CN106970210A

CN106970210A - 一种弓形虫病间接elisa诊断试剂盒

Info

Publication number: CN106970210A
Application number: CN201710098062.4A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 程龙; 黄燕; 米荣升; 韩先干; 陆珂
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: CN106970210B

Abstract

本发明公开了一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒；所述诊断试剂盒中所用的检测抗原为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的弓形虫TgPP1基因原核表达获得的重组蛋白rTgPP1。本发明的试剂盒的包被抗原是原核表达的rTgPP1蛋白，在低温诱导下，它以可溶性的形式存在，而且在N端带有His标签，这有利于大量纯化rTgPP1蛋白，从而使抗原来源不再受约束；本发明使用重组抗原代替天然抗原作为包被抗原，应用于ELISA检测以及制备ELISA试剂盒，可以显著提高不同批次间抗原的稳定性，还具有较好的特异性和重复性，为流行病学调查和疾病诊断提供了一种快速有效的检测方法。

Description

一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种优化的弓形虫TgPP1基因和一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒。

背景技术

弓形虫病(toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人兽共患寄生虫病，弓形虫属顶端复合门(Apicomplexa)、类锥体纲(Conoidasida)、球虫亚纲(Coccidia)、真球虫目(Eucoccidiorida)、艾美耳亚目(Eimeriorina)、肉孢子虫科(Sarcocystidae)、弓形虫属(Toxoplasma)，是一种细胞内寄生性原虫，可寄生在除红细胞外几乎所有有核细胞中，呈全球性分布。据血清学统计分析，全世界约25％～50％的人感染弓形虫。弓形虫可造成人体多种器官病理损害，甚至危及生命。免疫功能正常的宿主感染后多呈无症状带虫状态；对于免疫损伤和缺陷的个体，如艾滋病患者，其感染可能是致命的，孕妇感染可致流产、早产、死胎或畸胎。弓形虫主要通过口、母婴和血液传播感染宿主。

由于弓形虫病的临床症状无明显特异性，且多呈现隐性感染，故依据临床症状和流行病学难以作出诊断。目前弓形虫病主要依据实验室诊断，主要方法有病原学检查、免疫学检测和分子生物学技术。病原学检查是从病料中直接检查速殖子或卵囊，主要包括：直接涂片或组织切片检查、动物接种和卵囊检查法；免疫学检测包括：染色试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)等；分子生物学方法主要指PCR技术。血清学诊断方法是目前弓形虫病检测的主要手段，其中ELISA法具有操作简便、灵敏性高、快速、易标准化等特点，已成为首选的常规诊断方法，所用抗原大多为表面蛋白或分泌蛋白等可溶性抗原。然而目前我国市场上销售的弓形虫病诊断试剂盒品种繁杂、质量参差不齐，既无统一标准，又无序生产与使用，给弓形虫病的诊断与防治造成严重危害。综合起来，我国弓形虫病诊断试剂盒存在交叉反应严重、敏感性和特异性低、符合率不高等问题。

弓形虫入侵宿主时，要通过速殖子(tachyzoite)顶端复合体接触宿主细胞膜，借助随后分泌的一些分泌蛋白侵入细胞、形成带虫空泡(parasitophorous vacuole)，并在胞浆或细胞核内进行内裂殖、二分裂和玫瑰花斑式繁殖，最终裂解细胞，又侵入新的宿主细胞进行不断地发育和繁殖，同时也导致宿主细胞不断的破坏而致病。此过程依赖于磷酸化和脱磷酸化作用，这些蛋白修饰是囊泡运输(vesicular trafficking)、分泌，以及肌动蛋白-肌球蛋白动力等的信号通路调节因子。早在1997年，Dobrowolski等即发现，肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase)抑制物KT5926影响弓形虫速殖子的移动和对宿主细胞的黏附。Delorme等(2002)发现，I型和2A型蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP)的抑制物冈田酸(okadaic acid，OA)、泰托霉素(tautomycin)能明显地影响I型弓形虫速殖子的入侵，抑制率可达50％左右；速殖子的可溶性提取物具有I型蛋白磷酸酶(proteinphosphatase 1，PP1)的活性，且可与抗人PP1催化亚单位抗体反应；体外磷酸盐标记试验证实，弓形虫PP1能催化多种蛋白的磷酸化反应。

