CN105132448A - 日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原是由含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区基因的重组载体经表达而制得。本发明还公开了该日本血吸虫重组抗原的制备方法及其在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。本发明的日本血吸虫重组抗原，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并能达到一个较高水平，动物保护实验诱导了32.4％的减虫率和41.41％的减卵率，表明该重组抗原适于作为抗血吸虫病候选疫苗，具有很好的应用前景。

Description

日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫重组抗原及其制备方法和应用。

背景技术

日本血吸虫病是一种在我国南方流行的严重危害人、畜健康、影响社会和经济发展的人畜共患寄生虫病，是我国最重要的公共卫生问题之一。上世纪五十年代以来，我国血吸虫病防治取得了巨大成绩，但由于部分传统疫区(洞庭湖区、鄱阳湖区和部分江湖洲滩地区)血吸虫病流行的生态环境难以有效改变，要阻断血吸虫病传播仍是一项长期、艰巨、复杂的任务。目前针对终末宿主(人、牛、羊等)的主要防治手段是进行药物治疗，吡喹酮是目前唯一一种大规模应用的血吸虫病治疗药物，但不能解决重复感染难题。防治实践表明，由于血吸虫中间宿主钉螺难予消灭，家畜传染源未能得到有效控制，以药物治疗为主的防治策略难予阻断血吸虫病传播，迫切需要开拓防治新途径。加强血吸虫病疫苗的研制与开发，将疫苗的长效预防作用和治疗药物的短效作用相结合，是血吸虫病防治研究的重要发展战略，也是当前我国血防工作的重大需求。

血吸虫尾蚴钻入终末宿主皮肤转变为童虫，移行经过肺脏、肝脏后发育为成虫，并在宿主体内繁殖产卵、长期寄生。血吸虫寄居的血液环境为其提供了适宜的生理生化环境及营养、激素、信号分子等物质，但也使它直接暴露于宿主的免疫效应因子中，如宿主补体。补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，其作用的发挥依赖补体系统的激活。补体级联反应的激活包括3条途径，分别为经典途径、替代途径和凝集素途径。经典途径在特异性免疫的效应阶段发挥作用；替代途径和旁路途径参与非特异性免疫，在感染早期抵抗病原微生物感染中发挥重要作用。

血吸虫尾蚴突破皮肤屏障后就受到宿主免疫应答的攻击，补体反应是宿主最早开始杀伤虫体的免疫应答，在宿主对血吸虫的免疫杀伤中具有重要作用，是宿主获得性非特异性抗力的机理之一。但是血吸虫在长期的进化过程中也积累了应对宿主补体系统的适应性，对补体系统的抑制和调节是其免疫逃避策略的重要组成部分。血吸虫在尾蚴阶段对血清补体是非常敏感的，但在尾蚴转变为童虫2-4小时后对血清补体杀伤的敏感性就开始逐渐下降，这表明血吸虫在感染早期就对宿主的补体反应有抑制或调节作用，这种转变可能和血吸虫膜结构变化和体被表膜上的分子有关。现已发现多个血吸虫分子可能和补体免疫调节相关，并且作用于补体反应的多个节点。相关分子在血吸虫调节宿主补体免疫反应中的作用已有一些报道，研究主要是在曼氏血吸虫中进行的，如TOR、Paramyosin(又名SCIP-1)、DAF(CD55)、m28、Smpi56等分子。

其中TOR(trispanningorphanreceptor，四跨膜孤儿受体)，又称CRIT(complementC2receptorinhibitortrispanning)，是一种调节补体C2分子的蛋白。首先在埃及血吸虫、曼氏血吸虫中鉴定得到，因此沿用原名TOR，后发现广泛分布在包括从早期的硬骨鳕鱼到大鼠和人类多种生物，改称CRIT。对CRIT分子的特性和功能研究表明，CRIT分子可在人体造血细胞和许多组织中表达，CRIT分子和C4b分子具有相同的补体C2结合位点。溶血试验说明，CRIT可与C2补体结合阻止C3转化酶形成，从而阻断补体级联反应。HuiKM等研究发现CRIT也可通过其ed1的一段多肽CRIT-H17阻断D因子介导的B因子的裂解从而干扰补体替代途径的激活。研究发现，克氏锥虫Y株和Colombiana株对补体的敏感性差异与其CRIT分子的表达动态相关，CRIT基因过表达的虫体阶段(stationary-phaseepimastigotes短膜型静止期虫体)能抵抗血清补体的裂解作用，而且锥虫CRIT分子能抑制补体经典和凝集素途径的激活效应。后续研究表明，CRIT还可以通过抑制MASP2对C2的裂解，阻止C3转化酶形成，从而抑制凝集素途径激活补体作用。关于血吸虫TOR分子的研究报道见于埃及血吸虫和曼氏血吸虫。1999年JameelM.Inal等首先鉴定了埃及血吸虫ShTOR和曼氏血吸虫SmTOR蛋白分子，研究表明ShTOR是一种新型的三跨膜结构域受体，分布在血吸虫体被表面，在血吸虫童虫期高表达，重组ShTOR可被狒狒辐射尾蚴免疫血清所识别，表明TOR分子是一个有潜力的血吸虫疫苗候选抗原分子。

