CN110938577A - 鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用 - Google Patents

鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌CH‑1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用，本发明构建的弱毒株RA CH‑1△fur免疫雏鸭后，对雏鸭无明显的病理损伤；对雏鸭的体重增殖无明显的影响，具有良好的安全性。RA CH‑1△fur免疫雏鸭后对RA CH‑1野生型强毒株的攻毒保护率达100％，具有良好的免疫保护。

Description

鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方 法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种主要感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病。该病分布范围广，已成为严重危害我国养鸭业的细菌性传染病之一。目前防控该病主要通过注射灭活疫苗和药物防治。灭活疫苗制备工艺繁琐，需要多次注射才能达到保护效果；药物防治易使细菌对药物产生耐药性及对环境造成污染，而且在目前“减抗限抗”趋势下，抗生素药物的使用将会被进一步限制。所以，急需开发一种能够注射一次且具有良好保护效果的基因工程弱毒疫苗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、本发明提供了鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur，即鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)CH-1△fur，于2019年8月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019600。
2、本发明提供了上述鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur的构建方法，具体步骤如下：
(1)RA CH-1 fur基因左右同源臂及Spec抗性基因(壮观霉素抗性基因，SpecR)的PCR扩增：以RA CH-1基因组作为模板，利用SEQ ID NO.1～4所示的两对引物fur-L F/R和fur-R F/R，PCR扩增fur基因左右同源臂片段fur-L和fur-R，它们的核苷酸序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示；以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示的质粒pBAD24::SpecR作为模板，利用SEQ ID NO.8～9所示的引物对，PCR扩增SpecR序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；
(2)fur-LSR融合片段的构建：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR，即fur-L+SpecR+fur-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
(3)RA CH-1 fur基因缺失株的构建：向RA CH-1株(Wang et al.,BMCGenomics.2014 Jun 17；15:479)培养所得菌悬液中加入fur-LSR融合片段，孵育，稀释后涂布于含Spec的GCB固体培养基上，培养，即得；
质粒pBAD24::SpecR，即大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue pBAD24::SpecR，于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019746；
其中，各序列如下：
fur-L F:ATCACGAAACTCTTGGCAGCCTCAAC，如SEQ ID NO.1所示；
fur-L R:CGTTATTAGTTATAGTTATTATAACATGTATTCACGAACCTTGATATTCCATCGAGTC，如SEQ ID NO.2所示；
fur-R F:GGCTTAATTTTGCCCTTATTTTTAATTCAAAAATTATAATGAGGCTAATTATACTCGTAC，如SEQ ID NO.3所示；
fur-R R:ATAGACCTCTATTTTATCTCCCGAG，如SEQ ID NO.4所示；
左同源臂片段fur-L：
GAGTTAGGTTTCTTCAGTGCTAATGTGATAAAATTTCACGAGGGCGGTTGGATTACGGTAGTTCTTGCTGGTTTTATAGGTATTTGTATGTATGCTTGGTATAATGGTAGAATGATAAAAAACAGATTTATAAAATTTGTAAAACTAGAGAATTATATTTCTACGATTAGAGATTTAAAACTAGATGATAGTGTGCCTAAATATGCTACTAACCTAGCCTTCTTTAGCCGTGCTAAAAGGGAAGATGAAATAGAGTCTAAAATTATTTATTCTATAATTAGAGCTCAGCCCAAAAGAGCTGATCATTATTTTATACTGAACATCATCAATCAAGAAAACCCTTATACTTTTAAATATGAAATAGATGAGGTGTTACCTGGTACTATTTATAAAATCAATTTCTTACTAGGTTTTAAAATAGATAGAAGGATAAATGATTATTTCCAAGATGTATTAGAGGATATGATGAATTCTGGAATTATCTCCGATAAGAGTAACTATCCATCGCTTAGAAGCCATAATATACCTCCAGATATGAAGTATGTGATTATAGATAATGTCTGTATAAATGATAAACTTTTTACCATAAAGGAAAAAATTACAATGAATATTTATAACTTTGTAAAAAAATTAGGTAGCAACGATTTTAAAGCCTTTGGGCTTGCCACACACAATGTGGTCGTAGAATCTGCACCACTTTTGTATTCGGCAGCAGGAGATCAACGCATACAAATGGATAATTTTAAAACAAGTAATTAAATAATTCTAAAAATAAAAAGACTCGATGGAATATCAAGGAAAAG，如SEQ ID NO.5所示；
右同源臂片段fur-R：
