CN108841850A - 用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法 - Google Patents

用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法 Download PDF

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CN108841850A CN201810367557.7A CN201810367557A CN108841850A CN 108841850 A CN108841850 A CN 108841850A CN 201810367557 A CN201810367557 A CN 201810367557A CN 108841850 A CN108841850 A CN 108841850A
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foreign gene
carrier
plasmid
riemerella anatipestifer
phes
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刘马峰
黄月
刘珈均
程安春
汪铭书
朱德康
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination

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Abstract

本发明涉及一种用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法，所述载体由质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列，该载体能够简便的将外源基因插入鸭疫里默氏杆菌基因组上，为研究细菌的蛋白定位提供了技术参考。

Description

用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，还涉及利用该载体在鸭疫里默氏杆菌基因组中插入外源基因的方法。
背景技术
在细菌学研究中，功能蛋白的定位是研究蛋白功能的重要组成部分。目前所使用的方法为，通过基因工程的方法将目的蛋白的基因在大肠杆菌异源表达、纯化并通过免疫动物来制备抗目的蛋白的多克隆抗体。然后，提取细菌的各组成成份，如外膜蛋白、胞浆蛋白等，通过免疫印迹的方法来检测目的蛋白的定位。此种方法费时费力，且涉及动物试验不利于动物福利的提高。因此，急需一种既能提高试验的效率又能提高动物福利的方法来替代这种传统的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体；本发明的目的之二在于提供利用所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，所述载体由质粒pMM47.A用PstI 限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列。
优选的，所述含高表达启动子的pheS突变基因由以下方法制得：以质粒pLMF03::pheS* 作为模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR扩增；所述质粒pLMF03::pheS*由如SEQ ID NO.5所示序列连入穿梭质粒pLMF03而得。
优选的，所述外源基因为标签蛋白血凝素肽基因。
优选的，所述含有外源基因编码序列的重组基因序列的核苷酸如核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.利用所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法，包括如下步骤：将所述载体转化供体菌S17.1，然后通过接合转移的方法将载体转移至鸭疫里默氏杆菌野生株RA ATCC11845中，涂在含有头孢西丁和卡那霉素的血平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，经扩大培养后涂板在含有p-cl-Phe的GCB平板上使其进行第二次同源重组，筛选阳性克隆，即外源基因插入鸭疫里默氏杆菌基因组。
优选的，所述血平板上，头孢西丁和卡那霉素的浓度分别为1μg/ml和20μg/ml。
优选的，所述扩大培养条件如下：将第一次同源重组的菌株在TSB培养基中37℃、180 rpm摇菌过夜。
本发明的有益效果在于：本发明用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，该载体中含有外源基因，如序列标签，可以简便高效的方法进行基因组上插入外源基因，如标签，后续可以用于鸭疫里默氏杆菌的蛋白定位研究。
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1.提供了一种在鸭疫里默氏杆菌基因组上插入标签的方法。
2.具有生物普遍性，为研究其它细菌的蛋白定位提供了技术参考。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为扩增含有pheS基因的pheSup和pheSdown片段电泳图(1泳道表示pheSup片段， 2泳道表示pheSdown片段，M表示Marker)。
图2为含有pheS点突变基因(pheS*)的融合PCR电泳结果(图中1泳道为融合片段；M表示Marker)。
图3为重组质粒pLMF03::pheS*鉴定结果如图(A：进行PCR鉴定结果，图中1泳道为重组质粒pLMF03::pheS*；B：双酶切鉴定，酶切位点为NcoI、SpeI；1泳道为双酶切重组质粒pLMF03::pheS*，2泳道为双酶切空载质粒pLMF03；3泳道为没有进行酶切的空载质粒pLMF03)。
图4为菌株R.anatipestife pLMF03和R.anatipestife pLMF03::pheS*对p-Cl-Phe的敏感性鉴定结果(图中1号为R.anatipestifer pLMF03，2号为R.anatipestiferpLMF03::pheS*)。
图5为质粒pOES具体构建过程。
图6为质粒构建过程鉴定图(A：质粒pMM47.A用PstI内切酶进行酶切后的电泳图：1泳道为酶切后的pMM47.A；B：pOES的PCR鉴定结果，1泳道为pOES质粒，2泳道为 pLMF03::pheS*质粒作为阳性对照，3泳道为阴性对照；C：pOES双酶切鉴定图：用SalI和 XbaI双酶切质粒pOES，1泳道即为进行双酶切后的电泳图)。
图7为RA0C_1912down和RA0C_1912up+RA0C_1912-HA电泳图(1泳道为下游扩增片段RA0C_1912down，2泳道为上游片段RA0C_1912up+RA0C_1912-HA)。
图8为PCR的方法鉴定融合的片段与自杀质粒pOES连接情况(1泳道为分离的单克隆 DH5αpOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down跑出的PCR条带，条带大小在1800bp左右)。