但是到目前为止，还没有出现关于日本血吸虫SjTOR重组蛋白作为血吸虫疫苗应用的研究报道。

发明内容

本发明要解决目前缺乏抗血吸虫高效疫苗的技术问题，提供一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原包含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)的SEQIDNO.1所示氨基酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。

此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)基因，该基因序列是编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述基因序列是SEQIDNO.2所示核苷酸序列。

更优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)基因插入在空载体pET28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点之间。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原是由上述重组载体经表达而制得。

本发明的日本血吸虫重组抗原，还包含由部分载体序列表达的具有几个组氨酸的标签序列，该标签序列仅是便于后续的重组抗原蛋白的纯化。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)。

优选的，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区蛋白进一步纯化。

在本发明的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)基因的重组表达载体，具体包括以下步骤：利用生物信息学进行在线分析，找出编码日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)的核苷酸片段；根据该核酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增核酸片断，再利用特异限制性内切酶EcoRⅠ、XhoI将编码SjTOR-ed1抗原的核酸片段定向克隆至原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组抗原的抗血吸虫疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组抗原特异性结合的抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组抗原在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。

本发明日本血吸虫重组抗原，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并且能达到一个较高水平，动物保护实验分别诱导32.40％的减虫率和41.41％的减卵率，表明该重组抗原具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药物靶标的潜力，具有很好的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的SjTOR和SjTOR-ed1的PCR扩增结果图及重组原核表达质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1的双酶切鉴定图；

图2是本发明实施例1的实时定量PCR分析SjTOR在不同发育阶段血吸虫内的差异表达图；

图3是本发明实施例1重组蛋白SjTOR-ed1表达时相分析图；

图4是本发明实施例1重组蛋白SjTOR-ed1表达和纯化结果图；

图5是本发明实施例2重组蛋白SjTOR-ed1抗原性分析结果图；

图6是本发明实施例2重组蛋白SjTOR-ed1抗原性分析结果图；

图7是本发明实施例3抗rSjTOR-ed1特异性IgG抗体水平的检测结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本实验室利用PCR克隆了日本血吸虫SjTOR基因全长序列，并其进行了生物信息学分析，结果显示该分子具有4个跨膜区，其中N端第一个膜外区ed1含有和CRIT分子C4b相似的保守位点，推测SjTOR分子可能具有抑制和调节宿主补体反应的功能，并在移行发育过程中发挥重要的免疫逃避功能。

本发明应用PCR技术扩增获得日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)的核苷酸片段，并运用基因工程重组技术将该核苷酸片段重组到载体pET28a(+)中，构建了pET28a(+)-SjTOR-ed1原核表达质粒。将重组原核表达质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达并纯化得到重组蛋白。

本发明应用生物信息学方法和基因工程技术获得重组蛋白rSjTOR-ed1后，通过westernblot分析此蛋白的抗原性和免疫原性，试验结果表明重组蛋白rSjTOR-ed1具有良好的抗原性和免疫原性，并且在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗该重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体，且这些抗体能达到一个较高的水平，动物保护实验分别诱导32.40％的减虫率和41.41％的减卵率，这些实验结果表明，本发明重组抗原诱导产生的特异性抗体在杀伤虫体中起到了一定的作用，也预示该重组抗原具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药物靶标的潜力，应用价值广阔。