ATGAGGCTAATTATACTCGTACTAATGTGCTTAGGGTTTTCTGTATGGGCACAACAGAAAGAGAAAACCTCTACAATGTCATTGGCAAAAGATGCGTATTTTAAACCAAATCCTAATACCAAAGGTACTGTTACAGGAAATGAAGAAAAGCTGAAACACATTCATTCAGATTCTTTGGTTAGACGCCCCGACTTATACGAAGGTAATCCTATTTTTATTGGTAATGTAGAGTTTCAGCATCAAGGTTCTGTTTTAAAGGCAGATAAAGTTATTTTTTACCAAAATGATAATTTTGTAAAAGCAATAGGCAATGTGGTACTTACCACTGCCGAAGGCAACCGCATTACTTCCCAAGAAATGGAATATGATGGCAAAACTCAAAGAGGTATCGCAAGAAAGAATGTAGTACTTACAGACCCACAACAAACCATAAAAACAGAAACGCTCTATTACGACCGTTTACCCAATACGGCTTATTTTAATTCGGGAGGAACTATTTACAATGGCAGAAATACCATTTGGACGCAGGTAGCCACCTATAACATCAACACACAGACGGTAGATGTTTCAGGCAATGTAAGTATTGACAATGATAAATATCGTGTAGAAGGTTCTAAAATCATTCAAAATCAAAAAACCAATGTAGCAGAGTTTCTAGGTGC，如SEQ ID NO.6所示；
质粒pBAD24::SpecR：
GCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGCTGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAGAAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGGCTAGCAGGAGGAATTCACCATGGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAAGCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTTGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCTGCTCATGTTTGACAGCTTATC，如SEQ ID NO.7所示；
Spec F：GACTCGATGGAATATCAAGGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACG，如SEQ ID NO.8所示；
Spec R：GTACGAGTATAATTAGCCTCATTATAATTTTTGAATTAAAAATAAGGGCAAAATTAAGCC，如SEQ ID NO.9所示；
SpecR序列：
TTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAAGC，如SEQ ID NO.10所示；
fur-L+SpecR+fur-R：
GAGTTAGGTTTCTTCAGTGCTAATGTGATAAAATTTCACGAGGGCGGTTGGATTACGGTAGTTCTTGCTGGTTTTATAGGTATTTGTATGTATGCTTGGTATAATGGTAGAATGATAAAAAACAGATTTATAAAATTTGTAAAACTAGAGAATTATATTTCTACGATTAGAGATTTAAAACTAGATGATAGTGTGCCTAAATATGCTACTAACCTAGCCTTCTTTAGCCGTGCTAAAAGGGAAGATGAAATAGAGTCTAAAATTATTTATTCTATAATTAGAGCTCAGCCCAAAAGAGCTGATCATTATTTTATACTGAACATCATCAATCAAGAAAACCCTTATACTTTTAAATATGAAATAGATGAGGTGTTACCTGGTACTATTTATAAAATCAATTTCTTACTAGGTTTTAAAATAGATAGAAGGATAAATGATTATTTCCAAGATGTATTAGAGGATATGATGAATTCTGGAATTATCTCCGATAAGAGTAACTATCCATCGCTTAGAAGCCATAATATACCTCCAGATATGAAGTATGTGATTATAGATAATGTCTGTATAAATGATAAACTTTTTACCATAAAGGAAAAAATTACAATGAATATTTATAACTTTGTAAAAAAATTAGGTAGCAACGATTTTAAAGCCTTTGGGCTTGCCACACACAATGTGGTCGTAGAATCTGCACCACTTTTGTATTCGGCAGCAGGAGATCAACGCATACAAATGGATAATTTTAAAACAAGTAATTAAATAATTCTAAAAATAAAAAGACTCGATGGAATATCAAGGAAAAGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAAGCATGAGGCTAATTATACTCGTACTAATGTGCTTAGGGTTTTCTGTATGGGCACAACAGAAAGAGAAAACCTCTACAATGTCATTGGCAAAAGATGCGTATTTTAAACCAAATCCTAATACCAAAGGTACTGTTACAGGAAATGAAGAAAAGCTGAAACACATTCATTCAGATTCTTTGGTTAGACGCCCCGACTTATACGAAGGTAATCCTATTTTTATTGGTAATGTAGAGTTTCAGCATCAAGGTTCTGTTTTAAAGGCAGATAAAGTTATTTTTTACCAAAATGATAATTTTGTAAAAGCAATAGGCAATGTGGTACTTACCACTGCCGAAGGCAACCGCATTACTTCCCAAGAAATGGAATATGATGGCAAAACTCAAAGAGGTATCGCAAGAAAGAATGTAGTACTTACAGACCCACAACAAACCATAAAAACAGAAACGCTCTATTACGACCGTTTACCCAATACGGCTTATTTTAATTCGGGAGGAACTATTTACAATGGCAGAAATACCATTTGGACGCAGGTAGCCACCTATAACATCAACACACAGACGGTAGATGTTTCAGGCAATGTAAGTATTGACAATGATAAATATCGTGTAGAAGGTTCTAAAATCATTCAAAATCAAAAAACCAATGTAGCAGAGTTTCTAGGTGC，如SEQ ID NO.11所示。
优选的，步骤(1)中，RA CH-1 fur基因左右同源臂的PCR扩增条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min。
优选的，步骤(1)中，Spec抗性基因的PCR扩增条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃50s循环扩增30次，72℃延伸7min。电泳结果见图1。
优选的，步骤(2)的具体方法是：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR(fur-L+SpecR+fur-R)：回收的基因片段fur-L、SpecR、fur-R，经Nanodrop 2000测定浓度，以2:1:2的质量比混合作为PCR扩增的模板，融合PCR前5个循环不加入引物，后25个循环加入引物fur-L F和fur-R R。