目前，国内外还没有学者运用重组TgPP1(recombinant TgPP，rTgPP1)蛋白建立猪弓形虫病的ELISA诊断技术。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒。具体来说，本发明基于人工合成的、经过优化的弓形虫TgPP1基因，利用原核表达系统获得rTgPP1蛋白，建立了检测弓形虫抗体的新型诊断试剂盒，具有良好的敏感性和特异性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种重组弓形虫基因，所述基因为弓形虫TgPP1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及一种前述的重组弓形虫基因编码得到的重组蛋白rTgPP1。

本发明还涉及一种前述的重组蛋白rTgPP1在检测弓形虫病中的用途。

本发明还涉及一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中所用的检测抗原为本发明的重组蛋白rTgPP1。

优选的，所述诊断(也称检测)试剂盒还包括：PBST洗涤液、5％脱脂奶粉封闭液、稀释液、HRP标记的1∶150000稀释的兔抗猪IgG二抗、阳性血清、阴性血清、TMB-H₂O₂底物显色液、2mol/L硫酸终止液和抗原包被液；所述抗原包被液为0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

优选的，所述重组蛋白rTgPP1和抗原包被液的质量和体积比为1-5μg/mL。

优选的，所述重组蛋白rTgPP1是通过以下步骤制备而成：

S1、根据刚地弓形虫ME49株PP1编码基因序列，将相应的密码子优化为细菌密码子，两端分别加Nde I和Hind III限制性内切酶序列，Nde I序列后插入6个His的编码序列，全基因合成目的片段；

S2、目的片段和载体pET-30a(+)用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切后，用T4连接酶连接，转化大肠埃希菌DH5α，提取重组质粒pET-30a-TgPP1，经双酶切和测序鉴定正确后转化到BL21(DE3)感受态细胞中；

S3、将经鉴定已转入重组质粒pET-30a-TgPP1的BL21(DE3)感受态细胞经诱导表达、纯化，获得重组蛋白rTgPP1。

本发明还涉及一种应用如本发明的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒进行弓形虫病间接ELISA检测的方法，所述方法包括以下步骤：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止；

所述方法的最佳工作条件为：抗原包被浓度为1～5μg/mL，二抗反应浓度为1∶150000，阳性血清最佳稀释倍数为1∶100，封闭时间为37℃3h，血清作用时间为1h，酶标抗体作用时间为1.5h，显色时间为15min。

优选的，具体包括以下步骤：

A1、包被：用0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液将重组蛋白rTgPP1稀释成1-5μg/mL，包被ELISA酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜，用PBST洗涤酶标板3次，5min/次；

A2、封闭：用5％脱脂奶粉37℃封闭2h，用PBST洗涤酶标板3次；

A3、加检测血清：将血清按1∶100的比例稀释，设阴性和阳性对照，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；

A4、加二抗：加入100μL HRP标记的1∶150000稀释的兔抗猪IgG，37℃作用1h；

A5、加底物：每孔加入100μL TMB-H₂O₂避光显色15min；

A6、终止：每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应；

A7、结果判定：用酶标仪测450nm处的OD值；OD值≥0.325为阳性，OD值＜0.278为阴性，0.278≥OD值＞0.325为疑似；对疑似样本重检时，OD值≥0.301为阳性，OD值＜0.301为阴性。

本发明还涉及一种应用如本发明的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒进行弓形虫病间接ELISA检测的方法，所述方法在血清样品与包被抗原反应前，先采用大肠杆菌裂解物和血清样品在37℃作用1h，以去除血清中针对大肠杆菌的抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明根据细菌偏好性，对刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)ME49株PP1编码基因进行了优化，与原基因序列差异较大；

2、本发明在优化基因时，在起始密码子后，插入了6个His编码基因，以利于表达的重组蛋白的纯化，故最终获得的重组蛋白既保护了原有的所有氨基酸，又加入了6个His氨基酸；在起始密码子和终止密码子之后，分别插入了Nde I和Hind III限制性内切酶序列，便于基因的克隆；