实施例1日本血吸虫重组抗原的表达和纯化

1.方法

1.1重组表达质粒的构建

根据NCBI收录的SjTOR的基因序列(AY814912.1)，设计引物，上游引物：5’-GCGGAATTCTCGTTTCTTTTCCTA-3’(SEQIDNO.3)；下游引物：5’-CGCCTCGAGGAAAGTTGTCACACAGACAGC-3’(SEQIDNO.4)，用于扩增SjTOR基因片段。以日本血吸虫42天虫体的cDNA为模板，PCR扩增其含有ORF的cDNA片段，反应组成如下：

PCR反应条件：94℃5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；最后72℃15min。PCR产物纯化后连接pMD19-T载体，转化DH5α细胞，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，阳性克隆送上海华津公司测序，将测序结果与NCBI上提交的序列进行比对，并用生物信息学软件对SjTOR基因正确序列进行跨膜区预测，得到其N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)的SEQIDNO.1所示氨基酸序列及编码SjTOR-ed1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

根据NCBI收录的SjTOR的基因序列(AY814912.1)和得到的编码N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)的核苷酸序列，设计引物，上游引物：5’-GCGGAATTCATGACGTTTAATCCG-3’(SEQIDNO.5，下划线序列为EcoRⅠ酶切位点)；下游引物：5’-CGCCTCGAGTCAAATGTATGGACT-3’(SEQIDNO.6，下划线序列为XhoⅠ酶切位点)。以日本血吸虫42天虫体的cDNA为模板，PCR扩增其含有ORF的cDNA片段，反应组成如下：

PCR反应条件：94℃5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30个循环；最后72℃15min。PCR产物纯化后连接pMD19-T载体，转化DH5α细胞，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，阳性克隆送上海华津公司测序。

用上述测序正确的pMD19-T-SjTOR-ed1/DH5α转接LB液体培养基，按照试剂盒说明书，小量提取质粒DNA，采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切体系在37℃恒温仪中双酶切30min。酶切产物利用凝胶回收纯化的方法得到带有粘性末端的DNA目的片段，并将其定向克隆到原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中，16℃连接过夜。由此，构建得到重组质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1，将其转化到BL21细胞中，挑取单克隆，进行PCR菌液鉴定，抽提阳性克隆质粒进行双酶切鉴定，并送上海华津公司测序。

1.2荧光实时定量PCR分析SjTOR在不同发育阶段血吸虫内的转录水平

以日本血吸虫α-Tublin做为内参基因，其实时定量PCR扩增上游引物为5'-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3'(SEQIDNO.7)；下游引物为5'-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3'(SEQIDNO.8)。而针对SjTOR实时定量PCR扩增上游引物为5’-AGCCTACTGTCTTGGTATGGTGTG-3’(SEQIDNO.9)，下游引物为5’-AGCCCTTGTGTTAGACTCGTTGG-3’(SEQIDNO.10)。

取刚孵化的尾蚴及冻存于液氮的7、14、21、28、35、42天虫体以及42天雌、雄虫体，采用Trizol对各期别虫体进行总RNA的提取。采用PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser(TaKaRa)试剂盒，去除提取的RNA样品中的基因组DNA并且反转录成cDNA，以α-Tublin为内参，采用SYBRGreen荧光染料法、ABI7500Real-TimePCR仪器进行实时定量PCR检测SjTOR在不同发育时期虫体中的相对表达量，反应体系为SYBRPremixExTaqⅡ(2×)，10μl；上、下游引物(10μM)，0.8μl；ROXReferenceDyeⅡ，0.4μl；EASYDilution，6μl；cDNA模板，2μl；实时定量PCR反应条件：95℃预变性30s，然后95℃5s，60℃34s，共40个循环。其中60℃34s时收集荧光信号。每个反应均做三个重复孔。利用ABI7500SystemSoftware进行数据分析，采用双标准曲线法。

1.3重组蛋白pET28a(+)-SjTOR-ed1的表达与纯化

将测序正确的pET28a(+)-TOR-ed1/BL21菌液转接到500ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养，当OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L进行诱导表达。分别于诱导后0、1、2、3、4、5、6小时取出1ml菌液,4℃12000×g离心3min，倒掉上清，用50μlPBS充分悬浮沉淀，随后加入50μl蛋白电泳上样缓冲液并吹打混匀。沸水煮样5min，进行SDS-PAGE电泳。

