CN103361376A - 一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

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CN103361376A CN2012101009216A CN201210100921A CN103361376A CN 103361376 A CN103361376 A CN 103361376A CN 2012101009216 A CN2012101009216 A CN 2012101009216A CN 201210100921 A CN201210100921 A CN 201210100921A CN 103361376 A CN103361376 A CN 103361376A
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其核苷酸序列为：SEQIDNO:1。本发明还公开了一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体构建方法和应用。本发明构建的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES能在鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌中稳定存在和复制，携带的外源基因可在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达，可用于鸭疫里默氏杆菌缺失突变株的互补试验、重组鸭疫里默氏杆菌疫苗的研制等，具有广阔的应用前景。

Description

一种鸭疫里默氏杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌是黄杆菌科里默氏杆菌属的代表种。里默氏杆菌属是新独立出来的一个属，目前对鸭疫里默氏杆菌质粒的研究还仅限于检测和序列测定。比如Chang 等对从台湾分离的鸭疫里默氏杆菌菌株研究后表明，60%（36/60）菌株中携带一种3.9 kb大小的质粒；12% (7/60)菌株中携带 6.5 kb 和 16 kb两种质粒； 5% (3/60)菌株中携带2.9kb, 16kb 和 18 kb三种质粒，另外13%菌株中无质粒。并在 GenBank上发表了3.9 kb 质粒 pCFC1的全序列。 Weng S等发表了一个5. 6 kb大小的质粒pCFC2的全序列。Chen等测定了鸭疫里默氏杆菌两种新质粒pRA0726和pRA0846的全序列。这两种质粒的同源性高的，pRA0846只比pRA0726少一个blaOXA-209基因和一个321bp的ORF1。
穿梭质粒是能在两种或两种以上宿主中复制的质粒，鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体是指在大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌中均能自主复制和稳定存在，且携带的外源基因能在鸭疫里默氏杆菌中表达的质粒。以大肠杆菌为宿主，具有有利于基于穿梭表达载体的重组质粒构建与筛选、便于重组质粒的保存和操作等优势；然后将构建的重组质粒导入鸭疫里默氏杆菌，这样重组质粒可以在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在，重组质粒中携带的外源基因也可以在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达。鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体可用于鸭疫里默氏杆菌突变株的互补菌株构建，以及构建重组鸭疫里默氏杆菌以研制同时预防不同血清型的鸭疫里默氏杆菌感染或预防多种鸭传染病的多联疫苗。到目前为止，尚没有鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体的报道及相关专利公布。
发明内容   
本发明的目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用。
本发明的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体能使外源基因在此载体相关元件的控制下，在鸭疫里默氏杆菌中实现表达。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
 一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其核苷酸序列为：SEQ ID NO:1。
 本发明的另一方面，所述穿梭表达载体包括如下元件：鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列、鸭疫里默氏杆菌ompA基因启动子序列、大肠杆菌的复制起始序列、氨苄青霉素抗性基因、头孢西丁抗性基因和多克隆位点。
 本发明的另一方面，其是以可在大肠杆菌工程菌中稳定存在和复制的质粒为骨架改造而来，所述质粒选自pBR322、pUC19、pUC119或pCP29。本发明优选质粒pCP29为骨架进行改造。
本发明的另一方面，所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭载体携带OriT序列，以利于构建的穿梭表达载体通过接合转导的方式导入鸭疫里默氏杆菌中。
 本发明的另一方面，其含有使所述表达质粒在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在的鸭疫里默氏杆菌质粒的复制起始元件和使携带的外源质粒在鸭疫里默氏杆菌中表达的鸭疫里默氏杆菌基因的启动子，以此使外源基因可在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达。