3、TgPP1基因未见原核表达、用于构建ELISA诊断方法的报道；本发明的试剂盒的包被抗原是原核表达的rTgPP1蛋白，在低温诱导下，它以可溶性的形式存在，而且在N端带有His标签，这有利于大量纯化rTgPP1蛋白，从而使抗原来源不再受约束；

4、本发明使用重组抗原代替天然抗原作为包被抗原，应用于ELISA检测以及制备ELISA试剂盒，可以显著提高不同批次间抗原的稳定性；

5、本发明的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性，为流行病学调查和疾病诊断提供了一种快速有效的检测方法。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为重组质粒pET30a-TgPP1的双酶切鉴定示意图；其中，M：DL5000DNA Maker；1：pET30a-TgPP1重组质粒未消化；2：pET-TgPP1重组质粒的Nde I和Hind III双酶切产物；

图2为重组TgPP1蛋白的诱导表达示意图；其中，M：低分子量蛋白质量标准；1：流出液；2：10mM咪唑洗脱液；3：50mM咪唑洗脱液；4：250mM咪唑洗脱液：5：500mM咪唑洗脱液；6：诱导转化菌可溶性蛋白上清；

图3为利用抗His单抗进行的重组蛋白Westernblot分析示意图；其中，N：阴性对照；1-4：重组蛋白，蛋白浓度为1mg/mL，上样量分别为20μL、15μL、10μL和5μL；

图4为重组TgPP1蛋白的Western blot分析示意图；其中，1：弓形虫感染小鼠阳性血清；M：低分子量蛋白质量标准；2：阴性血清。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

本实施例涉及一种优化的弓形虫TgPP1基因和一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒。

1.材料方法

1.1虫株、血清

II型弓形虫Prugniaud(PRU)株(詹婷婷，米荣升，黄燕，陆珂，程龙，贾海燕，胡盼，宋悦，韩先干，赵权*，陈兆国*.典型城市屠宰及销售猪肉中弓形虫的分子检测研究.中国动物传染病学报2016，24(6)：30-35.)由中国农业科学院上海兽医研究所保存。所涉血清为常规技术手段获得的弓形虫感染猪血清、猪附红细胞体感染猪血清、旋毛虫感染猪血清、隐孢子虫感染猪血清。猪田间血清采自上海市嘉定区和重庆渝北区某屠宰场成年育肥猪。

1.2主要试剂

PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、DL2000DNA分子质量标准、6倍核酸上样缓冲液、表达质粒pET-30a(+)Vector、T4DNA连接酶、限制性内切酶Nde I和Hind III均购自宝生物工程(大连)有限公司；AxyPrep DNA胶回收试剂盒购于Axygen公司；Transl-TlPhage Resistant化学感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司；大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细购自南京泰德生物科技有限公司；蛋白分子量标准、BCA蛋白定量试剂盒、购自Thermo公司；6倍蛋白上样缓冲液购自上海康稳生物科技有限公司；His融合标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA His·Bind Resin)层析柱、PVDF膜购自德国Merck公司；胰蛋白胨、酵母提取物、脱脂奶粉购自英国OXOID公司；TMB购自天根生化科技(北京)有限公司；过硫酸铵、丙烯酰胺、TEMED购自Sigma公司；抗His标签鼠单克隆抗体(HRP结合)购自细胞信号技术公司(CellSignaling Technology)；兔抗猪IgG-HRP购自Abcam公司；ELISA酶标板为美国CoringCostar公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.3实验动物

BALB/c(昆明)小鼠购自上海斯莱克公司。

1.4 TgPP1基因片段的获得及重组质粒的构建

根据GenBank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)ME49株PP1编码基因序列(登录号XM_002364275.2)，将相应的密码子优化为细菌密码子，两端分别加Nde I和HindIII限制性内切酶序列，Nde I序列后插入6个His的编码序列，由上海英俊生物技术有限公司全基因合成。目的片段和载体pET-30a(+)用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切后，用T4连接酶连接，转化大肠埃希菌DH5α，提取质粒，经双酶切和测序鉴定正确后转化到BL21(DE3)感受态细胞中，经PCR鉴定正确后，将菌种添加18％的甘油于-80℃中保存。

