0.1M氢氧化钠作为母液备用。取A液50mL，B液10.7mL，加蒸馏水定容至100mL后混匀。

下述实施例中的封闭液的配方如下：

1、5％的脱脂奶：称取5g脱脂奶，溶于80mL PBST中，最后定容至100mL。

2、2％的BSA：称取2g BSA，溶于80mL PBST中，最后定容至100mL。

3、1％的明胶：称取1g明胶，溶于80mL PBST中，搅拌溶解，最后定容至100mL。

4、5％的脱脂奶+1％的酪蛋白：称取0.5g酪蛋白，用PBST定容至50mL，搅拌溶解过夜，然后与等量的5％的脱脂奶混合。

实施例1、用于检测禽白细胞介素10(IL-10)的酶联免疫检测试剂盒及双抗体夹心ELISA检测方法的建立及条件的优化

一、用于检测禽白细胞介素10(IL-10)的酶联免疫检测试剂盒的制备

本发明的用于检测禽白细胞介素10(IL-10)的酶联免疫检测试剂盒包括聚苯乙烯酶标反应板、IL-10标准品(重组蛋白His-chIL-10，夹心蛋白)、抗IL-10单克隆体1G11(包被抗体)、抗IL-10单克隆抗体1D6(检测抗体)、0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6，包被液)、PBST(pH7.4，洗涤缓冲液)、5％脱脂奶(封闭液)、1％BSA(样品及抗体稀释液)、HRP标记的链霉亲和素、底物TMB、2M H₂SO₄溶液(终止液)。

1、免疫原的制备

(1)鸡IL-10原核表达载体的构建

将序列1所示的鸡IL-10基因序列插入到载体pET-30a(购自优宝生物公司，产品目录号为VT1212)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点间，且保持载体pET-30a的其他序列不变，得到pET-30a-chIL-10质粒。

将序列1所示的鸡IL-10基因序列插入到载体pGEX-6p-1(购自优宝生物公司，产品目录号为VT1258)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点间，且保持载体pGEX-6p-1的其他序列不变，得到pGEX-6p-1-chIL-10质粒。

(2)重组菌的构建及重组蛋白的诱导表达与纯化

1)分别将质粒pET-30a-chIL-10和pGEX-6p-1-chIL-10转化到Rosetta(DE3)(北京康为世纪生物，货号为CW0811A)中，分别得到重组菌。

2)分别向重组菌中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导6h，离心收集菌体。菌体经超声裂解(其功率比为35％，槽温度为46℃，超声3s，停3s，超声总时间为30min)后12000r/min离心20min，分离上清和沉淀。通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况并用Westernblotting进行验证后，提取包涵体，并进行稀释复性，分别得到纯化后的重组蛋白His-chIL-10(22kDa)和GST-chIL-10(40kDa)。SDS-PAGE和Western blotting检测结果如图5和图6。重组蛋白His-chIL-10用于免疫小鼠，GST-chIL-10用于杂交瘤细胞筛选。

上述纯化的具体步骤如下：1、将上清液过柱，流速为10倍柱体积/小时。2、使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。3、使用5倍柱体积的SolubleElution Buffer洗脱，收集洗脱峰。4、洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble BindingBuffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2-8℃保存。

2、小鼠免疫及杂交瘤细胞株的获得

以重组蛋白His-chIL-10为抗原，免疫8周龄雌性BALB/c小鼠。首次免疫，抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，颈背部皮内多点注射，50μg/只。3周后进行二免，抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，50μg/只。3周后进行三免，免疫剂量与途径同二免。三免1周后，小鼠断尾采血分离血清，以重组蛋白GST-chIL-10所包被的酶标反应板用间接ELISA的方法测定血清抗体效价，当效价大于1∶10 000时，小鼠达到融合以制备单克隆抗体的标准。在细胞融合前3d，进行加强免疫，小鼠腹腔注射抗原，50μg/只。