图9为重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down，用XhoI和SpeI 同时进行双酶切鉴定结果(1泳道为双酶切重组质粒 pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down)。
图10为重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down转化至供体菌 S17.1后PCR鉴定结果(1泳道为cfx基因扩增片段，2泳道为16S rDNA基因扩增片段)。
图11为鉴定RA0C_1912插入HA-tag结果(A图为cfx的PCR鉴定图，1泳道为RA ATCC为模板，2泳道RA ATCC RA0C_1912-HA-tag为模板，3泳道为cfx阳性对照；B图为上游 RA0C_1912up+RA0C_1912-HA的鉴定图，1泳道为RA ATCC为模板，2泳道为RA ATCC RA0C_1912-HA-tag为模板；C图为下游HA-tag+RA0C_1912down的鉴定图，1泳道为RA ATCC为模板，2泳道为RA ATCC RA0C_1912-HA-tag)。
图12为HA-tag多克隆抗体进行Western-blot(1泳道为野生株RA ATCC，2泳道为RAATCC RA0C_1912-HA-tag；A：用HA-tag多克隆抗体进行孵育的结果图，B：为对照组用内参蛋白RecA多克隆抗体进行孵育的结果)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明利用鸭疫里默氏杆菌R.anatipestife ATCC基因组上的pheS基因的突变体作为一种反向筛选的标记，进而发明一种自杀载体并利用此自杀载体发明一种在基因组中的某个基因后面插入标签的方法。其原理是：PheS是苯丙氨酰基tRNA合酶的α-亚单位，PheS的301位丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)后，就会降低苯丙氨酰-tRNA合成酶的底物特异性，苯丙氨酸的卤化类似物对氯苯丙氨酸(p-cl-Phe)就会被苯丙氨酰-tRNA合成酶转运至细胞中，而p-cl-Phe 对细胞有毒性作用会导致细胞死亡。因此在培养基中添加p-cl-Phe后，携带突变的pheS基因的细菌就会死亡。
构建含有pheS突变基因的自杀载体，利用同源重组及反向筛选的原理来在鸭疫里默氏杆菌的基因组插入外源基因。
本发明以在鸭疫里默氏杆菌R.anatipestife ATCC RA0C_1912基因后面插入HA-tag为例，来说明本发明的具体操作方法。
实施例1.pheS突变基因的产生
分别用引物pheS up p1：5’-catgccatggcaatgttagaatacattgacgcatatc-3’(SEQID NO.1)，pheS up p2：5’-cccataccaaatccatagccg-3’(SEQ ID NO.2)；pheS down p1:5’-cggctatggatttggtatggg-3’ (SEQ ID NO.3)，pheS down p2:5’-ggactagtcccagacttgttgattttggacg-3’(SEQ ID NO.4)扩增出pheSup部分(914bp)和pheSdown部分(418bp)，PCR扩增条件如下：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸30s，(2)-(4)循环30次；(5) 72℃延伸7min，(6)22℃保存∞；扩增结果如图1所示，然后利用融合PCR的方法将这两个片段进行融合，融合结果如图2所示，获得pheS突变基因，即pheS*，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中编码氨基酸的第301位密码子由GCT突变为GGA。
实施例2.检验该突变基因是否可以作为反向筛选标记
将融合片段克隆到穿梭质粒pLMF03(Genbank：KU997673)当中，获得重组质粒pLMF03::pheS*，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示序列进行PCR扩增，并用NcoI和Sp e I进行酶切鉴定，鉴定结果如图3所示。再通过接合转移的方式将其转入R.anatipestife ATCC，同时以转穿梭质粒pLMF03空载体作为对照，分别得到菌株R.anatipestife pLMF03::pheS*和菌株R.anatipestife pLMF03。分别将菌株R.anatipestife pLMF03与R.anatipestife pLMF03::pheS*在不同浓度p-cl-Phe(0mM、10mM、13mM)的GCB/cfx中，37℃培养箱培养18h，结果如图4所示。结果显示，在p-cl-Phe浓度为13mM时，携带有pheS突变体的菌株不生长，而对照生长良好，表明R.anatipestife pLMF03::pheS*表现出对p-Cl-Phe的敏感性，而对照R.anatipestife pLMF03并不对p-Cl-Phe敏感。因此，突变基因pheS*可作为反向筛选的标记。
实施例3.用于基因组标签插入的自杀载体pOES的构建
用质粒pLMF03::pheS*作为模板，用引物：EXpheS*p1： 5’-acgcgtcgacatttcaaaaatttaacttaaaccactg-3’(SEQ ID NO.6)，EXpheS*p2： 5’-gctctagagccctttttttgttacttatagcg-3’(SEQ ID NO.7)，将该质粒的高表达启动子和pheS*一起扩增出来，其产物命名为EXpheS*，将质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点 (图6，A)，使其成为自杀质粒并命名为pMM47.B。再将EXpheS*片段克隆至pMM47.B的酶切位点SalI和XbaI，该质粒命名为pOES，具体过程如图5所示。将构建的质粒用SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示序列进行PCR扩增检测和SalI和XbaI双酶切鉴定(图6，B)
实施例4、自杀载体pOES介导的鸭疫里默氏杆菌基因组插入标签方法的建立
以在RA0C_1912基因后面插入HA-tag为例，利用融合PCR的方法将含有HA-tag的RA0 C_1912(495bp)以及该基因的上游505bp和下游843bp融合成RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+1912down片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体步骤如下：
(1)将上游片段和下游片段通过相应引物扩增出来，分别采用如下两对引物：
上游引物：