结果，成功地合成了TgPP1基因(SEQ ID NO.1)，大小为951bp，其两端分别含有NdeI和Hind III限制性内切酶序列，Nde I序列后为6个His序列，此后为TgPP1序列，所用起始密码子为Nde I序列的后3位。在Hind III限制性内切酶序列前为2个终止密码子，分别为TAA、TGA(见SEQ ID NO.1)。成功地构建了重组质粒pET-30a-TgPP1。对重组质粒进行Nde I和Hind III双酶切鉴定，结果显示，插入片段大小约为944bp左右(图1)，与预测结果一致。测序结果表明，人工合成的TgPP1基因编码的氨基酸序列与GenBank登录序列完全一致，在重组质粒中的读码框正确。

1.5重组TgPP1(recombinant TgPP1，rTgPP1)蛋白的诱导表达及纯化

将经鉴定已转入重组质粒的感受态细胞于37℃振摇培养过夜，取5mL新鲜菌液接种于250mL LB培养基中，在37℃以200r/min振摇培养，待OD_600nm值达0.6左右时，加入0.5mmol/mL的IPTG，于16℃诱导表达6h。离心收集菌体，用预冷的磷酸盐缓冲液洗菌体，再用30mL磷酸盐缓冲液重悬菌体。超声破碎后，14000r/min离心收集上清液，按Merck密理博(Merck millipore)公司Ni-NTA His·Bind Resin(His融合标签蛋白纯化树脂)说明书对目的蛋白进行纯化，并按照BCA Protein Assay Kit说明书对纯化后的蛋白进行含量测定，纯化后的蛋白于-20℃保存。

利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)对纯化前和纯化后的蛋白进行检测。分别取16μL与4μL 5×SDS凝胶上样缓冲液混匀，100℃水浴加热5min，瞬间离心后取10μL上样。80V电泳30min，然后120V电泳1h，用考马斯亮蓝染色液进行染色，然后用脱色液进行脱色，脱色后分析电泳结果。

结果显示，pET30a-TgPP1重组质粒转化菌经IPTG诱导后，成功地表达出了大小约为36ku的目的蛋白(图2)，当IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导时间为5小时时，目的蛋白的表达量最大。重组蛋白以可溶形式表达，经Ni-NTA His·Bind(Merck Millipore)纯化后，获得了较纯的重组蛋白，最高浓度为200μg/μL。

1.6TgPP1蛋白的Western blot(蛋白质印迹)检测

按Hughes等(2014)所述方法，利用湿转电转移电泳槽将蛋白转移到PVD膜上，进行western blot分析，采用弓形虫感染小鼠血清为一抗，孵育过夜；二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG，采用含有5％脱脂乳的PBST(pH7.4)稀释4000倍，显色后观察结果。同时采用HRP结合的抗His标签鼠单克隆抗体(His-Tag(27E8)Mouse mAb，HRP Conjugate)(1∶1000稀释)，ECL显色。

结果显示，rTgPP1蛋白能与HRP结合的抗His标签鼠单克隆抗体反应，而pET-30a(+)空表达载体的超声裂解液不能与HRP结合的抗His标签鼠单克隆抗体反应(图3)；能与刚地弓形虫感染小鼠血清反应，而与阴性血清不反应(图4)。

1.7抗重组TgPP1血清的制备及效价的间接ELISA检测

取浓度为1mg/mL的纯化重组蛋白溶液，加入等体积弗氏佐剂，经充分乳化后，对8周龄昆明系小鼠进行皮下多点注射免疫，剂量为50μg蛋白，每次免疫间隔2周，共进行3次免疫，初次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂。第3次免疫7d后，采血分离血清，-20℃保存备用。