剩余的诱导了6个小时的菌液，4℃12000×g离心15min，倒掉上清，用20mlPBS充分悬浮沉淀，反复冻融三次后，冰浴超声15min(超声5s，停45s)，随后4℃12000×g离心15min，收集上清。再用10ml8mol/L尿素溶解沉淀，完全溶解后4℃12000×g离心15min，收集上清。将收集的上清样品，混合蛋白上样缓冲液，沸水煮样5min后，直接进行SDS-PAGE分析。重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，并为可溶性表达，用尿素溶解离心后所得上清作为样品，按照说明书利用Ni-NTAHis-BindResin纯化得到重组蛋白。

2.结果

2.1重组质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1的构建及鉴定

利用PCR扩增得到大小为1245bp的SjTOR特异片段(图1，左图A泳道)，与预期目的片段大小相符。利用生物信息学软件预测SjTOR的N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)序列并利用PCR获得大小为357bp的SjTOR的N端第一个膜外区(SjTOR-ed1)片段(图1，左图B泳道)。利用PCR和限制性内切酶位点EcoRI、XhoI将SjTOR-ed1目的核苷酸片段亚克隆入载体pET28a(+)中，PCR、酶切鉴定重组的原核表达质粒均出现了与预期大小一致的DNA片段(图1，右图)。图1左图：PCR扩增产物，M：DNA分子量标准；A：SjTORPCR产物；B：SjTOR-ed1PCR产物。图1右图：双酶切鉴定重组质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1，M：DNA分子量标准；A：重组表达质粒的EcoRⅠ、XhoI双酶切结果。对阳性克隆的菌落小量液体培养后，将菌液样本送上海华津生物公司测序，结果证实核苷酸序列编码阅读框正确。

2.2实时定量PCR分析SjTOR在血吸虫不同发育阶段的表达量情况

以管家基因α-Tublin为内参，利用实时定量PCR检测SjTOR在尾蚴、7d、14d、21d、28d、35d、42d血吸虫虫体及42d雌、雄虫体中的表达情况。结果如图2所示，SjTOR在日本血吸虫各个阶段均有转录，其中在尾蚴中的转录水平最高。同时，SjTOR基因在42d雌虫中的转录量高于42d雄虫。

2.3pET28a(+)-SjTOR-ed1在大肠杆菌中的表达与重组蛋白的纯化

重组原核表达质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1在大肠杆菌BL21中获得成功表达。在1mMIPTG诱导5个小时后，蛋白表达达到最大量(见图3，在图3中，M：蛋白Marker；0～6：重组表达质粒pET28a(+)-SjTOR-ed1在大肠杆菌BL21中，在37℃，1mMIPTG条件下，诱导0、1、2、3、4、5、6小时后蛋白表达情况)。纯化后的重组蛋白SDS-PAGE结果显示，重组蛋白为可溶性表达，经纯化得到了较纯的重组蛋白(见图4，在图4中，M：蛋白Marker；A、B：pET28a(+)-SjTOR-ed1/BL21未诱导、诱导后菌体裂解液；C、D：pET28a(+)/BL21未诱导、诱导后菌体裂解液；E：重组蛋白超声后上清；F：8mol/L尿素溶解包涵体后上清液；G：纯化后蛋白)。

实施例2日本血吸虫重组蛋白rSjTOR-ed1的抗原性检测

1.WesternBlotting分析重组蛋白抗原性

将Ni柱纯化后的重组蛋白rSjTOR-ed1进行SDS-PAGE电泳，随后在4℃条件下，采用130mA，1h转移到NC膜上，用抗重组蛋白的抗血清作为第一抗体分析重组蛋白的抗原性。

2.WesternBlot分析重组蛋白抗原性的结果

WesternBlot分析结果显示，重组蛋白rSjTOR-ed1能被重组蛋白免疫血清和阳性血清分别识别，说明重组蛋白rSjTOR-ed1具有良好的免疫原性(图5、6)。在图5中，M：Marker；A：一抗为小鼠阳性血清；B：一抗为正常小鼠血清。在图6中，M：Marker；A：一抗为重组蛋白免疫血清；B：一抗为正常小鼠血清