3、细胞融合

小鼠三次免疫后取小鼠血清采用间接ELISA进行抗体效价检测，效价合格者进行加强免疫用于细胞融合。细胞融合的具体步骤如下：将准备好的sp2/0杂交瘤细胞和免疫脾细胞按照1:2-1:5的比例混合，加到一个无菌的50mL离心管中，4℃，1000rpm离心10min，弃上清，将盛有细胞的离心管插入37℃的温水中，一边轻轻晃动离心管，一边吸取1mL溶解好的PEG4000融合剂，一滴一滴加入到细胞泥中，在60s内完成此操作，然后静止60s,之后按照如下方法加入15mL10％DMEM培养液：第1-2min缓缓加入1mL10％DMEM培养液，第三分钟加入1mL，第四分钟加入2mL，然后在3min内加入余下的10％DMEM培养液，1000rpm离心10min，弃上清，加入40mLHAT选择培养液悬浮沉淀细胞，将悬浮细胞加入96孔板中，100uL/孔，置于37℃CO₂培养箱培养。

上述间接ELISA进行抗体效价检测的具体步骤如下：用pH9.6的碳酸盐缓冲液(包被液)将GST-chIL-10蛋白稀释至1ug/ml，100uL/孔包被CORNING酶标板，4℃过夜；甩干孔内残留液体，每孔加入300uL PBST，洗涤3次，3min/次；甩干孔内残留液体后每孔加入300uL5％脱脂乳，4℃封闭过夜；洗涤；断尾采血，将阴阳性血清分别做2倍比稀释，将稀释好的血清加入酶标板，100uL/孔，每个稀释度做三个以上的平行孔，37℃孵育1小时，清洗5遍；加1：5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY(IgG)酶标二抗100ul/孔，37℃孵育1小时；PBST洗涤三遍；甩干孔内残留液体，加入稀释好的酶标二抗溶液，37℃孵育1小时；PBST洗涤；加TMB显色剂100ul/孔，室温显色10-15分钟，每孔加50ul终止液后酶标仪检测D₄₅₀值。结果的判定由检测OD₄₅₀>标准阴性样品的均值+2x标准阴性样品的标准差进行阳性判定，在统计学上该判定结果可以达到95％的置信区间。

4、阳性杂交瘤细胞筛选

待融合的细胞克隆生长到1/4-1/3时，利用间接ELISA方法对培养上清进行检测，方法同血清抗体效价测定，加入阴阳性血清对照和sp2/0细胞上清对照，用sp2/0细胞上清值作为临界值筛选阳性杂交瘤细胞，阴性孔三天后再检一次，如仍为阴性则弃之。经两次间接ELISA检测为阳性的细胞孔，选择阳性值较高的进行扩大培养和亚克隆。

5、阳性杂交瘤细胞的亚克隆

将阳性细胞轻轻吹起，取少量细胞稀释后用台盼蓝染色液进行细胞计数，用细胞培养液将阳性杂交瘤细胞10倍稀释后，吸取80-100个杂交瘤细胞加入到10mL15％DMEM培养液中，混匀，将稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板中，使每孔内大约含有1个杂交瘤细胞，每个阳性克隆铺一块板，另外每块板内有1孔加入10个细胞，1个孔内加入100个细胞以避免阳性细胞的丢失，将细胞放于37℃培养箱培养，待细胞长至覆盖孔底部1/4-1/3时，吸取细胞上清利用间接ELISA进行检测，选择只有一个细胞克隆的阳性孔再次进行克隆，亚克隆一共做3-4次。当获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，进行扩大培养。最终获得三株可稳定分泌chIL-10抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1G11和1D6。

杂交瘤细胞株1G11的分类命名为杂交瘤细胞系(小鼠来源)，该杂交瘤细胞株已于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.13836。

6、单克隆抗体的制备及鉴定

挑选经产BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡1mL/只，7d后分别将步骤5筛选得到的2株杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔进行腹水制备，杂交瘤细胞注射量为2.0×10⁶个/只。收集的腹水经离心后收集上清，利用正辛酸饱和硫酸铵沉淀法进行纯化(图1)。其中，杂交瘤细胞株1G11分泌的chIL-10单克隆抗体命名为抗chIL-10单克隆抗体1G11(1G11抗体)；杂交瘤细胞株1D6分泌的chIL-10单克隆抗体命名为抗chIL-10单克隆抗体1D6(1D6抗体)，并分别对其特性进行鉴定，包括亚型鉴定、腹水效价测定、亲和力测定、抗体特异性鉴定及抗原表位分析。