进一步优选的，PCR反应条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃1min30s循环扩增30次，72℃延伸7min。
优选的，步骤(3)的具体方法是：将RA CH-1株在GCB液体培养基(按每100mL量计算：蛋白胨1.5g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.4g，质量浓度0.4％葡萄糖，质量浓度0.5‰Fe(NO3)3，质量浓度0.02‰VB1，蒸馏水补充至100mL)培养至对数生长期并将菌液调整至OD600＝1；取出300μL菌悬液加入1μg的fur-LSR，37℃孵育1小时后吸取100μL，稀释104～106倍后涂布于含80μg/mL Spec的GCB固体培养基(液体培养基+1.5％agar，具体包含：每100ml培养基含蛋白胨1.5g，氯化钠0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.4g，质量浓度0.4％葡萄糖，质量浓度0.5‰Fe(NO3)3，质量浓度0.02‰VB1,琼脂1.5g，蒸馏水补充至100mL)上，培养24～48小时。
进一步优选的，培养后挑取生长的单克隆进行PCR鉴定，具体方法是：
以RA CH-1保守序列引物16s rRNA F/R
16s rRNA F：CTTCGGATACTTGAGAGCG，如SEQ ID NO.12所示；
16s rRNA R：GCAGCACCTTGAAAATTGT，如SEQ ID NO.13所示；
PCR扩增RA CH-1的16s rRNA片段(～600bp)，判定候选突变株是否为鸭疫里默氏杆菌；
以Spec抗性基因的引物Spec F/R
Spec F：GACTCGATGGAATATCAAGGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACG，如SEQ ID NO.8所示；
Spec R：GTACGAGTATAATTAGCCTCATTATAATTTTTGAATTAAAAATAAGGGCAAAATTAAGCC，如SEQ ID NO.9所示；
扩增Spec抗性基因片段(～1200bp)，判断是否发生基因的替换；
以引物fur F/R：
fur F：CATGCCATGGAACATCAAGAGAAAG，如SEQ ID NO.14所示；
fur R：GGACTAGTCCTTATGCTTTTTTATGACCGTAG，如SEQ ID NO.15所示；
扩增目的基因以检测fur基因是否被缺失。
3、本发明提供了上述鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur在制备鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明构建的弱毒株RA CH-1△fur免疫雏鸭后，对雏鸭无明显的病理损伤；对雏鸭的体重增殖无明显的影响，具有良好的安全性。本发明采用自然转化代替自杀载体的构建方法，RA CH-1△fur免疫雏鸭后对RA-CH-1野生型强毒株的攻毒保护率达100％，免疫保护效果良好。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1 RA CH-1株fur基因左右同源臂和Spec抗性基因的PCR扩增结果。M：Marker；泳道1：左侧同源臂fur-L的扩增结果；泳道2：右侧同源臂fur-R的扩增结果；泳道3：Spec抗性基因扩增结果。
图2 fur LSR融合片段扩增结果。M：Marker；泳道1：fur LSR融合片段扩增结果。
图3.RA CH-1fur缺失株的鉴定结果。M:DNA Marker；泳道1:RA CH-1为模板16srRNA扩增结果；泳道2:RA CH-1△fur为模板16s rRNA扩增结果；泳道3:pBAD24::SpecR为模板SpecR基因扩增结果；泳道4:RA CH-1为模板扩增SpecR结果；泳道5:RA CH-1△fur为模板扩增SpecR结果；泳道6:RA CH-1为模板扩增fur基因结果；Lane 7:RA CH-1△fur为模板扩增fur基因结果。
图4.雏鸭免疫RA CH-1△fur后对体重增殖的影响。与未免疫组及注射PBS组相比，免疫RA CH-1△fur后雏鸭的增长情况。
图5.3日龄雏鸭免疫RA CH-1△fur后对雏鸭内脏器官病理的影响。与对照组相比，免疫RA CH-1△fur后对雏鸭内脏器官病理变化无明显影响。
保藏信息
分类名词：鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)CH-1△fur
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)
保藏单位地址：中国武汉大学
保藏日期：2019年8月20日
保藏号：CCTCC NO：M2019600；
分类名词：大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue pBAD24::SpecR
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)
保藏单位地址：中国武汉大学
保藏日期：2019年10月9日
保藏号：CCTCC NO：M2019746。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
1.RA CH-1 fur基因缺失弱毒株的构建方法。
1.1 RA CH-1 fur基因左右同源臂及Spec抗性基因的PCR扩增
根据fur基因左右同源臂设计两对引物(fur-L F/R，fur-R F/R)。
fur-L F:ATCACGAAACTCTTGGCAGCCTCAAC
fur-L R:CGTTATTAGTTATAGTTATTATAACATGTATTCACGAACCTTGATATTCCATCGAGTC
fur-R F:GGCTTAATTTTGCCCTTATTTTTAATTCAAAAATTATAATGAGGCTAATTATACTCGTAC
fur-R R:ATAGACCTCTATTTTATCTCCCGAG
利用RA CH-1基因组作为模板，分别以fur-L F/R和fur-R F/R为引物扩增fur基因左右同源臂片段fur-L和fur-R。PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min。电泳结果见图1。
根据文献(Gene 177(1-2),137-147(1996))报道的Spec抗性基因片段设计引物Spec F/R。
Spec F：GACTCGATGGAATATCAAGGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACG
Spec R：GTACGAGTATAATTAGCCTCATTATAATTTTTGAATTAAAAATAAGGGCAAAATTAAGCC
利用质粒pBAD24::SpecR作为模板，以Spec F/R为引物PCR扩增Spc序列。PCR条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃50s循环扩增30次，72℃延伸7min。电泳结果见图1。