实施例3日本血吸虫重组蛋白rSjTOR-ed1的免疫预防实验

1.方法步骤

1.1动物免疫保护实验

将6周龄BALB/c小鼠，分为三组，即重组蛋白SjTOR-ed1免疫组，206佐剂对照组和PBS对照组，每组10只小鼠。重组蛋白免疫组小鼠每次免疫时，每只小鼠皮下注射100μL重组蛋白SjTOR-ed1(20μg)和206佐剂的乳化液。206佐剂对照组每只小鼠每次皮下注射100μL206佐剂和PBS的乳化液。PBS对照组每只小鼠每次皮下注射100μLPBS。总共免疫三次，每次间隔2周，在每次免疫后7天，对每只小鼠眼眶采血，收集血清，于-20℃保存备用。三次免疫后两周，每只小鼠腹部感染40±2条尾蚴，感染42天后，采用肝静脉灌注法收集虫体并且计数。收集肝脏，称取1g肝脏剪碎后，用10mlPBS悬浮，充分匀浆后加入等体积的10％的NaOH溶液，在56℃消化1小时。每次取40μL消化液，均匀地铺在计数板上，在显微镜下计数虫卵的个数，每个样品数三次，取平均数并转换成平均每克肝组织中虫卵数(EPG)。计算减虫率和肝脏减卵率，计算公式如下：

减虫率＝[1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数]×100％；

肝脏减卵率＝[1-免疫组EPG/对照组EPG]×100％。

1.2特异性抗体水平的检测

各免疫组小鼠分别在免疫前1周，每次免疫后2周采血，按照间接ELISA方法操作，以l0μg/mlSjTOR-ed1纯化重组蛋白4℃包被过夜，次日以1.5％小牛血清白蛋白(PBST稀释)于37℃封闭1h，小鼠血清作1：100稀释，于37℃温育1h，以HRP-兔抗小鼠IgG(1:2500)做二抗，于37℃温育1h，各步骤间用PBST洗涤3次，每次5min，最后以可溶性TMB溶液进行显色，2mol/L硫酸终止反应，在450nm波长处读取OD₄₅₀值，分别检测由重组蛋白SjTOR-ed1诱导产生的特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a的水平。

2.结果

2.1重组蛋白SjTOR-ed1诱导的免疫保护效果

动物保护实验表明免疫重组蛋白SjTOR-ed1在小鼠体内诱导部分免疫保护效果，减虫率见下表1。与PBS空白对照组相比，免疫重组蛋白SjTOR-ed1在BALB/c小鼠中分别诱导了32.40％的减虫率(P<0.05)和41.41％的减卵率(P<0.05)。

表1重组蛋白SjTOR-ed1诱导的免疫保护效果

2.2特异性抗体水平的检测

应用ELISA方法检测重组免疫组、206佐剂对照组和PBS对照组小鼠血清中抗rSjTOR-ed1特异性IgG水平的变化，结果如图7所示。从图7中可见，第一次免疫重组蛋白SjTOR-ed1后，免疫组的小鼠血清中特异IgG抗体滴度即升到较高水平，并且这种高水平一直持续到感染尾蚴42天后剖杀时。而在206佐剂对照组和PBS空白对照组的小鼠血清中，特异性抗rSjTOR-ed1的IgG抗体滴度在整个过程中一直维持在较低水平，变化不明显。这说明，免疫重组蛋白能够在小鼠体内诱导较高水平的特异性IgG抗体(P<0.01)。

用间接ELISA方法检测每组小鼠血清中抗rSjTOR-ed1特异性抗体IgG1、IgG2a变化(见表2)，用重组蛋白rSjTOR-ed1一免后，小鼠抗rSjTOR-ed1重组蛋白特异性IgG1、IgG2a抗体就明显产生，IgG1抗体水平高于IgG2a抗体水平。特异性IgG1抗体在二免后又明显升高，但在三免后变化不明显。特异性IgG2a抗体水平在二免、三免后略微升高。进一步分析IgG1与IgG2a的比值，结果显示重组蛋白免疫后IgG1/IgG2a的比值一免后明显升高而后略微下降。

表2重组蛋白rSjTOR-ed1诱导产生的抗体亚型

**p<0.01<*p<0.05

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区基因，该基因序列是编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述基因序列是SEQIDNO.2所示核苷酸序列。

3.一种包含权利要求1或2所述重组载体的宿主细胞。

4.一种日本血吸虫重组抗原，其特征在于，该重组抗原是由权利要求1所述重组载体经表达而制得。

5.一种日本血吸虫重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建含日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；

培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫四跨膜孤儿受体N端第一个膜外区蛋白进一步纯化。

7.一种抗血吸虫疫苗，其特征在于，包含权利要求4所述日本血吸虫重组抗原。

8.一种能与权利要求4所述日本血吸虫重组抗原特异性结合的抗体。

9.权利要求4所述日本血吸虫重组抗原在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。

10.权利要求1所述重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。