(1)单克隆抗体的抗原表位分析

构建chIL-10的截短蛋白的表达载体△1(His-chIL-10 1-102aa)和△2(His-chIL-10 52-154aa)，然后在Rosetta(DE3)(北京康为世纪生物，货号为CW0811A)分别诱导各个截短蛋白的表达载体，并分别以此为抗原，以ChIL-10单克隆抗体为一抗，以HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗通过Western blotting分析单克隆抗体的抗原识别区。

上述chIL-10的截短蛋白的表达载体△1(His-chIL-10 1-102aa)为将序列2所示的DNA片段插入到载体pET-28a的BamH和XhoⅠ酶切位点间，且保持载体pET-28a的其他序列不变后得到的载体。

上述△2(His-chIL-10 52-154aa)，为将序列3所示的DNA片段插入到载体pET-28a的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点间，且保持载体pET-28a的其他序列不变后得到的载体。

结果如图2所示。结果表明：1D6单抗识别的抗原表位区域为chIL-10N端的1-52aa，1G11识别的是chIL-10N端的52-102aa。

(2)单克隆抗体得特异性检测

以原核表达的重组蛋白His-chIL-4、His-chIL-2、His-chIL-10和His-chIFN-γ为抗原，经SDS-PAGE后转印至PVDF膜；分别以His-tag单抗和纯化的1G11株单抗、1D6株单抗为一抗；以HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗进行Western blotting，检测单克隆抗体的特异性。

上述原核表达的His-chIFN-γ表达载体为将序列4所示的鸡IFN-γ基因序列插入载体pET-28a(购自EMD Biosciences(Novagen)，产品目录号为69864-3)的EcoRⅠ和HindIII酶切位点间，且保持载体pET-28a的其他序列不变后得到的载体。

结果图3所示。结果表明：2株单抗均只识别原核表达的His-chIL-10蛋白，而不识别原核表达的His-chIL-2、His-chIL-4和His-chIFN-γ，表明2株单抗特异性良好。

(3)单克隆抗体的Ig亚类的鉴定

按照Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鉴定试剂盒说明书进行单克隆抗体亚型的鉴定。结果表明，2株抗体的亚型均为IgG1。

(4)单克隆抗体得亲和力检测

利用间接ELISA方法测定单克隆抗体的亲和力，具体步骤如下：以2μg/mL重组蛋GST-chIL-10包被酶标反应板，封闭后加入倍比稀释的单克隆抗体，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，酶标仪读取OD450吸光值。当连续几个稀释度的OD450读数不再增大时视为抗原抗体100％结合，以抗体浓度(mol/L)为横坐标，OD450吸光值为纵坐标做散点图，生成对数趋势线和公式。将OD450最大值的一半带入公式，求出此时的抗体浓度即为单克隆抗体的亲和力解离常数(Kd)。结果表明：1D6和1G11抗体的亲和力解离常数分别为5.01×10^-10和7.59×10^-10，2株抗体的亲和力良好。

二、双抗体夹心ELISA检测方法的建立及条件的优化

本发明在酶联免疫的基础上结合生物素-链霉亲和素系统建立了双抗体夹心ELISA检测方法，该方法以1G11抗体为包被抗体、以His-chIL-10为夹心蛋白，以生物素标记1D6抗体为检测抗体，并利用标记了抗体的生物素和HRP标记的链霉亲和素之间的高亲和力及高特异性结合，使大量的酶分子聚集在抗原抗体复合物周围，产生多级放大作用，使每个抗体携带的酶分子显著增加，从而极大地提高灵敏度。

按照常规双抗体ELISA方法进行操作，每优化一个条件则固定其他条件。当优化好一个条件A，那么下一次优化另一条件B时，则采用A的条件，其他条件仍固定，以此类推，直到所有的条件优化完毕。每完成一次条件优化，需对得到的数据进行处理，综合考虑P/N值(P/N值＝阳性对照OD450均值/阴性对照OD450均值，通常以P/N值最大，且P值接近1，N值较小作为最佳反应条件的判定依据)以及线性关系良好的夹心蛋白浓度范围两方面，确定最佳反应条件。