本发明的另一方面，所述鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭载体携带有抗性基因，以利于筛选重组质粒和携带质粒的重组细菌，所述穿梭表达载体中的头孢西丁抗性基因可替换为红霉素抗性基因或/和壮观霉素抗性基因；氨苄青霉素抗性基因可替换为氯霉素或/和卡那霉素抗性基因。
本发明的另一方面，所述穿梭表达载体中用于表达外源基因的鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白启动子序列可替换为鸭疫里默氏杆菌其他基因的启动子序列。
本发明的另一实施方式，一种所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体在重组鸭疫里默氏杆菌中的应用，其用于抗多血清型的鸭疫里默氏杆菌病、抗鸭疫里默氏杆菌病和鸭病毒性肝炎以及鸭传染病性疾病的联合、多价重组疫苗，或者构建鸭疫里默氏杆菌突变株的互补菌株。
本发明的另一实施方式，一种穿梭表达载体的构建方法，其构建方法的步骤如下：
第一步，插入多克隆酶切位点，先合成多克隆酶切位点序列，酶切位点依次为：Spe I、Pst I、Xho I、Bgl II、Xba I、Sal I、Nhe I、Apa I和Sph I，片段1： 5'-CTAGTGCTTACCGCTGCAGAGTCATTCTCTCGAGCTCAGATCTAGAGTCGACGCTAGCGGGCCCGCATG-3'；片段2：5'-CGGGCCCGCTAGCGTCGACTCTAGATCTGAGCTCGAGAGAATGACTCTGCAGCGGTAAGCA-3'，片段1和片段2用超纯水作适当稀释，再经变性和退火形成MCS DNA双链；用Spe I 和SphI双酶切pCP29质粒，回收大片段后与MCS DNA双链连接，转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒pCP29-MCS；
第二步，用鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列替换pCP29质粒上的红霉素抗性基因（ErmF），先用PCR方法从鸭疫里默氏杆菌YXL3株扩增2063bp片段，得到pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列RAori；所用的正向引物为：5'-CTAGAATTCCTATTTAGGCATTAGCCCTCTTTTT-3'，5’端添加所述下划线EcoRI酶切位点；反向引物为：5'-CTAGGACCTGTTGAGTATACTTGATCAGATCTCGT-3'，5’端添加所述下划线EcoO109 I酶切位点；PCR扩增得到重组质粒pT-RAori；将质粒pT-RAori和pCP29-MCS分别用EcoR I和EcoO109 I双酶切，回收酶切后的RAori片段和pCP29-MCS大片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒pCP29-MCS-RAori；
第三步，插入鸭疫里默氏杆菌ompA基因启动子，先用PCR扩增鸭疫里默氏杆菌ompA基因的启动子，所用的引物是：ompA promoter P1： 5'-CCGACTAGTATAGCTAAAATTTTGGCAGTAAC-3'，5’端添加Spe I酶切位点；ompA promoter P2： 5'-CGACTGCAGCATTCCAATTCTCTTATTATC-3'，5’端添加Pst I酶切位点；PCR扩增得到重组质粒pT-ompA promoter，质粒pCP29-RAori－MCS和pT-ompA promoter分别用Spe I和Pst I双酶切，回收酶切后的ompA promoter片段和pCP29-MCS-RAori质粒DNA大片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒即为构建的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭质粒。。
本发明的另一方面，所述步骤二中PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min；扩增到的片段经TA克隆后测序验证；所述步骤三中PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、55℃40s、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min，扩增到的片段经TA克隆后测序验证。
该穿梭表达载体具有如下特性：（1）以SpeI酶切位点（ACTAGT）的第一个A为起始核苷酸，该载体全长为8600 bp；（2）7-383bp为鸭疫里默氏杆菌ompA基因启动子序列；（3）384-435bp为多克隆位点，依次为Pst I、Xho I、Xba I、Sal I、Nhe I、Apa I和Sph I共7个单酶切位点；（4）436－1620bp为大肠杆菌的复制原点ori；（5）1621-2681bp为氨苄青霉素抗性基因序列；（6）6034-6825bp为OriT序列；（7）6826-8601bp为头孢西丁抗性基因序列。因此，本发明鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体包括如下元件：鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列、鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白的启动子序列、大肠杆菌的复制起始序列、氨苄青霉素抗性基因、头孢西丁抗性基因和多克隆位点。
本发明的有益效果为：