抗血清效价测定采用间接ELISA法，按常规的方阵滴定法，以阳性、阴性血清孔OD_450nm值之比即P/N值大于等于2.1，而且阴性血清孔OD_450nm值接近0.10作为指标，对抗原、羊抗鼠IgG的最适工作浓度进行比较，确定最适反应条件。将抗血清按1∶10²倍倍比依次稀释，按100μL/孔顺次加入酶标板中，同时设阴性对照和空白对照，阴性血清同样以1∶10²稀释、100μL/孔添加。正式检测时，按方阵滴定所确定的浓度和剂量加入抗原、一抗，再加入1∶10000倍稀释的羊抗鼠IgG，用BioTech Epoch型酶标仪(Thermo Scientific)测定OD_450nm值。

检测结果表明，免疫小鼠血清能够与rTgPP1蛋白发生特异性反应，免疫血清与阴性血清的比值即P/N值大于2.1；方阵滴定确定rTgPP1蛋白的最佳包被浓度为1μg/mL，二抗反应浓度为1∶10000；感染血清的效价为1∶25600(表1)。

表1 免疫小鼠血清效价的间接ELISA检测

1.8间接ELISA检测方法的建立

1.8.1抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的选择

采用棋盘法测定，用0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)将重组抗原依次稀释成0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL，分别包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min，然后用5％脱脂奶粉37℃封闭2h。再用PBST洗涤酶标板3次，以1∶100、1∶200、1∶400稀释的阳性血清(猪感染血清)以及阴性血清(未感染猪血清)为一抗，37℃作用1h。PBST洗涤3次后，加入100μL HRP标记的兔抗猪IgG(1∶150000稀释)(二抗)，37℃作用1h。每孔加入100μL TMB-H₂O₂避光显色15min，再加入50μL 2mol/L硫酸终止反应，测定450nm波长处的光密度值(OD₄₅₀)，选择阳性OD₄₅₀＞1.0、阴性OD₄₅₀较小、P/N值较大的抗原包被浓度、血清稀释度组合作为最适包被浓度和血清最佳稀释度。

结果见表2，选定阳性血清OD值较大，而P/N值较大时的反应孔的抗原及血清的稀释倍数作为两者最佳工作条件。在此基础上测定抗原最佳包被浓度为5μg/mL，而血清最佳稀释倍数为1∶100。

表2 最佳包被浓度和最佳血清稀释度的选择

1.8.2最佳封闭时间的选择

以最适抗原浓度包被酶标板，用封闭液进行封闭，封闭时间分别为1h、2h和3h，然后阳性血清按1.8.1中确定的稀释倍数稀释，其他ELISA测定步骤同1.8.1。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的封闭时间。

结果见表3，在37℃的温度下封闭3h测出的P/N值最大，故选择37℃3h为最佳封闭时间。

表3 最佳封闭时间的选择

封闭时间(h)	阳性血清OD₄₅₀值	阴性血清OD₄₅₀值	P/N
				1	0.222	0.102	2.176470588
2	0.252	0.136	1.852941176
				3	0.268	0.120	2.233333333

1.8.3最佳待检血清作用时间的选择

酶标板按照优化的条件包被、封闭后，加入待检血清，37℃分别作用1h、2h和3h，进行ELISA测定，其他步骤同1.8.1。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的血清作用时间。

结果见附表4，表明在37℃的温度下血清作用1h时，P/N值达到最大。所以选择1h为最佳血清作用时间。

表4 最佳待检血清作用时间的选择

血清作用时间(h)	阳性血清OD₄₅₀值	阴性血清OD₄₅₀值	P/N
				1	0.240	0.118	2.034
2	0.195	0.136	1.434
				3	0.195	0.130	1.500

1.8.4最佳酶标二抗作用时间的选择

将酶标二抗按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h，其他步骤同1.8.1，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的酶标抗体作用时间。

结果见附表5，酶标抗体作用1.5h时P/N值达到最大，所以选择1.5h的酶标抗体作用时间。

表5 最佳酶标抗体作用时间的选择

酶标抗体作用时间(h)	阳性血清OD₄₅₀值	阴性血清OD₄₅₀值	P/N
				0.5	0.078	0.065	1.2
1	0.143	0.1	1.43
				1.5	0.35	0.128	2.734375

1.8.5最佳底物显色时间的选择

酶标抗体按优化好的时间作用、洗涤、加入底物后，37℃分别作用10min、15min和20min，用2mol/L硫酸50μL/孔终止后读数，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的底物显色时间。