1.2 fur-LSR融合片段的构建
用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR(fur-L+SpecR+fur-R)：回收的基因片段经Nanodrop 2000测定浓度，以2:1:2的比例混合作为PCR扩增的模板，融合PCR前5个循环不加入引物，后25个循环加入引物fur-L F和fur-R R。PCR反应条件：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃1min30s循环扩增30次，72℃延伸7min。电泳结果见图2。
1.3 RA CH-1 fur基因缺失株的构建
将RA CH-1株在GCB液体培养基培养至对数生长期并将菌液调整至OD600＝1；取出300μl菌悬液加入1μg的fur-LSR,37℃孵育1h后吸取100μL适当稀释后涂布于含Spec(80μg/mL)的GCB固体培养基上。培养24-48h后挑取生长的单克隆进行PCR鉴定。
PCR鉴定的步骤为：
以RA CH-1保守序列引物16s rRNA F/R
16s rRNA F：CTTCGGATACTTGAGAGCG
16s rRNA R：GCAGCACCTTGAAAATTGT
PCR扩增RA CH-1的16s rRNA片段(～600bp)，判定候选突变株是否为鸭疫里默氏杆菌；以Spec抗性基因的引物Spec F/R
Spec F：GACTCGATGGAATATCAAGGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACG
Spec R：GTACGAGTATAATTAGCCTCATTATAATTTTTGAATTAAAAATAAGGGCAAAATTAAGCC
扩增Spec抗性基因片段(～1200bp)，判断是否发生基因的替换；
以引物fur F/R：
fur F：CATGCCATGGAACATCAAGAGAAAG
fur R：GGACTAGTCCTTATGCTTTTTTATGACCGTAG
扩增目的基因以检测fur基因是否被缺失；电泳结果见图3。
2.检测RA CH-1△fur对雏鸭的致病力是否减弱
测定RA CH-1△fur缺失株的LD50值。具体步骤如下：将RA CH-1，RA CH-1△fur缺失株分别接种于TSB中，37℃180rpm振荡培养至对数生长期；收集菌体，用PBS洗3遍，测定菌液OD600值。然后准备菌液到以下4个浓度梯度：5×1010CFU/mL、5×109CFU/mL、5×108CFU/mL、5×107CFU/mL；将3日龄北京鸭分成4组，每组10只，每只经肌肉注射途径接种0.2mL菌液，攻毒剂量分别为1010CFU、109CFU、108CFU、107CFU。观察记录攻毒后一周内鸭子存活情况。通过Reed-Muench法计算半数致死量。
试验结果：RA CH-1△fur缺失株的LD50值大于1012CFU,RA CH-1的LD50值约为2×108CFU(见表1)；RA CH-1△fur缺失株对雏鸭的致病力下降了至少近10000倍。
表1.RA CH-1△fur缺失株LD50的测定结果
Figure BDA0002257208370000121
3.RA CH-1△fur弱毒株作为基因缺失候选疫苗的安全性评价
3.1 RA CH-1△fur免疫雏鸭后对雏鸭体重增殖的影响
将雏鸭分为三组：第1组，20只雏鸭免疫RA CH-1△fur；第2组，20只雏鸭注射PBS；第3组，20只雏鸭未做任何处理。供给充足的无抗饲料与饮水饲养，每隔3日测量每组鸭的体重，共测量免疫后60日鸭体重生长变化。结果表明，与对照组相比，用RA CH-1△fur免疫雏鸭，不会对雏鸭的正常生长造成明显影响(图4)。
3.2 RA CH-1△fur免疫雏鸭后对雏鸭体内器官病理损伤情况
将雏鸭分为3组：3只3日龄雏鸭免疫RA CH-1△fur；3只3日龄的雏鸭免疫PBS；3只3日龄雏鸭未做任何处理。每日供给充足的无抗饲料与饮水饲养至12日。采集心脏、肝脏、脾脏、脑制作组织切片样品。结果表明，与对照组相比，免疫RA CH-1△fur对雏鸭组织无明显损伤(图5)。
4.RA CH-1△fur弱毒株作为基因缺失候选疫苗的免疫保护效果评价
将三日龄雏鸭分为2组：第1组，用1×109CFU的RA CH-1△fur免疫3日龄雏鸭，并在免疫后12日攻毒100×LD50的RA CH-1野生株；第2组，用PBS注射3日龄雏鸭，并在免疫后12日攻毒100×LD50的RA CH-1野生株；计算攻毒后10天内鸭的发病率和死亡率评估该弱毒候选疫苗的保护率。结果表明，RA CH-1△fur免疫后对野生株RA CH-1的保护率为100％(表2)。
表2.RA CH-1△fur对雏鸭免疫保护力测定
Figure BDA0002257208370000122
以上结果表明该弱毒株在应用上安全可靠，具有较高的攻毒保护效果，可作为研发新型的基因缺失疫苗的候选菌株。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用
<130> 2019
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
atcacgaaac tcttggcagc ctcaac 26
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
cgttattagt tatagttatt ataacatgta ttcacgaacc ttgatattcc atcgagtc 58
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ggcttaattt tgcccttatt tttaattcaa aaattataat gaggctaatt atactcgtac 60
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
atagacctct attttatctc ccgag 25
<210> 5
<211> 803
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
gagttaggtt tcttcagtgc taatgtgata aaatttcacg agggcggttg gattacggta 60
gttcttgctg gttttatagg tatttgtatg tatgcttggt ataatggtag aatgataaaa 120
aacagattta taaaatttgt aaaactagag aattatattt ctacgattag agatttaaaa 180
ctagatgata gtgtgcctaa atatgctact aacctagcct tctttagccg tgctaaaagg 240
gaagatgaaa tagagtctaa aattatttat tctataatta gagctcagcc caaaagagct 300
gatcattatt ttatactgaa catcatcaat caagaaaacc cttatacttt taaatatgaa 360