1、本发明表达载体在鸭疫里默氏杆菌中具有表达外源基因的能力。
2、本发明表达载体可用于构建重组鸭疫里默氏杆菌，用于研制预防多血清型鸭疫里默氏杆菌或多种鸭病原（细菌或病毒）的感染的疫苗。
3、本发明表达载体可用于构建鸭疫里默氏杆菌基因突变（缺失突变或插入突变）株的互补菌株，进行基因的功能研究。
附图说明
图1. 本发明的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES的结构示意图；
图2. 结晶紫染色法检测突变株CH3△dhdps、互补株CH3△dhdps(pRES-dhdps)和野生株CH3的生物被膜形成能力；
图3. 荧光显微镜观察突变株CH3△dhdps、互补株CH3△dhdps(pRES-dhdps)和野生株CH3生物被膜的形成情况；
图4. Western blot验证鸭致病性大肠杆菌ompA基因在鸭疫里默氏杆菌中的表达，泳道1：CH3; 泳道2：CH3(pRES-ompA)。
具体实施方式
 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1：鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体的构建
所述的鸭疫里默氏杆菌为任一鸭疫里默氏杆菌菌株，本实例中所用的鸭疫里默氏杆菌CH3株和YXL3株由发明人分别从国内发病鸭心血和肝脏中分离并鉴定（均为血清1型）；所述的大肠杆菌为大肠杆菌工程菌，如S 17-1 λpir，CC118 λpir、SM10 λpir和DH5a λpir等，本实例中所用的大肠杆菌S 17-1 λpir株购自西班牙Biomedal公司。
第一步，插入多克隆酶切位点。先合成多克隆酶切位点序列，酶切位点依次为：Spe I、Pst I、Xho I、Bgl II、Xba I、Sal I、Nhe I、Apa I和Sph I，片段1： 5'-CTAGTGCTTACCGCTGCAGAGTCATTCTCTCGAGCTCAGATCTAGAGTCGACGCTAGCGGGCCCGCATG-3'；片段2：5'-CGGGCCCGCTAGCGTCGACTCTAGATCTGAGCTCGAGAGAATGACTCTGCAGCGGTAAGCA-3'，片段1和片段2用超纯水作适当稀释，再经变性和退火形成MCS DNA双链。用Spe I 和SphI双酶切pCP29质粒，回收大片段后与MCS DNA双链连接。转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒pCP29-MCS。
第二步，用鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列替换pCP29质粒上的红霉素抗性基因（ErmF）。在前期研究中，发明人先检测了已报道质粒pCFC1、pCFC2和pRA7026在不同血清型鸭疫里默氏杆菌中的分布，结果表明所检测的鸭疫里默氏杆菌中质粒pCFC1和pCFC2的携带率均为100%，而pRA7026的携带率为0。所以本发明选择鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始元件来构建鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体。先用PCR方法从鸭疫里默氏杆菌YXL3株扩增2063bp片段，得到pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列RAori。
所用的正向引物为：5'-CTAGAATTCCTATTTAGGCATTAGCCCTCTTTTT-3'，5'端添加EcoRI酶切位点（下划线，下文标示相同）；
    反向引物为：5'-CTAGGACCTGTTGAGTATACTTGATCAGATCTCGT-3'，5'端添加EcoO109 I酶切位点。PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min。扩增到的片段经TA克隆后测序验证，得到重组质粒pT-RAori。将质粒pT-RAori和pCP29-MCS分别用EcoR I和EcoO109 I双酶切，回收酶切后的RAori片段和pCP29-MCS大片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒pCP29-MCS-RAori。
第三步，插入鸭疫里默氏杆菌ompA基因启动子。先用PCR扩增鸭疫里默氏杆菌ompA基因的启动子，所用的引物是：ompA promoter P1： 5'-CCGACTAGTATAGCTAAAATTTTGGCAGTAAC-3'，5'端添加Spe I酶切位点；ompA promoter P2： 5'-CGACTGCAGCATTCCAATTCTCTTATTATC-3'，5'端添加Pst I酶切位点。PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、55℃40s、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min。扩增到的片段经TA克隆后测序验证，得到重组质粒pT-ompA promoter。质粒pCP29-RAori－MCS和pT-ompA promoter分别用Spe I和Pst I双酶切，回收酶切后的ompA promoter片段和pCP29-MCS-RAori质粒DNA大片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒即为构建的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，命名为pRES（质粒图谱见图1，全序列见SEQ NO.1）。