1、包被条件的优化

分别以0.05M甘氨酸-盐酸(pH2.8)、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0)、0.05M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)、0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.0)、0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.0)、0.05M磷酸盐缓冲液(pH8.0)、0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)和0.05M碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH10)为包被液。将1G11抗体稀释至浓度为10μg/mL，4℃包被12h，1％的PBST洗涤3遍后，用5％的脱脂奶4℃封闭12h后洗涤，加入以PBS进行倍比稀释的重组蛋白GST-IL-10，并以PBS为阴性对照，37℃孵育1h后洗涤。用PBS按1:1000对生物素化抗体(生物素化抗体的制备方法参照抗体生物素标记试剂盒(购自ThermoScientific，Prod#21440)中Thermo Scientific，Prod#21440说明书)进行稀释，37℃孵育1h后洗涤，用1％的BSA按1:10 000对HRP标记的链霉亲和素(购自Thermo Scientific，Prod#21130)进行稀释，37℃孵育30min后洗涤，加入显色液TMB后2M H₂SO₄终止。在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳包被液。

在优化包被温度及时间时，用最佳包被液对抗体进行稀释，分别室温包被12h、4℃包被12h和37℃包被2h，其他反应条件同上，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳包被温度及时间。

在优化包被浓度时，用最佳包被液将抗体分别稀释到5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL，采用最佳包被温度及时间，其他反应条件同上，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳包被浓度。

根据上述优化结果，最佳的包被条件如下：0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释包被抗体至4μg/mL，4℃包被12h。

2、封闭条件的优化

采用已优化的最佳反应条件，分别以5％的脱脂奶、1％的BSA、1％的明胶和5％小牛血清作为封闭液，在37℃分别封闭1h、2h和3h，其他反应条件同上，作为封闭液，在4℃，12h和37℃，3h的条件下进行封闭，其他反应条件同上，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳封闭条件。

根据上述优化结果，最佳的封闭条件如下：5％的脱脂奶，37℃封闭3h。

3、生物素化抗体以及HRP标记的链酶亲和素稀释比例的优化

采用已优化的最佳反应条件，分别将生物素化抗体按1:5000、1:10000和1:15000进行稀释，其他反应条件同上，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳生物素化抗体稀释比例。

根据上述优化结果，最佳生物素化抗体稀释比例为1:15000；最佳HRP标记的链酶亲和素稀释比例为1:10000。

4、夹心蛋白孵育时间的优化

采用已优化的最佳条件，夹心蛋白分别孵育0.5h、1.0h、1.5h和2.0h，其他反应条件不变，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳夹心蛋白孵育时间。

根据上述优化结果，最佳夹心蛋白孵育时间2.0h。

5、生物素化抗体孵育时间的优化

采用已优化的最佳反应条件，生物素化抗体分别孵育30min、45min、1.0h、1.5h和2.0h，其他反应条件不变，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳生物素化抗体孵育时间。

根据上述优化结果，最佳生物素化抗体孵育时间为45min。

6、HRP标记的链霉亲和素孵育时间的优化

采用已优化的最佳反应条件，HRP标记的链霉亲和素分别孵育15min、30min、45min和60min，其他反应条件不变，在酶标仪上读取OD450吸光值，根据判定条件确定最佳HRP标记的链霉亲和素的孵育时间。

根据上述优化结果，最佳HRP标记的链霉亲和素的孵育时间为15min。

7、最佳反应条件的确定

通过上述对反应条件的优化，最终确定双抗体夹心ELISA检测方法的具体步骤如下：pH9.6碳酸盐缓冲液稀释包被抗体至4μg/mL，4℃包被12h；5％的脱脂奶，37℃封闭3h；用1％的BSA稀释夹心蛋白，37℃孵育2h；用1％的BSA按照1:15000的比例将生物素化抗体稀释至1μg/mL，37℃孵育45min；用1％的BSA按照1:10000的比例稀释HRP标记的链霉亲和素，37℃孵育15min。

实施例2、用于检测禽IL-10的酶联免疫检测试剂盒的灵敏度检测

一、本发明的用于检测禽IL-10的酶联免疫检测试剂盒的灵敏度检测

按照实施1中确定的双抗体夹心ELISA检测方法的最优条件，以1G11抗体为包被抗体、生物素化抗体1D6为检测抗体，将夹心蛋白倍比稀释至不同浓度后进行ELISA试验，并以夹心蛋白浓度为横坐标，以OD₄₅₀为纵坐标建立标准曲线。具体步骤如下：