atagatgagg tgttacctgg tactatttat aaaatcaatt tcttactagg ttttaaaata 420
gatagaagga taaatgatta tttccaagat gtattagagg atatgatgaa ttctggaatt 480
atctccgata agagtaacta tccatcgctt agaagccata atatacctcc agatatgaag 540
tatgtgatta tagataatgt ctgtataaat gataaacttt ttaccataaa ggaaaaaatt 600
acaatgaata tttataactt tgtaaaaaaa ttaggtagca acgattttaa agcctttggg 660
cttgccacac acaatgtggt cgtagaatct gcaccacttt tgtattcggc agcaggagat 720
caacgcatac aaatggataa ttttaaaaca agtaattaaa taattctaaa aataaaaaga 780
ctcgatggaa tatcaaggaa aag 803
<210> 6
<211> 662
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
atgaggctaa ttatactcgt actaatgtgc ttagggtttt ctgtatgggc acaacagaaa 60
gagaaaacct ctacaatgtc attggcaaaa gatgcgtatt ttaaaccaaa tcctaatacc 120
aaaggtactg ttacaggaaa tgaagaaaag ctgaaacaca ttcattcaga ttctttggtt 180
agacgccccg acttatacga aggtaatcct atttttattg gtaatgtaga gtttcagcat 240
caaggttctg ttttaaaggc agataaagtt attttttacc aaaatgataa ttttgtaaaa 300
gcaataggca atgtggtact taccactgcc gaaggcaacc gcattacttc ccaagaaatg 360
gaatatgatg gcaaaactca aagaggtatc gcaagaaaga atgtagtact tacagaccca 420
caacaaacca taaaaacaga aacgctctat tacgaccgtt tacccaatac ggcttatttt 480
aattcgggag gaactattta caatggcaga aataccattt ggacgcaggt agccacctat 540
aacatcaaca cacagacggt agatgtttca ggcaatgtaa gtattgacaa tgataaatat 600
cgtgtagaag gttctaaaat cattcaaaat caaaaaacca atgtagcaga gtttctaggt 660
gc 662
<210> 7
<211> 5292
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
gcgacggcga caagcaaaca tgctgtgcga cgctggcgat atcaaaattg ctgtctgcca 60
ggtgatcgct gatgtactga caagcctcgc gtacccgatt atccatcggt ggatggagcg 120
actcgttaat cgcttccatg cgccgcagta acaattgctc aagcagattt atcgccagca 180
gctccgaata gcgcccttcc ccttgcccgg cgttaatgat ttgcccaaac aggtcgctga 240
aatgcggctg gtgcgcttca tccgggcgaa agaaccccgt attggcaaat attgacggcc 300
agttaagcca ttcatgccag taggcgcgcg gacgaaagta aacccactgg tgataccatt 360
cgcgagcctc cggatgacga ccgtagtgat gaatctctcc tggcgggaac agcaaaatat 420
cacccggtcg gcaaacaaat tctcgtccct gatttttcac caccccctga ccgcgaatgg 480
tgagattgag aatataacct ttcattccca gcggtcggtc gataaaaaaa tcgagataac 540
cgttggcctc aatcggcgtt aaacccgcca ccagatgggc attaaacgag tatcccggca 600
gcaggggatc attttgcgct tcagccatac ttttcatact cccgccattc agagaagaaa 660
ccaattgtcc atattgcatc agacattgcc gtcactgcgt cttttactgg ctcttctcgc 720
taaccaaacc ggtaaccccg cttattaaaa gcattctgta acaaagcggg accaaagcca 780
tgacaaaaac gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 840
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 900
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagca 960
ggaggaattc accatggttc gtgaatacat gttataataa ctataactaa taacgtaacg 1020
tgactggcaa gagatatttt taaaacaatg aataggttta cacttacttt agttttatgg 1080
aaatgaaaga tcatatcata tataatctag aataaaatta actaaaataa ttattatcta 1140
gataaaaaat ttagaagcca atgaaatcta taaataaact aaattaagtt tatttaatta 1200
acaactatgg atataaaata ggtactaatc aaaatagtga ggaggatata tttgaataca 1260
tacgaacaaa ttaataaagt gaaaaaaata cttcggaaac atttaaaaaa taaccttatt 1320
ggtacttaca tgtttggatc aggagttgag agtggactaa aaccaaatag tgatcttgac 1380
tttttagtcg tcgtatctga accattgaca gatcaaagta aagaaatact tatacaaaaa 1440