然后测定了构建的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES在鸭疫里默氏杆菌中的稳定性。将质粒pRES转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到的阳性菌命名为S 17-1(pRES)。将供体菌大肠杆菌S 17-1 (pRES)和受体菌鸭疫里默氏杆菌CH3分别培养至对数中期，按细菌数1：2作接合转导，挑取在头孢西丁抗性平板上的单菌落，增殖后进行PCR鉴定，确认质粒pRES已导入鸭疫里默氏杆菌CH3中，得到携带鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES的重组鸭疫里默氏杆菌CH3(pRES)。将CH3(pRES)在胰酶大豆肉汤培养基（含头孢西丁抗性）连续传代，每代用PCR检测质粒pRES的存在。结果表明，重组菌CH3(pRES)连续传10代后，鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES在鸭疫里默氏杆菌CH3中仍稳定性存在。
实施例2：利用鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体构建鸭疫里默氏杆菌dhdps基因突变株的互补菌株
    鸭疫里默氏杆菌血清1型CH3株具有很强的生物被膜形成能力，研究其生物被膜形成相关的基因对于解析鸭疫里默氏杆菌生物被膜的生物学功能和生物被膜形成的分子机制，寻找抑制鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成和破坏或清除已形成的生物被膜等至关重要。本专利申请人用转座子随机突变技术构建了鸭疫里默氏杆菌CH3株的随机突变库，筛选到了一些可能与其生物被膜形成相关的基因，其中dhdps基因插入突变株CH3△dhdps生物被膜形成几乎完全消失。为了进一步dhdps基因是鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成相关基因，利用鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES构建了CH3△dhdps突变株的互补菌株。
构建步骤如下：
（1）扩增鸭疫里默氏杆菌dhdps基因ORF（开放阅读框架）：用PCR方法从鸭疫里默氏杆菌CH3株扩增dhdps基因。
所用的正向引物为：5'-TACTGCAGATGAAAAATTTATCAGGTCTAGG -3' , 5'端添加PstI酶切位点；反向引物为：5'-ATGCATGCTTAACTGAAAACAGAGTGTAGTC-3'，5'端添加SphI酶切位点。PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min。扩增到的片段经TA克隆后测序验证，得到重组质粒pT-dhdps。
（2）构建互补质粒：鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES和质粒pT-dhdps分别用Pst I和Sph I双酶切，回收酶切后的dhdpsORF DNA片段和pRES质粒DNA片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒即为构建的互补质粒，命名为pRES-dhdps。
（3）构建突变株CH3△dhdps的互补菌株：将供体菌大肠杆菌S 17-1 (pRES-dhdps)和受体菌鸭疫里默氏杆菌CH3△dhdps分别培养至对数中期，按细菌数1：2作接合转导，挑取在头孢西丁抗性平板上的单菌落，增殖后进行PCR鉴定，确认质粒pRES-dhdps已导入突变株CH3△dhdps中，得到突变株的互补菌株CH3△dhdps(pRES-dhdps)。
（4）突变株CH3△dhdps、互补菌株和野生株CH3的生物被膜测定：将突变株CH3△dhdps、互补菌株和野生株CH3对数期中期的菌液用TSB培养基按1：200稀释，接到96孔平底细胞培养板，静置培养24小时后，用结晶紫染色法测定以上3株细菌生物被膜的形成能力，并用荧光显微镜观察生物被膜的形成情况。结果表明突变株的互补菌株能有效地回复其生物被膜的形成（图2，图3）。此试验进一步证实了dhdps基因与生物被膜的形成相关，也验证了本发明构建的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体用于鸭疫里默氏杆菌是有效的和可靠的。
实施例3：利用鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体构建表达鸭致病性大肠杆菌OmpA蛋白的重组鸭疫里默氏杆菌
鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体携带的外源基因可在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达，因此可以构建表达外源基因的重组鸭疫里默氏杆菌。
构建步骤如下：
（1）扩增大肠杆菌ompA基因ORF（开放阅读框架）：用PCR方法从O1血清型鸭致病性大肠杆菌株WX株扩增ompA基因。
所用的正向引物为：5'-TACTGCAGGTGAAGGATTTAACCGTGTTATCTC -3' , 5'端添加PstI酶切位点；反向引物为：5'-TCTCTAGATTAAGCCTGCGGCTGAGTTACAAC-3'，5'端添加XbaI酶切位点。PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、60℃ 80s、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min。扩增到的片段经TA克隆后测序验证，得到重组质粒pT-ompA。