结果见附表6，显色15min时，阳性值达到并接近1.0，P/N值达到最大，所以选择15min为最佳显色时间。

表6 底物最佳显色时间的选择

1.8.6临界值确定

取18份阴性猪血清，1∶100稀释，在选择好的条件下进行间接ELISA测定，对检测结果进行统计学分析，得到OD₄₅₀平均值和标准差SD。将OD₄₅₀值时，判为阳性；OD₄₅₀值时，判为阴性；介于两者之间者判为可疑，需重新检测样本，重检时OD₄₅₀(样本)值时判为阳性，OD₄₅₀(样本)值时判为阴性。

结果，18份健康猪血清的检测结果最高值是0.277，最低值是0.083，其平均值为0.137，标准偏差SD为0.047，当样品OD₄₅₀值x≥0.325时判为阳性；当样品OD₄₅₀值x＜0.278时判为阴性；当样品OD₄₅₀值介于0.278(含0.278)与0.325之间则判为疑似。对可疑样本重检时，当OD₄₅₀值为阳性，OD₄₅₀值为阴性。

1.9交叉反应试验

分别取猪附红细胞体、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪隐孢子虫感染血清，进行1∶100稀释，用已优化的间接ELISA方法检测，同时设立阴、阳性血清对照，每份血清平行做3个重复，观察各血清与系统是否有交叉反应。

结果见附表7，以rTgPP1蛋白包被酶标板，与猪附红细胞体病、猪蓝耳、猪隐孢子虫感染血清反应，OD45分别为0.040、0.230、0.080，均低于0.235674。阳性对照OD450为0.801，阴性对照OD450为0.25。

表7 交叉性试验

2.0重复性试验

2.0.1批内重复性试验

取5份血清在选择好的条件下进行间接ELISA测定，每份血清样品平行做10个重复，按以下公式计算变异系数(coefficient ofvariance，CV)：CV＝[样本OD₄₅₀值标准差(s)/样本OD₄₅₀值平均数]×100％。

2.0.2批间重复性试验

取4份不同批次的rTgPP1蛋白包被，在选择好的条件下对8份血清进行间接ELISA测定。每份样品重复3次，取平均值，同2.0.1观察其CV值。

结果如附表8所示，用同一批制备的rTgPP1蛋白包被ELISA板，对5份样品进行检测，重复10孔，批内重复试验的变异系数均值为1.4％。用2个不同批次的蛋白对2份样品进行检测，批间重复试验的变异系数均值为1.04％，表明重复性较好。

表8 重复性试验结果

2.1 ELISA方法的初步应用

以确定的各种最佳条件进行试验，对上海市的100份猪血清样品进行检测，分别与欣博盛猪弓形虫ELISA试剂盒检测结果进行比较，计算其符合率。

结果，用rTgPP1蛋白建立的间接ELISA检测100份田间猪血清样品，阳性样品占13份，阳性率为13.0％。进行比较，其阳性复合率分别为92.8％，阴性符合率分别为100％(附表9)。

表9 两种检测结果的比较

由于弓形虫体外培养困难，给实验室诊断造成一定困难。目前，猪弓形虫的血清学检测主要采用ELISA法，该法具有简单、快速、灵敏性高、检测样品量多、易标准化等特点。

本发明的包被抗原是原核表达的rTgPP1蛋白，在低温诱导下，它以可溶性的形式存在，而且在N端带有His标签，这有利于大量纯化rTgPP1蛋白，从而使抗原来源不再受约束。此外，使用重组抗原代替天然抗原作为包被抗原，应用于ELISA检测以及制备ELISA试剂盒，可以显著提高不同批次间抗原的稳定性。

由于原核表达的重组蛋白即使经过纯化回收也难以完全排除大肠杆菌菌体蛋白成分的干扰，而且在生长过程中猪群可能多次感染大肠杆菌，其血清样本中可能含有大肠杆菌成分的抗体，很可能造成假阳性结果而降低间接ELISA检测方法的特异性，为避免这一影响，本发明在血清样品与包被抗原反应前，先采用大肠杆菌裂解物和血清样品在37℃作用1h，以去除血清中针对大肠杆菌的抗体，提高检测结果的准确性。