RA0C_1912upP1：5’-ccgctcgagcgggggctcaacctaagagagctg-3’(SEQ ID NO.9)；
RA0C_1912upP2：5’-cgcgtagtccgggacgtcgtacgggtacgctgcttttttatgaccgtag-3’(SEQ ID NO.10)；
下游引物：
RA0C_1912downP1：5’-gcgtacccgtacgacgtcccggactacgcgtaatgaggctaattatactcg-3’(SEQ ID NO.11)；
RA0C_1912downP2：5’-ggactagtccttcccttagctgtaccgtagcctg-3’(SEQ IDNO.12)；
以R.anatipestife ATCC为模板，进行PCR扩增，反应程序均为：(1)98℃预变性30s； (2)98℃变性10s，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸30s，(2)-(4)循环30次；(5)72℃延伸7min，(6)22℃保存∞。扩增产物进行电泳检测，结果如图7所示。
(2)然后将上游片段和下游片段用SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12所示序列进行PCR融合，将融合的片段和自杀质粒pOES均使用酶切位点XhoI和SpeI同时进行双酶切，然后用T4连接酶将酶切片段与酶切载体进行连接，将连接产物转化至DH5α，待在抗性平板上长出克隆后，用PCR的方法鉴定片段与载体连接成功，电泳图如图8所示。
(3)从DH5α中提取重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down，用XhoI和SpeI同时进行双酶切鉴定，结果如图9所示。
(4)将重组质粒pOES::RA0C_1912up+RA0C_1912-HA+RA0C_1912down转化至供体菌S17.1，然后通过接合转移的方法将质粒转移至鸭疫里默氏杆菌野生株RA ATCC11845中。将其涂在含有1μg/ml头孢西丁(cfx)和20μg/ml卡那霉素的血平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，并用PCR的方法鉴定，结果如图10所示。
(5)之后将该菌株在4ml的TSB培养基中37℃、180rpm摇菌过夜，按照1OD含有鸭疫里默氏杆菌2×109个来计算，将105个菌涂板在含有13mM p-cl-Phe的GCB平板上，使其进行第二次同源重组。长出来的单克隆进行分离培养之后，PCR方法鉴定菌株中cfx基因是否已经从基因组中移除，鉴定RA0C_1912后面是否已插入HA-tag，电泳结果如图11所示。
(6)将野生株RA ATCC和含有HA-tag的RA ATCC RA0C_1912-HA-tag用HA-tag多克隆抗体进行孵育的结果图。
以上结果表明，此种方法可以用于鸭疫里默氏杆菌基因插入标签。并对标签进行了成功表达。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体及方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
catgccatgg caatgttaga atacattgac gcatatc 37
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
cccataccaa atccatagcc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
cggctatgga tttggtatgg g 21
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
ggactagtcc cagacttgtt gattttggac g 31
<210> 5
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
atgttagaat acattgacgc atatctacaa gaggtaaagc aatttcagtc ttcaaacaaa 60
gatgaaatag agcaattcag aataaaattt aacggtaaaa aaggaatttt aaatgccatc 120
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aagcaaacca tacagttttt cactacggag ctttttggaa agtctaaaat tagaatgaga 720
ccgtcttatt tcccattcac cgagccaagt gcggaggttg atgtttattg gggacttaac 780
tccgaaacag actaccgaat tactaaaggt actggttggc tagaaattat gggctgtggt 840
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<400> 7
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<211> 1846
<212> DNA
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<400> 8
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atcattcaaa atcaaaaaac taatatagca gaatttttag gagcaacaaa agttatcaat 1680
aaacaaaatc ctagaaatta tgtttataca gaaaaggggc gttaccttat gacttccaaa 1740
gaggtgtatc tcaataaaaa ctctagaata cattacaatg ggaaagtcct cacgggagaa 1800
accatgtatt ataaccaaaa tacaggctac ggtacagcta agggaa 1846
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 9
ccgctcgagc gggggctcaa cctaagagag ctg 33
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 10
cgcgtagtcc gggacgtcgt acgggtacgc tgctttttta tgaccgtag 49
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 11
gcgtacccgt acgacgtccc ggactacgcg taatgaggct aattatactc g 51
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 12
ggactagtcc ttcccttagc tgtaccgtag cctg 34