1、用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将1G11抗体稀释成4μg/mL，100μL/孔，4℃包被12h后，洗涤缓冲液洗涤3次，300μL/孔，甩干孔内残留液体；

2、5％的脱脂奶，300μL/孔，37℃封闭3h后，洗涤同上；

3、用1％的BSA将夹心蛋白(重组蛋白GST-chIL-2)稀释至不同浓度(浓度如表1所示)，100μL/孔，37℃孵育2h后，洗涤同上；

4、用1％的BSA按照1:15000的比例对生物素化抗体1D6进行稀释，100μL/孔，37℃孵育2h后，洗涤同上；

5、用1％的BSA按1:10 000的比例对HRP标记的链霉亲和素进行稀释，100μL/孔，37℃孵育15min后，洗涤同上；

6、加入显色液TMB，100μL/孔，待阴性对照轻微变蓝时，加入2M H₂SO₄，50μL/孔，终止反应；

7、酶标仪读取OD₄₅₀吸光值。

标准曲线如图4所示。夹心蛋白浓度与OD₄₅₀线性关系如表1所示。结果表明：夹心蛋白浓度在0.1ng/mL-6.25ng/mL的浓度范围内，其浓度与OD₄₅₀线性关系良好，所能检测到的最小夹心蛋白浓度为100pg/mL。

表1、夹心蛋白浓度与OD450线性关系

夹心蛋白(ng/ml)	6.25	3.125	1.563	0.8	0.4	0.2	0.1	0
									OD₄₅₀	0.3125	0.223	0.1775	0.1555	0.13	0.1325	0.125	0.118

二、对比文献中抗体灵敏度的检测

按照步骤一中的方法，分别以文献“抗鸡白细胞介素10单克隆抗体的制备及鉴定”中的杂交瘤细胞株分泌的抗chIL-10抗体以及本发明中的抗chIL-10抗体为包被抗体和检测抗体，将夹心蛋白倍比稀释至不同浓度后进行ELISA试验，并计算P/N值。P/N值＝阳性对照OD450均值/阴性对照OD450均值。P/N值越大，灵敏度越高。

不同抗体组合夹心蛋白浓度与OD450线性关系如表2、表3和表4所示。从表中可以看出：以1G11为包被抗体，以1D6为检测抗体的组合P/N值最高，检测效果最好，因此，本发明的以1G11抗体为包被抗体、生物素化抗体1D6为检测抗体的抗体组合的灵敏度更好。

表2、包被抗体为4F3

表3、包被抗体为1G11

表4、包被抗体为4B2

实施例3、酶联免疫检测试剂盒的应用

分别用0.5ug/mL，1ug/mL，5ug/mL的脂多糖(LPS)刺激HD11细胞(鸡巨噬细胞)，分为两组：一组刺激8h后提取细胞RNA，反转录为cDNA，并以获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR，检测IL-10mRNA表达情况；另外一组刺激48h后，取上清液，6000rpm离心2min后再取上清液，并采用本发明的用于检测禽IL-10的酶联免疫检测试剂盒检测LPS刺激后的HD11细胞(鸡巨噬细胞)上清液中的IL-10蛋白含量。以未用LPS刺激的HD11细胞作为对照(NOR)。

IL-10mRNA水平检测结果如图7所示，结果表明：鸡IL-10mRNA水平在不同浓度的LPS的刺激下均上调。IL-10蛋白含量的检测结果如表5所示，结果表明：HD11细胞经LPS刺激后，鸡IL-10蛋白水平均提高，检测结果与mRNA水平检测结果符合，说明本发明试剂盒具有临床应用性。

表5、LPS刺激下的HD11细胞上清IL-10浓度检测

(#1和#2分别代表两组重复)