attagaccta tttcaaaaaa aataggagat aaaagcaact tacgatatat tgaattaaca 1500
attattattc agcaagaaat ggtaccgtgg aatcatcctc ccaaacaaga atttatttat 1560
ggagaatggt tacaagagct ttatgaacaa ggatacattc ctcagaagga attaaattca 1620
gatttaacca taatgcttta ccaagcaaaa cgaaaaaata aaagaatata cggaaattat 1680
gacttagagg aattactacc tgatattcca ttttctgatg tgagaagagc cattatggat 1740
tcgtcagagg aattaataga taattatcag gatgatgaaa ccaactctat attaacttta 1800
tgccgtatga ttttaactat ggacacgggt aaaatcatac caaaagatat tgcgggaaat 1860
gcagtggctg aatcttctcc attagaacat agggagagaa ttttgttagc agttcgtagt 1920
tatcttggag agaatattga atggactaat gaaaatgtaa atttaactat aaactattta 1980
aataacagat taaaaaaatt ataaaaaaat tgaaaaaatg gtggaaacac ttttttcaat 2040
ttttttgttt tattatttaa tatttgggaa atattcattc taattggtaa gcgtcgacct 2100
gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat 2160
taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt 2220
ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt 2280
ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt 2340
cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga 2400
caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag 2460
gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc 2520
tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2580
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2640
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 2700
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 2760
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 2820
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt 2880
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 2940
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 3000
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 3060
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 3120
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 3180
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 3240
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 3300
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 3360
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 3420
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 3480
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttacgc 3540
gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 3600
acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 3660
cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 3720
tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc 3780
gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 3840
cttgttccaa acttgaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg 3900
gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 3960
gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 4020
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 4080
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 4140
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 4200
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 4260
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 4320
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 4380
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 4440