Claims (7)

1.用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述载体由质粒pMM47.A用PstI限制性内切酶切去复制起始位点连接得到质粒pMM47.B，再将以含高表达启动子的pheS突变基因克隆至质粒pMM47.B的SalI和XbaI酶切位点处，获得自杀载体pOES，然后在自杀载体pOES下游连入内部含有外源基因编码序列的重组基因序列。
2.根据权利要求1所述用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述含高表达启动子的pheS突变基因由以下方法制得：以质粒pLMF03::pheS*作为模板，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR扩增；所述质粒pLMF03::pheS*由如SEQ ID NO.5所示序列连入穿梭质粒pLMF03而得。
3.根据权利要求1所述用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述外源基因为标签蛋白血凝素肽基因。
4.根据权利要求1所述用于在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的载体，其特征在于：所述含有外源基因编码序列的重组基因序列的核苷酸如核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.利用权利要求1～4任一项所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述载体转化供体菌S17.1，然后通过接合转移的方法将载体转移至鸭疫里默氏杆菌野生株RA ATCC11845中，涂在含有头孢西丁和卡那霉素的血平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，经扩大培养后涂板在含有p-cl-Phe的GCB平板上使其进行第二次同源重组，筛选阳性克隆，即外源基因插入鸭疫里默氏杆菌基因组。
6.根据权利要求5所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法，其特征在于：所述血平板上头孢西丁和卡那霉素的浓度分别为1μg/ml和20μg/ml。
7.根据权利要求5所述载体在鸭疫里默氏杆菌基因组插入外源基因的方法，其特征在于：所述扩大培养条件如下：将第一次同源重组的菌株在TSB培养基中37℃、180rpm摇菌过夜。
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