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种检测禽白细胞介素10含量的方法及其专用试剂盒

<160>4

<210>1

<211>465bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ttggagccca cctgcctgca cttctctgag ctgctgcccg cccggctgcg ggagctgagg 60

gtgaagtttg aggaaattaa ggactatttt caatccaggg acgatgaact taacatccaa 120

ctgctcagct ctgaactgct ggatgagttt aaggggacct ttggctgcca gtctgtgtca 180

gagatgctgc gcttctacac agatgaggtc ctgccccgtg ccatgcagac cagcaccagt 240

catcagcaga gcatgggcga cctgggcaac atgctgctgg gcctgaaggc gacgatgcgg 300

cgctgtcacc gcttcttcac ctgcgagaag aggagcaaag ccatcaagca gatcaaggag 360

acgttcgaga agatggatga gaacgggatc tacaaagcca tgggggagtt cgacatcttc 420

atcaactaca tcgaggagta cctgctgatg aggaggagga agtga 465

<210>2

<211>309bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttggagccca cctgcctgca cttctctgag ctgctgcccg cccggctgcg ggagctgagg 60

gtgaagtttg aggaaattaa ggactatttt caatccaggg acgatgaact taacatccaa 120

ctgctcagct ctgaactgct ggatgagttt aaggggacct ttggctgcca gtctgtgtca 180

gagatgctgc gcttctacac agatgaggtc ctgccccgtg ccatgcagac cagcaccagt 240

catcagcaga gcatgggcga cctgggcaac atgctgctgg gcctgaaggc gacgatgcgg 300

cgctgttga 309

<210>3

<211>312bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gggacctttg gctgccagtc tgtgtcagag atgctgcgct tctacacaga tgaggtcctg 60

ccccgtgcca tgcagaccag caccagtcat cagcagagca tgggcgacct gggcaacatg 120

ctgctgggcc tgaaggcgac gatgcggcgc tgtcaccgct tcttcacctg cgagaagagg 180

agcaaagcca tcaagcagat caaggagacg ttcgagaaga tggatgagaa cgggatctac 240

aaagccatgg gggagttcga catcttcatc aactacatcg aggagtacct gctgatgagg 300

aggaggaagt ga 312

<210>4

<211>435bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

catactgcaa gtagtctaaa tcttgttcaa cttcaagatg atatagacaa actgaaagct 60

gactttaact caagtcattc agatgtagct gacggtggac ctattattgt agagaaactg 120

aagaactgga cagagagaaa tgagaaaagg atcatactga gccagattgt ttcgatgtac 180

ttggaaatgc ttgaaaacac tgacaagtca aagccgcaca tcaaacacat atctgaggag 240

ctctatactc tgaaaaacaa ccttcctgat ggcgtgaaga aggtgaaaga tatcatggac 300

ctggccaagc tcccgatgaa cgacttgaga atccagcgca aagccgcgaa tgaactcttc 360

agcatcttac agaagctggt ggatcctccg agtttcaaaa ggaaaaggag ccagtctcag 420

aggagatgca attgc 435

Claims

1.抗chIL-10的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.13836的杂交瘤细胞株1G11分泌的。

2.抗chIL-10的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.13837的杂交瘤细胞株1D6分泌的。

3.一株分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1G11，其保藏号为CGMCCNo.13836。

4.一株分泌抗chIL-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D6，其保藏号为CGMCCNo.13837。

5.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的酶联免疫试剂盒，其包括权利要求1所述的单克隆抗体和/或权利要求2所述的单克隆抗体。

6.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株或权利要求5所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量中的应用；

或，权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用。

7.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-10含量的方法，是以权利要求1所述的单克隆抗体为包被抗体、权利要求2所述的单克隆抗体为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的单克隆抗体包被到酶标板上，洗涤；

(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；

(4)向(3)得到的酶标板中加入生物素化的权利要求2所述的单克隆抗体，孵育，洗涤；

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

或，所述步骤(1)中，用碳酸盐缓冲液将权利要求1所述的单克隆抗体稀释后包被到酶标板上；

或，所述步骤(2)中，用脱脂奶溶液封闭(1)得到的酶标板；

或，所述步骤(3)中，用BSA溶液将chIL-10标准品稀释后加入酶标板中；

或，所述步骤(4)中，用BSA溶液将生物素化的权利要求2所述的单克隆抗体稀释至1.0μg/mL后加入酶标板中。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)中，所述脱脂奶溶液的质量分数为5％；所述封闭的条件为37℃封闭3h；

所述BSA溶液的质量分数为1％；

所述步骤(3)中，所述孵育时间为2h；

所述步骤(4)中，所述孵育时间为45min；

所述步骤(5)中，所述孵育时间为15min；

所述用酶标仪检测吸光度值时的波长为450nm。