本发明所建立的间接ELISA方法与欣博盛猪弓形虫ELISA试剂盒的阳性符合率分别为92.8％，阴性符合率分别为100％，提示本发明所建立的间接ELISA与欣博盛猪弓形虫ELISA试剂盒具有较高的阴阳性符合率。此外，该间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性，为流行病学调查和疾病诊断提供了一种快速有效的检测方法。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海兽医研究所

<120> 一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒

<130> DAG28440

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TgPP1基因

<400> 1

catatgcacc accatcatca tcacgttagc ctggatgtgg acgttgacgc ggttattagc 60

aaactgttag aagtccgcgg tagtcgtccg ggtaaaccgg ttcaattaac cgaagcggaa 120

attcgcggtc tgtgccataa aagccgcgaa atcttcatca gccagccgat tctgctggaa 180

ctggaagcgc cgattaaaat ctgcggcgat attcacggcc agtactacga tctgctgcgt 240

ctgtttgaat acggcggttt tccgccggaa gcaaattacc tgtttctggg cgattacgtt 300

gatcgcggta aacagagcct ggaaaccatt tgcctgctgc tggcgtataa gatcaagtac 360

ccggaaaact tcttcctgct gcgcggtaat cacgaatgcg caagcattaa ccgcatctac 420

ggcttttacg acgagtgcaa acgtcgctac aacatcaagc tgtggaagac cttcaccgac 480

tgctttaact gtctgccggt tgccgccatt attgatgaga aaatcttctg catgcacggc 540

ggcttaagtc cggaactgaa cagcatggac cagattcgtc gtattgttcg tccgaccgac 600

gttccggata ccggtttact gtgcgatctg ctgtggagcg atccggaaaa agaaatctcc 660

ggttggggcg aaaacgatcg cggcgttagt tttacctttg gccaggacgt tgtccacaac 720

tttctgcgca aacacgatct ggatctgatt tgccgcgcac atcaagttgt cgaagacggc 780

tacgaatttt tcgcgaaacg ccaactggtt accctgtttt ctgcgccgaa ctattgcggc 840

gaattcgata atgccggcgc aatgatgtct gttgacgaaa ccctgatgtg cagctttcag 900

atcctgaagc cggtcgagaa aaagaaaggc atggcaaagt aatgaaagct t 951

Claims

1.一种重组弓形虫基因，其特征在于，所述基因为弓形虫TgPP1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的重组弓形虫基因编码得到的重组蛋白rTgPP1。

3.一种如权利要求2所述的重组蛋白rTgPP1在检测弓形虫病中的用途。

4.一种弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中所用的检测抗原为如权利要求2所述的重组蛋白rTgPP1。

5.如权利要求4所述的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括：PBST洗涤液、5％脱脂奶粉封闭液、稀释液、HRP标记的1∶150000稀释的兔抗猪IgG二抗、阳性血清、阴性血清、TMB-H₂O₂底物显色液、2mol/L硫酸终止液和抗原包被液；所述抗原包被液为0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

6.如权利要求5所述的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白rTgPP1和抗原包被液的质量和体积比为1-5μg/mL。

7.如权利要求4所述的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白rTgPP1是通过以下步骤制备而成：

8.一种应用如权利要求4～7中任一项所述的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒进行弓形虫病间接ELISA检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止；

9.如权利要求8所述的弓形虫病间接ELISA检测的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A1、包被：用0.05 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液将重组蛋白rTgPP1稀释成1-5μg/mL，包被ELISA酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜，用PBST洗涤酶标板3次，5min/次；

A2、封闭：用5％脱脂奶粉37℃封闭2h，用PBST洗涤酶标板3次；

A5、加底物：每孔加入100μL TMB-H₂O₂避光显色15min；

A6、终止：每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应；

10.一种应用如权利要求4～7中任一项所述的弓形虫病间接ELISA诊断试剂盒进行弓形虫病间接ELISA检测的方法，其特征在于，所述方法在血清样品与包被抗原反应前，先采用大肠杆菌裂解物和血清样品在37℃作用1h，以去除血清中针对大肠杆菌的抗体。