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 4500
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 4560
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 4620
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 4680
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 4740
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 4800
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 4860
aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 4920
accgcatagg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 4980
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 5040
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagcaaggag atggcgccca 5100
acagtccccc ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc 5160
cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg 5220
cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc tgctcatgtt 5280
tgacagctta tc 5292
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
gactcgatgg aatatcaagg ttcgtgaata catgttataa taactataac taataacg 58
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
gtacgagtat aattagcctc attataattt ttgaattaaa aataagggca aaattaagcc 60
<210> 10
<211> 1115
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
ttcgtgaata catgttataa taactataac taataacgta acgtgactgg caagagatat 60
ttttaaaaca atgaataggt ttacacttac tttagtttta tggaaatgaa agatcatatc 120
atatataatc tagaataaaa ttaactaaaa taattattat ctagataaaa aatttagaag 180
ccaatgaaat ctataaataa actaaattaa gtttatttaa ttaacaacta tggatataaa 240
ataggtacta atcaaaatag tgaggaggat atatttgaat acatacgaac aaattaataa 300
agtgaaaaaa atacttcgga aacatttaaa aaataacctt attggtactt acatgtttgg 360
atcaggagtt gagagtggac taaaaccaaa tagtgatctt gactttttag tcgtcgtatc 420
tgaaccattg acagatcaaa gtaaagaaat acttatacaa aaaattagac ctatttcaaa 480
aaaaatagga gataaaagca acttacgata tattgaatta acaattatta ttcagcaaga 540
aatggtaccg tggaatcatc ctcccaaaca agaatttatt tatggagaat ggttacaaga 600
gctttatgaa caaggataca ttcctcagaa ggaattaaat tcagatttaa ccataatgct 660
ttaccaagca aaacgaaaaa ataaaagaat atacggaaat tatgacttag aggaattact 720
acctgatatt ccattttctg atgtgagaag agccattatg gattcgtcag aggaattaat 780
agataattat caggatgatg aaaccaactc tatattaact ttatgccgta tgattttaac 840
tatggacacg ggtaaaatca taccaaaaga tattgcggga aatgcagtgg ctgaatcttc 900
tccattagaa catagggaga gaattttgtt agcagttcgt agttatcttg gagagaatat 960
tgaatggact aatgaaaatg taaatttaac tataaactat ttaaataaca gattaaaaaa 1020
attataaaaa aattgaaaaa atggtggaaa cacttttttc aatttttttg ttttattatt 1080
taatatttgg gaaatattca ttctaattgg taagc 1115
<210> 11
<211> 2580
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
gagttaggtt tcttcagtgc taatgtgata aaatttcacg agggcggttg gattacggta 60
gttcttgctg gttttatagg tatttgtatg tatgcttggt ataatggtag aatgataaaa 120
aacagattta taaaatttgt aaaactagag aattatattt ctacgattag agatttaaaa 180
ctagatgata gtgtgcctaa atatgctact aacctagcct tctttagccg tgctaaaagg 240
gaagatgaaa tagagtctaa aattatttat tctataatta gagctcagcc caaaagagct 300
gatcattatt ttatactgaa catcatcaat caagaaaacc cttatacttt taaatatgaa 360
atagatgagg tgttacctgg tactatttat aaaatcaatt tcttactagg ttttaaaata 420