（2）构建重组质粒：鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES和质粒pT-ompA分别用Pst I和Xba I双酶切，回收酶切后的ompAORF DNA片段和pRES质粒DNA片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒命名为pRES-ompA。
（3）构建重组鸭疫里默氏杆菌：将供体菌大肠杆菌S 17-1 (pRES-ompA)和受体菌鸭疫里默氏杆菌CH3分别培养至对数中期，按细菌数1：2作接合转导，挑取在头孢西丁抗性平板上的单菌落，增殖后进行PCR鉴定，确认质粒pRES-ompA已导入鸭疫里默氏杆菌CH3中，得到表达鸭致病性大肠杆菌ompA蛋白的重组鸭疫里默氏杆菌CH3(pRES-ompA)。用western blot检测OmpA蛋白的表达（见图4）。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子。所述的鸭疫里默氏杆菌可以为其他任一鸭疫里默氏杆菌菌株；所述的大肠杆菌除了S 17-1 λpir外，还可以为其他的大肠杆菌工程菌（如CC118 λpir、SM10 λpir和DH5a λpir等）。
本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
序列表
 
<110>  中国农业科学院上海兽医研究所
<120>一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体及其构建方法和应用
<130>  说明书序列表
<160>  6    
<170>  PatentIn version 3.3
 
鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体pRES的全核酸序列SEQ ID NO.1（8600bp）：
 ACTAGTATAGCTAAAATTTTGGCAGTAACAAAAAAATATATTTAATTTGCATTATCAATTATTTAATTATTTAATTCTATGAAAAATCTAAAATTAGGAATTTCAGCATTAGCACTTACTGTTGCTACTACTGTTTCTGCTCAGACTACTAGCAATCCTTGGTTAATAGGTGTTGGTGCTCATGGCGTGAATCATGTAGCTGCTGGAGGAAGTGCTGGAGATGTTTTAAAACAGCATTTACAGGCAAGAGTTTGTACAATATCAATAATTTTACAATTACTCCGCCATTGTCTAAGCTTACAGTTGCTAGAAACTTGAACAAGGCGTTAGTTCTTGACTGGCAAACTTCAGTAGGTAATATTGATAATAAGAGAATTGGAATGCTGCAGAGTCATTCTCTCGAGCTCAGATCTAGAGTCGACGCTAGCGGGCCCGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGCGATTTGACAATCCTGAAATAAACAGAAATGACTTAAGGGCTATCTTGTTGAATAGTTTAGAAAACGACACGGTTATTTGGGATAGAAAACTTGTTATGCTTGAACCTGGTAAGAAGAAGTGGACACTAACTTTTGAGAATAAACCGAGTGAAACAGCAGATTTGGTTATTCTTGCCAATGGCGGGATGTCCAAGGTAAGAAAATTTGTTACCGACACGGAAGTTGAAGAAACAGGTACTTTCAATATACAAGCCGATATTCATCAACCAGAGATAAACTGTCCTGGATTTTTTCAGCTATGCAATGGAAACCGGCTAATGGCATCTCACCAAGGTAATTTATTATTTGCTAACCCCAATAATAATGGTGCATTGCATTTTGGAATAAGTTTTAAAACACCTGATGAATGGAAAAACCAAACGCAGGTAGATTTTCAAAACAGAAATAGTGTCGTTGATTTTCTTCTGAAAGAATTTTCCGATTGGGACGAACGCTACAAAGAATTGATTCATACGACGTTGTCATTTGTAGGATTGGCTACACGGATATTTCCTTTAGAAAAGCCTTGGAAAAGCAAGCGCCCATTACCCATAACAATGATTGGGGATGCCGCACATTTGATGCCGCCTTTTGCAGGGCAGGGAGTAAATAGTGGGTTGGTGGATGCCTTGATATTGTCTGATAATCTAGCCGATGGAAAATTTAATAGCATTGAAGAGGCTGTTAAAAATTATGAACAGCAAATGTTTATGTATGGCAAAGAAGCACAAGAAGAATCAACTCAAAACGAAATTGAAATGTTTAAACCCGACTTTACGTTTCAGCAATTGTTAAATGTATAAAATGGAATAAAACGGCACATAACAAACAAATTGGCAATAGAGCCGGTGAAGTACTTCTATTGAACTTTTGTGCAATGTTGAAGATTAGTAATTCTATTCAACATTTGTGCTAAAAGTCGGCTCCATCGCCAATTTGCCAGCCGTTATGCGGCAGCTTAAAAAAAGACTACACCAAACCAAAAAAATCATCTTGACAACCACCCGACTTTGAACTACGAAGGATGAAATTTTTCAGGGACAACTTCCAGCATTTCCAAAAAACAGTTTAACCATTGACTTGGAGACAAACAAACAATTTGAGCATTAAGGTTTAAACCGAATTTTTCCGAAATTGACCTGACCTGACTTTTCCTGAAAATCGACTTTAAAGCTGTTTTTACAGATAAATCAGGTTTCTCTAACAGATAGGAAATAAATGCTAAGTATTTGGCTTTAAACTTAAAATCAAAAAATAAGTGTTTTCTTTTAATGTTTAACAGGGCTGATTTGACAGTTGGCGGTGGCAAGAAACTTTCAGGaCCTGTTGAGTATACTTGATCAGATCTCGTATAGAGCTCGATTAAGTTTTTATATAGCATTTTTTTTCTAATACTTCTTTAATTATTAGGAGCTATTTATCCATCCCCTTTTCTTTAGCTTCAATAAAGTTTCTTTCTCGGAACGCTCCGATTAATTTTTCGTGAATATCCAATTGCTTATTGTAAGATAGTCTGAAATATTCTATTTGTGTTTTTAGAGTATCCAAATGTTCATTAGACAGTTTAATTTGCTCTTTCAAAAAAGGGTACTCTGTGATCCTTTTTTTAAACTCTTGGTATTCCTCTTCTGTGAAGTATTCAATATGAGGAAATTCTTCATTTTTATCCTGTCGTTCGTTGTCGTTCGTTGTCGCTAAAATGTCGTAATGGTGTCGCTCGGCAAGAAAGAAAACAATGTCTTCTGGTATTGAAAAGCCCTTTCTGTCGGTATTTGATATGTTGTCGCTTAGTGTCGTTATGTGTCGCTGGATTGTCCGTTCGCTGACGCCAAAAAGCTCTGCGATTTCTTTTGTTGTATATTTTTTCATaagcCTATTGTTGTTCTTTTTTGAAATCTTTAAGCATATTTCTTATAATCCCAATCACATAAGCAGGAGATATTTTTCCTTTCTTAGTCCGACTTTTTCTTATCTCTTGAAAAAGGAAGAAAGAATAGTTTGATGGAAGTGTAGCCTTACAATCTTTGAATAGGGCATAGTTGTTTAATAAACCTTGTTGTGTAAAACCAAATTCGTTTGTAAAAACATCAATTTCTCTTTGAGTTAATACAGAGTGTATATCTTTTTCCTCTTCTATTTTGATCATCTTCATACTTTCATCTGCAAATTGTTCTTGGAAAATAGGAATTAGAGAAATAATTTTTTTATCCTTTGAAAGAGTATAATCAAAAGTGTATGGAGAACATTTATCTAACTCGTTTTTAGCGGGGTCTAATACACGGCGTTTAAACATACTGATATTAAGATTACCCTGAGGGTTCCTGTACTTATTTTCCAATTGAAACATTTTTTCAAGAAATGACACTTCATATGTTATTGGTTTGGTTTTATTAGCTATCAGTTCGTAAAAACGCATTGCATAAATAGTCTCAAACTGCATAGCAATCTTCAATTCATATTTTCTCCATCCTCTTGTAAAATCCATTACCGCTTCAACAATTCTTTTGTCAGATTGCCAAGTAACATTTCTTCCATATTTATCAATCCAAAACTTATCAATAACACCAAAGCAAGCGTATTCTTTTTCATCTTCGTACTCAATGTTCTTTGATTTTAGGTCTTTGAATGCTTTTTTAATTTTATAATAATTTTTATCTTCATCATTAGCTAACAGCATAGAAATTGGAATTGTATATTTTTTATCCCCCCATAGGTTAGTATCTATTTTGATACAATCTTTCAACGCCTCATTATTTAGCAATGCCTGTTCTATTTCTATTTGCCTATATAGTATACGCTTTTCATAGACTGAAAAATCATATTTAGCCGTAGTAAAAATATAGGACTGAAACATTAGTTTATTATCTACTTTTGCCATATATAGAGAGTTATGAATATAAAATGCACTTTTAGAATACAAATATATAAAAAATGAACTTACTAAAAAGCAAGTTTAAAAAAGTATTCTAAAAGTTCAAAAAAAGTATTCTAAAAGTTCATTTTTGGAGCTAAAAAGACTAATAAAGTATTCTAAAAGTTCATTATTTTTATATAACTTCCTATTTATTAAATAGTTCCGAGGATTGGTAGATTTGTCTTTTAGTAGTTTATTTTAAAGGTAATAGAAATAAGTTTAATGTTAATAAGTTTGGTTTTGTATAATATTGAAAATCAATAGTTTATAAATTTGAGTTTATTTTAAAAGTATTCTAAAAGTTCACGAATGAAAAAAAACAAACAAAAAGCATAGCAAGAATTTTCTAACACTGGGTGATATTATGTATAGCATAGTAAATCATAATCACTTGATATTTAATATCTTATGATTTAATTATTTTTTAAGTCAGGTTAAAAAGAGGGCTAATGCCTAAATAGGAATTCGGCGCTCGGTCTTGCCTTGCTCGTCGGTGATGTACTTCACCAGCTCCGCGAAGTCGCTCTTCTTGATGGAGCGCATGGGGACGTGCTTGGCAATCACGCGCACCCCCCGGCCGTTTTAGCGGCTAAAAAAGTCATGGCTCTGCCCTCGGGCGGACCACGCCCATCATGACCTTGCCAAGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGATCTTCGCCAGCAGGGCGAGGATCGTGGCATCACCGAACCGCGCCGTGCGCGGGTCGTCGGTGAGCCAGAGTTTCAGCAGGCCGCCCAGGCGGCCCAGGTCGCCATTGATGCGGGCCAGCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCCCGTGATTTTGTAGCCCTGGCCGACGGCCAGCAGGTAGGCCGACAGGCTCATGCCGGCCGCCGCCGCCTTTTCCTCAATCGCTCTTCGTTCGTCTGGAAGGCAGTACACCTTGATAGGTGGGCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAGCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCCGGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGAAGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCCTGCCCGGCTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAAGTCTACACGAACCCTTTGGCAAAATCCTGTATATCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGAAAAAATCGCTATAATGACCCCGAAGCAGGGTTATGCAGCGGAAAAATTCGGGGGATCCCCAAAATCAGTTCTTTAGCGATTACTAATTTACAAAGAAAATTCGACAAACTGTTATTTTTCTATCTATTTATTTGGGTGGGAAACTTTAGTTATGTACCTTTGTCGGCAAATAAAGATATTCTCGTCAAACAAATATAAATAATATAAACATGGAAAAAAACAGAAAAAAACAAATCGTAGTTTTGAGTATAGCTTTAGTTTGCATTTTCATCTTGGTATTTTCATTGTTCCATAAATCAGCGACAAAAGATAGCGCAAATCCTCCTTTAACAAATGTTTTGACTGATAGCATTTCTCAAATTGTCTCAGCTTGTCCTGGCGAAATTGGTGTGGCGGTTATTGTTAATAACAGAGATACGGTTAAGGTCAATAATAAGAGTGTTTATCCTATGATGAGTGTGTTTAAGGTTCATCAGGCATTAGCTCTTTGTAATGACTTTGACAATAAAGGAATTTCACTTGATACCTTAGTAAATATAAATAGGGATAAACTTGACCCAAAGACTTGGAGTCCTATGCTGAAAGATTATTCAGGGCCAGTCATATCATTGACAGTGAGAGATTTGCTGCGTTATACTCTTACTCAGAGTGACAACAATGCAAGCAACCTTATGTTTAAGGATATGGTTAATGTCGCTCAAACAGATAGTTTTATAGCCACACTCATTCCTCGTTCAAGTTTTCAGATAGCTTATACGGAAGAGGAAATGTCGGCTGACCATAACAAGGCTTACTCTAACTATACATCTCCTCTTGGTGCTGCAATGTTGATGAATCGTTTGTTTACTGAAGGTCTTATCGATGATGAGAAACAAAGTTTCATTAAGAATACGTTAAAAGAATGCAAAACAGGTGTAGATAGGATAGCAGCTCCACTTCTTGATAAAGAAGGGGTTGTTATAGCGCATAAGACAGGTTCAGGTTATGTTAATGAAAATGGTGTTCTTGCAGCTCACAATGATGTTGCCTATATATGTCTGCCTAATAATATCAGTTATACCTTAGCGGTATTTGTTAAGGATTTCAAGGGAAATAAATCACAAGCGTCACAATATGTTGCGCATATATCAGCTGTAGTATATTCTTTATTAATGCAAACTTCAGTAAAATCTTAAACTGCACTTGCTTTGATAATTAATGATAAACAATCTAAAAGCACTCTAATCGTTATCGGAGTGCTTTTAGATTACTAATCAAATTGCTTCTATTATAATTTGAATCCTCTACTTTTTCTTTCTTCCTGTTGCGGCACTCTTGCTCCATATCTAAGCCTGTGCCATTGCTCCCTGAACCAGTCGGCAATCGGCTTCCTGTTTATTGTCAGGTTCAGCCTGCTTTCATCGTCAGGGTCATTTTCCACCCTTAAAATATCATCCTTTATATCAAAGTTCCGCCTGTGTTGCTCGGAATAGATTTTACCGCTACATTTCAGGGCTTCTTTTTTGACTATAAGACTTTCAGTCATTTCTTTAGAGAATCCCAGCATGGCACAAAACTTTTCCATGCGCAGCATTTCCCTGAACATCGGAAACCACCTGAAAGCCTTGTCTATGATTCTGGCGAGCCGTGACAGTTCTTTTTCTTTCATGTCAAGTTCCTGCCTGTGCATTTCTCTGAGATTGTGGATTTGCGTATATGCTGTTTCTGACATCTGCTGTACTTGGCTCTGCAATTTTTCAATATTGGTGTTCCGTTTTGAAACCTCGTCTTGCAGTTTTTCGTTGGCACGTTCCAGTTCTTTCAGTTTTCCACTCCCGAAAAGAGAAGCAACTCCACTAGT

Claims (10)

1.一种鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，其核苷酸序列为：SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述穿梭表达载体包括如下元件：鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列、鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白启动子序列、大肠杆菌的复制起始序列、氨苄青霉素抗性基因、头孢西丁抗性基因和多克隆位点。