gatagaagga taaatgatta tttccaagat gtattagagg atatgatgaa ttctggaatt 480
atctccgata agagtaacta tccatcgctt agaagccata atatacctcc agatatgaag 540
tatgtgatta tagataatgt ctgtataaat gataaacttt ttaccataaa ggaaaaaatt 600
acaatgaata tttataactt tgtaaaaaaa ttaggtagca acgattttaa agcctttggg 660
cttgccacac acaatgtggt cgtagaatct gcaccacttt tgtattcggc agcaggagat 720
caacgcatac aaatggataa ttttaaaaca agtaattaaa taattctaaa aataaaaaga 780
ctcgatggaa tatcaaggaa aagttcgtga atacatgtta taataactat aactaataac 840
gtaacgtgac tggcaagaga tatttttaaa acaatgaata ggtttacact tactttagtt 900
ttatggaaat gaaagatcat atcatatata atctagaata aaattaacta aaataattat 960
tatctagata aaaaatttag aagccaatga aatctataaa taaactaaat taagtttatt 1020
taattaacaa ctatggatat aaaataggta ctaatcaaaa tagtgaggag gatatatttg 1080
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Claims (9)

1.鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur，即鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)CH-1△fur，于2019年8月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019600。
2.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)RA CH-1 fur基因左右同源臂及Spec抗性基因的PCR扩增：以RA CH-1基因组作为模板，利用SEQ ID NO.1～4所示的两对引物fur-L F/R和fur-R F/R，PCR扩增fur基因左右同源臂片段fur-L和fur-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示的质粒pBAD24::SpecR作为模板，利用SEQ ID NO.8～9所示的引物对，PCR扩增SpecR序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(2)fur-LSR融合片段的构建：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR，即fur-L+SpecR+fur-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
(3)RA CH-1fur基因缺失株的构建：向RA CH-1株培养所得菌悬液中加入fur-LSR融合片段，孵育，稀释后涂布于含壮观霉素的GCB固体培养基上培养24h-48h后，即得RA CH-1fur基因缺失株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，RA CH-1fur基因左右同源臂的PCR扩增条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，壮观霉素抗性基因SpecR的PCR扩增条件为：98℃变性30s，经98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 50s循环扩增30次，72℃延伸7min。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR：回收的基因片段fur-L、SpecR、fur-R，经Nanodrop 2000测定浓度，以2:1:2的质量比混合作为PCR扩增的模板，融合PCR前5个循环不加入引物，后25个循环加入引物fur-L F和fur-R R。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，PCR反应条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃ 30s，72℃ 1min30s循环扩增30次，72℃延伸7min。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将RA CH-1株在GCB液体培养基培养至对数生长期并将菌液调整至OD600＝1；取出300μL菌悬液加入1μg的fur-LSR，37℃孵育1小时后吸取100μL，稀释104～106倍后涂布于含80μg/mL壮观霉素的GCB固体培养基上，培养24～48小时。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，培养后挑取生长的单克隆进行PCR鉴定，具体方法是：
以RA CH-1保守序列引物16s rRNA F/R
16s rRNA F：CTTCGGATACTTGAGAGCG，如SEQ ID NO.12所示；
16s rRNA R：GCAGCACCTTGAAAATTGT，如SEQ ID NO.13所示；
PCR扩增RA CH-1的16s rRNA片段，判定候选突变株是否为鸭疫里默氏杆菌；
以Spec抗性基因的引物Spec F/R
Spec F：GACTCGATGGAATATCAAGGTTCGTGAATACATGTTATAA
TAACTATAACTAATAACG，如SEQ ID NO.8所示；
Spec R：GTACGAGTATAATTAGCCTCATTATAATTTTTGAATTAAAAA
TAAGGGCAAAATTAAGCC，如SEQ ID NO.9所示；
扩增Spec抗性基因片段，判断是否发生基因的替换；
以引物fur F/R：
fur F：CATGCCATGGAACATCAAGAGAAAG，如SEQ ID NO.14所示；
fur R：GGACTAGTCCTTATGCTTTTTTATGACCGTAG，如SEQ ID NO.15所示；
扩增目的基因以检测fur基因是否被缺失。
9.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur在制备鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗中的应用。
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