3.根据权利要求1或2所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，其是以可在大肠杆菌工程菌中稳定存在和复制的质粒为骨架改造而来，所述质粒选自pCP29、pBR322、pUC19或pUC119。
4.根据权利要求1或2所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭载体携带OriT序列，以利于构建的穿梭表达载体通过接合转导的方式导入鸭疫里默氏杆菌中。
5.根据权利要求1或2所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，其含有使所述表达质粒在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在的鸭疫里默氏杆菌质粒的复制起始元件和使携带的外源质粒在鸭疫里默氏杆菌中表达的鸭疫里默氏杆菌基因的启动子，以此使外源基因可在鸭疫里默氏杆菌中稳定表达。
6.根据权利要求2所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭载体携带有抗性基因，以利于筛选重组质粒和携带质粒的重组细菌，所述穿梭表达载体中的头孢西丁抗性基因可替换为红霉素抗性基因或/和壮观霉素抗性基因；氨苄青霉素抗性基因可替换为氯霉素或/和卡那霉素抗性基因。
7.根据权利要求2所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体，其特征在于，所述穿梭表达载体中用于表达外源基因的鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白启动子序列可替换为鸭疫里默氏杆菌其他基因的启动子序列。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体在重组鸭疫里默氏杆菌中的应用，其用于抗多血清型的鸭疫里默氏杆菌病、抗鸭疫里默氏杆菌病和鸭病毒性肝炎以及鸭传染病性疾病的联合、多价重组疫苗，或者构建鸭疫里默氏杆菌突变株的互补菌株。
9.一种根据权利要求1-7任一所述的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体的构建方法，其特征在于，其构建方法的步骤如下：
第一步，插入多克隆酶切位点，先合成多克隆酶切位点序列，酶切位点依次为：Spe I、Pst I、Xho I、Bgl II、Xba I、Sal I、Nhe I、Apa I和Sph I，片段1： 5'-CTAGTGCTTACCGCTGCAGAGTCATTCTCTCGAGCTCAGATCTAGAGTCGACGCTAGCGGGCCCGCATG-3'；片段2：5'-CGGGCCCGCTAGCGTCGACTCTAGATCTGAGCTCGAGAGAATGACTCTGCAGCGGTAAGCA-3'，片段1和片段2用超纯水作适当稀释，再经变性和退火形成MCS DNA双链；用Spe I 和SphI双酶切pCP29质粒，回收大片段后与MCS DNA双链连接，转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒pCP29-MCS；
第二步，用鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列替换pCP29质粒上的红霉素抗性基因（ErmF），先用PCR方法从鸭疫里默氏杆菌YXL3株扩增2063bp片段，得到pRA0726质粒的复制起始蛋白编码序列RAori；所用的正向引物为：5'-CTAGAATTCCTATTTAGGCATTAGCCCTCTTTTT-3'，5’端添加所述下划线EcoRI酶切位点；反向引物为：5'-CTAGGACCTGTTGAGTATACTTGATCAGATCTCGT-3'，5’端添加所述下划线EcoO109 I酶切位点；PCR扩增得到重组质粒pT-RAori；将质粒pT-RAori和pCP29-MCS分别用EcoR I和EcoO109 I双酶切，回收酶切后的RAori片段和pCP29-MCS大片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒pCP29-MCS-RAori；
第三步，插入鸭疫里默氏杆菌ompA基因启动子，先用PCR扩增鸭疫里默氏杆菌ompA基因的启动子，所用的引物是：ompA promoter P1： 5'-CCGACTAGTATAGCTAAAATTTTGGCAGTAAC-3'，5’端添加Spe I酶切位点；ompA promoter P2： 5'-CGACTGCAGCATTCCAATTCTCTTATTATC-3'，5’端添加Pst I酶切位点；PCR扩增得到重组质粒pT-ompA promoter，质粒pCP29-RAori－MCS和pT-ompA promoter分别用Spe I和Pst I双酶切，回收酶切后的ompA promoter片段和pCP29-MCS-RAori质粒DNA大片段进行4℃连接，再转化大肠杆菌S 17-1，挑取在氨苄青霉素抗性平板上的单菌落，增殖后提质粒进行酶切和PCR鉴定，得到重组质粒即为构建的鸭疫里默氏杆菌－大肠杆菌穿梭质粒。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述步骤二中PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min；扩增到的片段经TA克隆后测序验证；所述步骤三中PCR扩增条件为：95℃变性5min，经95℃ 1min、55℃40s、72℃ 2min循环扩增25次，72℃延伸10min，扩增到的片段经TA克隆后测序验证。
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